星天牛對(duì)青皮垂柳揮發(fā)物的電生理及行為反應(yīng)

吳佳昊, 吳利平, 鄭凱文, 顧宇彤, 樊建庭,*

(1. 浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 生物農(nóng)藥高效制備技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 杭州 311300; 2. 浙江省建德市林業(yè)局, 杭州 311600)

星天牛Anoplophorachinensis屬鞘翅目(Coleoptera)天牛科(Cerambycidae)溝脛天牛亞科(Lamiinae)星天牛屬Anoplophora(陳世驤等, 1959; 蕭剛?cè)? 1992; 楊忠岐, 2018)。星天牛為多食性昆蟲(Haacketal., 2010; Keena and Sánchez, 2018)，寄主眾多，且分布廣泛(朱寧等, 2017)，現(xiàn)已嚴(yán)重威脅黃河三角洲天然柳林和南方柑橘區(qū)(毛景學(xué), 2020; 張樂樂等, 2021)。植食性昆蟲的取食和產(chǎn)卵行為受寄主植物釋放的揮發(fā)性氣味所影響(Morewoodetal., 2003; 姜斯琪, 2019; 王靜靜等, 2021)。實(shí)驗(yàn)證明，松針揮發(fā)物中α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯以及莰烯對(duì)天?？评ハx具有引誘作用(Chénier and Philogène, 1989)。王婷(2005)通過Y型嗅覺儀、EAD等實(shí)驗(yàn)證明側(cè)柏Platycladusorientalis揮發(fā)物中α-側(cè)柏烯、α-蒎烯、β-石竹烯和橙花叔醇對(duì)雙條杉天牛Semanotusbifasciatus成蟲有一定吸引作用。Nehme等(2010)研究發(fā)現(xiàn)，3-蒈烯能引起光肩星天牛Anoplophoraglabripennis的嗅覺反應(yīng)，而3-蒈烯是青皮垂柳揮發(fā)物的成分之一，且在野外誘捕試驗(yàn)中取得驗(yàn)證。Li等(2003)利用動(dòng)態(tài)頂空吸附法抽提了復(fù)葉槭Acernegundo揮發(fā)物，通過野外誘捕試驗(yàn)證明順-3-己烯-1-醇、正丁醇、正戊醇和戊醇對(duì)光肩星天牛成蟲有很強(qiáng)的的吸引作用。研究發(fā)現(xiàn)，楝樹Meliaazedarach揮發(fā)物中的β-蒎烯和左旋-α-蒎烯等物質(zhì)能引起星天牛明顯觸角電位反應(yīng)(劉佳敏, 2013)。錢明惠等(2018)研究星天牛寄主枝葉浸提物發(fā)現(xiàn)，壬醛、α-蒎烯和檸檬烯等8種寄主植物組分均能引起星天牛不同程度的觸角電位反應(yīng)，其中壬醛的GC-EAD反應(yīng)重復(fù)性最好。

青皮垂柳是寧波地區(qū)海防林的主要樹種之一，受星天牛蟲害較為嚴(yán)重。林間蟲口密度調(diào)查發(fā)現(xiàn)，往年被危害過的青皮垂柳比健康的青皮垂柳更容易受星天牛危害，因此我們推測(cè)可能是由于受害植株產(chǎn)生的氣味物質(zhì)更加吸引星天牛所導(dǎo)致。研究發(fā)現(xiàn)，蟲害誘導(dǎo)產(chǎn)生植物揮發(fā)物在植食性昆蟲尋找寄主的行為中發(fā)揮著重要作用(Turlings and Erb, 2018)。例如，松墨天牛Monochamusalternatus取食馬尾松Pinusmassoniana枝干導(dǎo)致萜烯類組分發(fā)生變化，是影響松墨天牛取食和產(chǎn)卵的重要信號(hào)(寧眺等, 2006; 胡琴等, 2018)。美國(guó)南方松梢斑螟Dioryctriaamatella明顯趨向于在被東南球果銹病菌Cronartiumstrobilinum為害的2年生球果上產(chǎn)卵，寄主揮發(fā)物中發(fā)揮吸引作用的成分有α-蒎烯、香葉烯和檸檬烯(Sunetal., 2013)。復(fù)葉槭受到機(jī)械損傷或天牛咬食損傷后對(duì)光肩星天牛產(chǎn)生了驅(qū)避作用，而健康復(fù)葉槭所釋放的揮發(fā)物則具有明顯的吸引作用(李繼泉等, 2003)。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)星天牛的防治仍停留在物理防治和化學(xué)防治等常規(guī)手段，且效果甚微，對(duì)星天?；瘜W(xué)生態(tài)防治的研究較少。隨著綠色、環(huán)保理念的倡導(dǎo)，更高效、無污染的防控技術(shù)受人們青睞，植物源引誘劑的開發(fā)成為星天牛防治工作的當(dāng)務(wù)之急。本研究以星天牛為研究對(duì)象，期望通過分析星天牛寄主植物青皮垂柳產(chǎn)生的揮發(fā)物成分，尋找對(duì)其有引誘作用的關(guān)鍵物質(zhì)，闡明其對(duì)不同生理狀態(tài)下寄主選擇機(jī)制，從而尋求誘捕效果最佳的引誘劑成分、濃度及配比。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

6月初，從浙江省慈溪市海防林(30°10′N, 121°14′E, 平均海拔2.2 m)采集星天牛成蟲，并帶回實(shí)驗(yàn)室置于養(yǎng)蟲籠中飼養(yǎng)。海防林為青皮垂柳Salixohsidare、夾竹桃Neriumindicum、海濱木槿Hibiscushamabo、木麻黃Casuarinaequisetifolia、苦楝Meliaazedarach和白蠟Fraxinuschinensis等樹種組成的混交林帶，林地地勢(shì)較為平坦，其中青皮垂柳受到星天牛危害較為嚴(yán)重。室內(nèi)飼養(yǎng)條件：溫度30±3℃，相對(duì)濕度65%±10%，光周期14L∶10D，以栽種在花盆中的青皮垂柳作為食物進(jìn)行飼喂。室內(nèi)飼養(yǎng)24 h后將養(yǎng)蟲籠放置在室外陰涼且通風(fēng)的自然環(huán)境中，并在頂部覆蓋遮雨布，適應(yīng)3 d后，作為供試蟲源。實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇大小相近、行為活動(dòng)正常的個(gè)體。

1.2 供試寄主

2年生青皮垂柳樹苗，胸徑4 cm，高1.5 m，栽種在花盆中。被星天牛取食危害的青皮垂柳(以下簡(jiǎn)稱“蟲害青皮垂柳”)取食時(shí)間為24 h，即早8:00時(shí)至次日8:00時(shí)。

1.3 寄主揮發(fā)物的收集與GC-MS分析

采用動(dòng)態(tài)頂空吸附法收集揮發(fā)物。將微波爐專用袋(oven bags, 25 cm×38 cm, 美國(guó)Reynolds公司)套住蟲害青皮垂柳枝條或健康青皮垂柳枝條，用鐵絲在封口處扎緊，并擠壓袋中空氣，做氣密性檢查。開始收集前先排盡袋內(nèi)空氣，然后通入經(jīng)過活性炭管(內(nèi)填100 mg 20～40目活性炭吸附劑的200 mm×5 mm ID的玻璃管)過濾的干燥空氣，待袋內(nèi)充滿空氣為止。吸附管(內(nèi)填200 mg 60～80目Tenax吸附劑的150 mm×5 mmID的不銹鋼管)經(jīng)活化儀(TDS-3410型活化儀, 北京華儀三譜儀器有限責(zé)任公司)活化，條件為活化溫度300℃和流速100 mL/min，活化3 h后冷卻使用?；钚蕴抗芎臀焦芊謩e與QC-1S大氣采樣儀(北京市勞動(dòng)保護(hù)科學(xué)研究院)的進(jìn)氣口和出氣口連接，其余用硅膠管相連。設(shè)置空白對(duì)照，避免袋中或空氣中氣體成分對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響。大氣采樣儀的流速設(shè)定為0.5 L/min。采集時(shí)間為6 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。各個(gè)揮發(fā)物樣品用含有以正十二烷(150 μg/L)為內(nèi)標(biāo)的色譜純正己烷(3×500 μL)溶劑洗脫，收集到的洗脫液通過氮吹的方式進(jìn)行濃縮，最終得濃縮液200 μL，洗脫樣品保存在-20℃冰箱待用。

通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 7890A-5975 C)鑒定揮發(fā)物。載氣：高純度氦氣，流速1 mL/min，色譜柱為HP-5MS，30 m (long) ×0.25 mm (ID) ×0.25 μm (film)。每次進(jìn)樣2 μL，采用不分流進(jìn)樣，升溫程序：初始溫度為50℃，恒溫4 min，以10℃/min 的速率升溫到280℃，保持7 min，共運(yùn)行37 min。溶劑延遲3 min。離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃。檢測(cè)器溫度是325℃，前進(jìn)樣口溫度是250℃，電子轟擊電壓70 eV，質(zhì)量掃描范圍30～500。樣品中化合物成分的鑒定是通過Wiley7n.l標(biāo)準(zhǔn)譜庫及標(biāo)準(zhǔn)化合物的質(zhì)譜圖，對(duì)提取物成分由計(jì)算機(jī)檢索定性，定量分析通過內(nèi)標(biāo)正十二烷的峰面積計(jì)算。

1.4 觸角電位實(shí)驗(yàn)

通過EAG昆蟲觸角電位測(cè)量系統(tǒng)(Syntech-IDAC 4)檢驗(yàn)昆蟲對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物的嗅覺反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)前配制1，10和100 mg/mL 3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)物石蠟油溶液(表1)。實(shí)驗(yàn)中所用的觸角均采用活性較好的星天牛成蟲的觸角，測(cè)定前用刀片將星天牛成蟲的整根觸角由基部快速切下，觸角末梢切除少許。將觸角橫搭在事先沾有導(dǎo)電膠的叉狀電極的兩端上，觸角兩端浸沒在導(dǎo)電膠內(nèi)。取10 μL待測(cè)樣品，均勻地滴在40 mm×5 mm濾紙條上，待溶劑揮發(fā)15 s后放入玻璃巴斯德管中，插入操作臺(tái)的鐵管孔里(楊陳等, 2021)。連續(xù)氣體的流量為600 mL/min，待基線平穩(wěn)后，開始進(jìn)行測(cè)定，脈沖刺激氣體流量為120 mL/min，每種揮發(fā)性物質(zhì)刺激時(shí)間為0.5 s，為了消除觸角連續(xù)刺激帶來的系統(tǒng)誤差，兩次刺激間隔時(shí)間約60 s。相同濃度不同揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)試順序隨機(jī)選定，同種物質(zhì)測(cè)試順序?yàn)橛傻蜐舛鹊礁邼舛?，以石蠟油作為?duì)照；將每一種揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定值的平均值除以前后兩次對(duì)照測(cè)定值的平均值即得EAG反應(yīng)相對(duì)值；每根觸角只測(cè)試一個(gè)濃度下的5種化合物以及溶劑對(duì)照為1個(gè)重復(fù)，雌雄成蟲各重復(fù)10次。

表1 本研究所用化合物純度及生產(chǎn)廠家Table 1 Purity and manufacturer of compounds used in this study

1.5 Y型嗅覺儀實(shí)驗(yàn)

Y型嗅覺儀規(guī)格：主臂45 cm，側(cè)臂25 cm，兩側(cè)臂夾角約為70°，球形管直徑20 cm；真空泵規(guī)格：130 W，48 dB，最高20 L/min；氣流計(jì)規(guī)格：100～1 000 mL/min。

使用表1中的標(biāo)準(zhǔn)品，用1 mL石蠟油作溶劑將各化合物配制成濃度為1 mg/mL和10 mg/mL的溶液，以石蠟油作為對(duì)照，測(cè)定星天牛成蟲對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化合物的行為選擇。Y型嗅覺儀生物測(cè)定裝置參考張萌萌等(2020)。測(cè)試時(shí)，用移液槍吸取10 μL揮發(fā)物或石蠟油滴在1 cm2的定性濾紙上，并置于味源瓶中。通過聚四氟乙烯軟管將活性炭空氣過濾裝置、真空泵、氣流計(jì)、蒸餾水加濕瓶以及Y型管相連，空氣流速控制在500 mL/min。每10頭星天牛為一組，重復(fù)4次。每次只放1頭星天牛成蟲進(jìn)行行為選擇，觀察時(shí)間為15 min，將進(jìn)入選擇臂且超過選擇臂1/2以上并停留超過30 s的記為有選擇，否則記為無選擇。每測(cè)試一頭試蟲后將球形管互換，空吹20 min，實(shí)驗(yàn)組之間，需清洗實(shí)驗(yàn)儀器。

1.6 大籠行為實(shí)驗(yàn)

大籠為正五邊形，材質(zhì)為尼龍，邊長(zhǎng)2 m，高1 m。實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)(溫度25～28℃, 光周期14L∶10D)進(jìn)行，期間無干擾光源。配制5種不同配方處理(表2)， 將供試化合物分別滴加在纖維片 (350 mm×20 mm×2 mm)上，然后通過低密度聚乙烯袋(100 mm×80 mm×0.08 mm)進(jìn)行釋放。實(shí)驗(yàn)前2 h，將10頭星天牛(雌雄各5頭)放在大籠中做適應(yīng)性處理，實(shí)驗(yàn)時(shí)取5組處理放置并固定在大籠底面的5個(gè)角落，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將星天牛集中在大籠中心，使星天牛與每一組處理的距離相等， 約1.5 m。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，即按順時(shí)針調(diào)換5組處理位置，調(diào)換位置的期間用酒精噴壺對(duì)大籠內(nèi)進(jìn)行氣味進(jìn)行消除，靜置15 min，待酒精味完全散去后進(jìn)行下一組實(shí)驗(yàn)；觀察時(shí)間為10 min，星天牛在處理的0.5 m范圍內(nèi)著落視為對(duì)處理的行為選擇。

表2 星天牛大籠行為實(shí)驗(yàn)和林間誘捕試驗(yàn)所用化合物Table 2 Compounds employed in the large cage behavior experiment and field trapping test for Anoplophora chinensis

1.7 林間誘捕試驗(yàn)

林間誘捕試驗(yàn)在浙江省慈溪市沿海防護(hù)林(30°10′N, 121°14′E)進(jìn)行。將供試化合物分別滴加到過濾纖維載體(20 mm×10 mm)上，然后通過聚乙烯緩釋袋(10 cm×5 cm×120 um)進(jìn)行釋放，設(shè)置5組處理(表2)。誘捕器采用樣地內(nèi)循環(huán)法，即樣地內(nèi)設(shè)置各種處理的誘捕器，誘捕器間隔20 m，每次調(diào)查時(shí)更換不同處理的誘捕器位置，以減少不同地理位置對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。設(shè)置5個(gè)重復(fù)，樣地間隔50 m?？瞻讓?duì)照不懸掛任何化合物。將黑色十字交叉型天牛誘捕器(BF-8型, 杭州費(fèi)洛蒙生物科技有限公司)懸掛于青皮垂柳林間通風(fēng)良好的道路口，其下端距離地面1.5 m，緩釋袋懸掛于誘捕器中間的凹槽處。該試驗(yàn)于2021年7月7日開始，8月11日結(jié)束。每星期調(diào)查1次，詳細(xì)記錄每個(gè)誘捕器誘捕到的天牛種類、雌雄和數(shù)量等信息。

1.8 數(shù)據(jù)分析

Y型嗅覺儀實(shí)驗(yàn)中比較星天牛對(duì)不同濃度的化合物行為反應(yīng)分析使用卡方檢驗(yàn)法(P=0.05)，其中選擇率計(jì)算公式如下：選擇率=(選擇實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M的總蟲數(shù)/氣味臂內(nèi)作出選擇的總蟲數(shù))×100%。EAG反應(yīng)相對(duì)值計(jì)算公式如下：V=2R/(C1+C2)，V為觸角電位反應(yīng)相對(duì)值，R為刺激氣味化合物的觸角電位反應(yīng)平均值，C1和C2分別為刺激前后2個(gè)溶劑對(duì)照觸角電位反應(yīng)值(李可等, 2021)。觸角電位相對(duì)反應(yīng)值在單變量?jī)山M和多組之間的差異分別采用卡方檢驗(yàn)和LSD多重比較。利用單因素方差分析(one-way ANOVA) 對(duì)星天牛成蟲行為反應(yīng)規(guī)律實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、林間誘捕試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。上述統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 20.0軟件分析，作圖采用Origin軟件。

2 結(jié)果

2.1 兩種生理狀態(tài)下青皮垂柳枝條揮發(fā)性化合物含量

GC-MS分析結(jié)果(表3)顯示，不同生理狀態(tài)青皮垂柳枝條揮發(fā)物的主要成分有5種，烯烴類物質(zhì)居多，且多種成分含量存在顯著性差異(P<0.05)，其中蟲害青皮垂柳枝條中含有β-蒎烯和β-羅勒烯，而健康青皮垂柳枝條中未檢測(cè)到這兩種化合物，另外蟲害青皮垂柳枝條中的樟腦含量顯著高于健康青皮垂柳枝條中的(P<0.05)；3-蒈烯在兩種寄主揮發(fā)物中含量差異不顯著，而健康青皮垂柳枝條中的α-蒎烯顯著高于蟲害青皮垂柳枝條中的(P<0.05)。α-蒎烯、3-蒈烯和β-羅勒烯是蟲害青皮垂柳枝條揮發(fā)物中含量比較高的3種物質(zhì)，而α-蒎烯和3-蒈烯是健康青皮垂柳枝條揮發(fā)物中含量比較高的2種物質(zhì)。

表3 兩種生理狀態(tài)下青皮垂柳枝條中揮發(fā)性化合物的含量Table 3 Contents of the volatile compounds in Salix ohsidare twigs in two physiological states

2.2 星天牛雌雄成蟲對(duì)揮發(fā)性化合物的電生理反應(yīng)

圖1顯示，在1 mg/mL濃度下，星天牛成蟲對(duì)α-蒎烯、3-蒈烯和β-羅勒烯的EAG反應(yīng)最大，EAG反應(yīng)相對(duì)值顯著高于對(duì)β-蒎烯和樟腦的(P<0.05)。在10 mg/mL濃度下，星天牛雌成蟲對(duì)β-羅勒烯產(chǎn)生最大的EAG反應(yīng)相對(duì)值(4.249)，顯著高于對(duì)α-蒎烯和3-蒈烯，而對(duì)α-蒎烯與3-蒈烯的EAG反應(yīng)相對(duì)值之間沒有顯著差異(P>0.05)；星天牛雄成蟲對(duì)α-蒎烯和β-羅勒烯產(chǎn)生最大的EAG反應(yīng)，EAG反應(yīng)相對(duì)值顯著高于對(duì)其他化合物的(P<0.05)；星天牛雌雄成蟲對(duì)β-蒎烯和樟腦的EAG反應(yīng)相對(duì)值皆最低，且兩者之間沒有顯著性差異(P>0.05)。在100 mg/mL濃度下，同樣是星天牛雌成蟲對(duì)β-羅勒烯的EAG反應(yīng)相對(duì)值最大(5.476)，顯著高于對(duì)其他4種化合物的(P<0.05)；而星天牛雄成蟲對(duì)α-蒎烯的EAG反應(yīng)相對(duì)值最大，其次是對(duì)β-羅勒烯。綜上所述，α-蒎烯、3-蒈烯和β-羅勒烯3種化合物引起了星天牛成蟲最強(qiáng)的觸角電位反應(yīng)，且星天牛成蟲對(duì)化合物的EAG反應(yīng)相對(duì)值隨著化合物濃度的升高而逐漸增大。

圖1 星天牛雌雄成蟲對(duì)3種濃度的5種標(biāo)準(zhǔn)化合物的EAG反應(yīng)Fig. 1 EAG responses of female and male adults of Anoplophora chinensis to five standard compounds at three different concentrationsA: 1 mg/mL; B: 10 mg/mL; C: 100 mg/mL. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同小寫和大寫字母分別表示雄成蟲或雌成蟲對(duì)不同揮發(fā)性物質(zhì)間EAG反應(yīng)相對(duì)值的差異顯著(P<0.05, LSD多重比較法)，星號(hào)和雙星號(hào)分別表示雌雄成蟲對(duì)同種化合物的EAG反應(yīng)值相對(duì)值差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)(配對(duì)T檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE. Different small letters and capital letters above bars indicate significant difference in the relative EAG response value of male and female adults, respectively, to different volatile compounds (P<0.05, LSD test), and the asterisk and double asterisks indicate significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), respectively, in the relative EAG response value between female and male adults to the same compound (paired T-test).

分析圖中數(shù)據(jù)，在10和100 mg/mL濃度下，雌成蟲和雄成蟲之間在對(duì)α-蒎烯和β-羅勒烯的EAG反應(yīng)相對(duì)值存在顯著差異，雄成蟲對(duì)α-蒎烯的EAG反應(yīng)相對(duì)值顯著高于雌成蟲的(P<0.05)，而雌成蟲對(duì)β-羅勒烯的EAG反應(yīng)相對(duì)值極顯著高于雄成蟲的(P<0.01)。

2.3 星天牛雌雄成蟲對(duì)揮發(fā)性化合物的趨性行為反應(yīng)

根據(jù)EAG實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出引起星天牛成蟲產(chǎn)生強(qiáng)烈反應(yīng)的3種揮發(fā)性化合物α-蒎烯、3-蒈烯和β-羅勒烯，通過Y型嗅覺儀，分別測(cè)試了在1與10 mg/mL濃度下星天牛雌雄蟲對(duì)這3種揮發(fā)性化合物的選擇性，對(duì)照為正己烷。結(jié)果顯示，濃度為1 mg/mL α-蒎烯吸引星天牛雄成蟲數(shù)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而10 mg/mL α-蒎烯吸引星天牛雌雄蟲數(shù)量與對(duì)照組相比差異均不顯著(P>0.05)；濃度為1和10 mg/mL的3-蒈烯吸引星天牛雄成蟲數(shù)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而3-蒈烯吸引的星天牛雌成蟲數(shù)量與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)；此外，1 mg/mL β-羅勒烯吸引的星天牛雌雄成蟲數(shù)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而10 mg/mL β-羅勒烯吸引的星天牛雌雄蟲數(shù)量與對(duì)照組差異均不顯著(P>0.05)(圖2)。

圖2 星天牛雄(A)雌(B)成蟲對(duì)不同濃度3種標(biāo)準(zhǔn)化合物的行為反應(yīng)Fig. 2 Behavioral responses of male (A) and female (B) adults of Anoplophora chinensis to three standard compounds at different concentrations星號(hào)和ns分別表示處理和對(duì)照(石蠟油)間差異顯著 (P<0.05)和不顯著(P>0.05)(卡方檢驗(yàn))。Asterisk and ns indicate significant difference (P<0.05) and no significant difference (P>0.05), respectively, between the treatment and the control (paraffin oil) (Chi-square test).

2.4 大籠行為實(shí)驗(yàn)中星天牛成蟲對(duì)揮發(fā)性化合物的行為反應(yīng)

大籠行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在3種單一化合物中，α-蒎烯和β-羅勒烯吸引星天牛成蟲數(shù)量最多，且顯著高于3-蒈烯吸引的成蟲數(shù)(P<0.05)；三組分配方(即蟲害配方D)吸引的星天牛成蟲數(shù)量與α-蒎烯和β-羅勒烯吸引的成蟲數(shù)量差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于3-蒈烯吸引的成蟲數(shù)量(P<0.05)；雙組分配方(即健康配方H)吸引的星天牛成蟲數(shù)量顯著低于α-蒎烯吸引的成蟲數(shù)量(P<0.05)，但顯著高于3-蒈烯吸引的成蟲數(shù)量(P<0.05)(圖3)。結(jié)果說明，健康青皮垂柳和蟲害青皮垂柳枝條共有的揮發(fā)性化合物α-蒎烯和蟲害青皮垂柳枝條特有的揮發(fā)性化合物β-羅勒烯是對(duì)星天牛成蟲具有吸引作用的兩種重要寄主揮發(fā)性化合物。健康配方H對(duì)星天牛成蟲的吸引作用低于α-蒎烯，表明3-蒈烯可能對(duì)α-蒎烯對(duì)星天牛成蟲的吸引效果產(chǎn)生抑制作用。

圖3 大籠行為實(shí)驗(yàn)中星天牛雌雄成蟲對(duì)單一揮發(fā)性化合物及其雙組分和三組分配方的行為反應(yīng)Fig. 3 Behavioral responses of female and male adults ofAnoplophora chinensis to single volatile compound and the two-component and three-component formulae of volatile compounds in big cage behavior experiment蟲害配方D(Insect-infested formula D): 三組分配方, α-蒎烯+3-蒈烯+β-羅勒烯(42∶30∶103) Three-component formula, α-pinene+3-carene+β-ocimene(42∶30∶103)(1 mL); 健康配方H (Healthy formula H)： 雙組分配方, α-蒎烯+3-蒈烯(105∶38) Two-component formula, α-pinene+3-carene (105∶38)(1 mL). 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同小寫字母表示不同配方之間吸引星天牛成蟲數(shù)量差異顯著(P<0.05, 單因素方差分析LSD多重比較)。圖4同。Data in the figure are mean±SE. Different lowercase letters above bars indicate significant difference in the number of A. chinensis adults attracted by different formulae (P<0.05, one-way ANOVA, LSD test). The same for Fig. 4.

2.5 揮發(fā)性化合物對(duì)星天牛成蟲的林間誘捕效果

林間誘捕試驗(yàn)結(jié)果顯示，在3種單一化合物中，α-蒎烯對(duì)星天牛成蟲的誘捕效果最好，平均誘捕量為5.0頭，顯著高于β-羅勒烯誘捕的成蟲數(shù)(P<0.05)，而3-蒈烯和空白對(duì)照都沒有誘捕到星天牛成蟲。三組分配方(蟲害配方D)對(duì)星天牛成蟲的平均誘捕量為4.5頭，顯著高于雙組分配方(健康配方H)誘捕的成蟲數(shù)(P<0.05)，但是與α-蒎烯誘捕的成蟲數(shù)差異不顯著(P>0.05)；健康配方H對(duì)星天牛成蟲的平均誘捕量為1.0頭，顯著低于α-蒎烯誘捕的成蟲數(shù)(P<0.05)，而且單一的3-蒈烯沒有誘捕到星天牛成蟲，進(jìn)一步驗(yàn)證了3-蒈烯對(duì)α-蒎烯對(duì)星天牛成蟲的誘捕效果存在一定的抑制性；蟲害配方D沒有表現(xiàn)出比α-蒎烯更好的誘捕效果(P>0.05)，我們推測(cè)有可能是配比不合理，或者受3-蒈烯的抑制效果影響(圖4)。

圖4 單一揮發(fā)性化合物及其雙組分和三組分配方對(duì)星天牛成蟲的林間誘捕效果Fig. 4 Field trapping efficacies of single volatile compounds and the two-component and three-component formulae of volatile compounds on Anoplophora chinensis adultsCK: 空白對(duì)照Blank control.

3 結(jié)論與討論

青皮垂柳揮發(fā)物成分主要為萜烯類化合物，其中含量最高的成分為α-蒎烯、3-蒈烯和樟腦等占揮發(fā)物的50%(朱寧等, 2017)。隨著樹齡的增加，植物揮發(fā)物的濃度會(huì)有所變化，但揮發(fā)物的種類大致不變(顏仁梁等, 2008)。植物受到植食性昆蟲危害后，會(huì)釋放出有別于健康時(shí)期的植物揮發(fā)性氣體(杜永均和嚴(yán)福順, 1994; Huetal., 2020)。本研究中，兩種生理狀態(tài)下的青皮垂柳產(chǎn)生揮發(fā)性成分有顯著差異(表3)，其中，β-蒎烯和β-羅勒烯是蟲害青皮垂柳特有的揮發(fā)物成分，而α-蒎烯在健康青皮垂柳中含量顯著高于蟲害青皮垂柳(P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，梨小食心蟲Grapholitamolesta對(duì)蟲害損傷和機(jī)械損傷的寄主植物的選擇產(chǎn)卵率高于完好寄主植物，分析次生揮發(fā)物得出結(jié)論，苯甲醛是梨小食心蟲產(chǎn)生偏好性的化合物(王怡, 2019)。王海濤(2016)研究發(fā)現(xiàn)，次生單萜類化合物β-蒎烯、β-羅勒烯和β-月桂烯對(duì)松褐天牛有引誘作用。

植物產(chǎn)生不同的揮發(fā)性氣體會(huì)對(duì)昆蟲產(chǎn)生引誘或趨避的作用(Pare and Tumlinson, 1999; Allisonetal., 2004; 張凡等, 2020)。研究發(fā)現(xiàn)，褐飛虱Nilaparvatalugens為害誘導(dǎo)水稻揮發(fā)物產(chǎn)生的α-蒎烯對(duì)褐飛虱有引誘作用(蘇雙麗, 2020)。刑亞等(2017)在風(fēng)洞生測(cè)中發(fā)現(xiàn)，寄主植物揮發(fā)物苯甲酸、香柏油對(duì)楊干象Cryptorrhynchuslapathi具有明顯驅(qū)避作用。本研究中EAG實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，星天牛成蟲對(duì)α-蒎烯、3-蒈烯和β-羅勒烯3種青皮垂柳枝條揮發(fā)性化合物的EAG反應(yīng)相對(duì)值最高，而且EAG反應(yīng)相對(duì)值隨著揮發(fā)性化合物濃度升高而逐漸增大(圖1)。Y型嗅覺儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，α-蒎烯、3-蒈烯和β-羅勒烯對(duì)星天牛成蟲有顯著吸引作用(圖2)。這幾種物質(zhì)對(duì)天牛的吸引作用已有報(bào)道。例如，α-蒎烯對(duì)松墨天牛(樊建庭等, 2014)、雄黃斑星天牛AnoplophoranobilisGanglbauer(李廣偉等, 2017)、短角幽天牛Spondylisbuprestoides、松幽天牛Asemumstriatum(Sweeneyetal., 2004)均存在引誘作用。馬艷等(2019)研究發(fā)現(xiàn)，蟲害山核桃產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物α-蒎烯和β-羅勒烯引起星天牛產(chǎn)生顯著的觸角電位反應(yīng)。

本研究中，α-蒎烯、β-羅勒烯和3-蒈烯是電生理實(shí)驗(yàn)中引起星天牛成蟲反應(yīng)最大的3種化合物，結(jié)合Y型嗅覺儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，在1 mg/mL的濃度下，星天牛成蟲對(duì)3種化合物表現(xiàn)出較強(qiáng)的趨性，因此在大籠行為實(shí)驗(yàn)和林間誘捕試驗(yàn)中，我們選擇該濃度做進(jìn)一步的試驗(yàn)，結(jié)果顯示蟲害和健康青皮垂柳枝條揮發(fā)物中共有的α-蒎烯和蟲害青皮垂柳枝條揮發(fā)物中特有的β-羅勒烯對(duì)星天牛成蟲具有引誘作用(圖3和4)。我們推測(cè)，蟲害植物揮發(fā)物中特有的β-羅勒烯是造成蟲害青皮垂柳比健康青皮垂柳更容易受到星天牛危害的原因之一。3-蒈烯在林間誘捕試驗(yàn)中沒有誘捕到星天牛成蟲，而且大籠行為實(shí)驗(yàn)和林間誘捕試驗(yàn)結(jié)果都顯示，3-蒈烯與α-蒎烯配比的健康配方H誘捕星天牛成蟲的效果顯著低于α-蒎烯(圖4)。Zhuge等(2010)報(bào)道的引起云斑天牛Batocerahorsfieldi顯著EAG反應(yīng)的3-蒈烯等化合物在林間并沒有誘捕到云斑天牛。本研究中，分析電生理和室內(nèi)行為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，3-蒈烯對(duì)星天牛成蟲有一定的吸引作用(圖2和3)，而在林間誘捕試驗(yàn)中，3-蒈烯沒有誘捕到星天牛成蟲。我們推測(cè)，室內(nèi)實(shí)驗(yàn)中空間等條件都比較有限，而林間試驗(yàn)的影響因素有很多，比如空間距離、其他寄主氣味源等因素都可能對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)生一定的影響。

在復(fù)雜的自然環(huán)境中，各種揮發(fā)性化合物都不是單獨(dú)存在的，昆蟲定位寄主植物不僅依靠單個(gè)物質(zhì)，若將不同化合物按一定的比例混合，可能會(huì)增強(qiáng)它們的引誘力(Switzeretal., 2009)。本研究中，蟲害配方D和健康配方H對(duì)星天牛成蟲都沒有表現(xiàn)出比α-蒎烯等單個(gè)化合物更強(qiáng)的吸引作用(圖3和4)。分析原因可能與關(guān)鍵化合物的劑量和配比有關(guān)，此外和3-蒈烯的抑制作用也存在一定關(guān)系。

植物源揮發(fā)物對(duì)昆蟲的行為起重要調(diào)控作用。人們利用這一特性廣泛開展通過調(diào)控昆蟲行為來控制害蟲的研究，根據(jù)現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知蟲害和健康青皮垂柳枝條揮發(fā)物中共有的α-蒎烯和蟲害青皮垂柳枝條揮發(fā)物中特有的β-羅勒烯對(duì)星天牛具有引誘作用。而進(jìn)一步探究星天牛有效引誘物質(zhì)成分、最佳配比以及有效劑量，緩釋裝置怎樣保證引誘物質(zhì)的持續(xù)穩(wěn)定釋放，誘捕裝置的防逃逸設(shè)計(jì)等，都是下一階段研究的重點(diǎn)與方向。