桃小食心蟲成蟲期高表達(dá)氣味結(jié)合蛋白基因的克隆與表達(dá)譜分析

李凱旋, 李艷艷, 王樹娟, 斯 琴, 張麗瑩, 龐保平

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原昆蟲研究中心, 呼和浩特 010020; 2. 呼和浩特市園林植保站, 呼和浩特 010030; 3. 呼和浩特市成吉思汗公園, 呼和浩特 010010)

桃小食心蟲Carposinasasakii屬鱗翅目(Lepidoptera)蛀果蛾科(Carposinidae)，在我國分布范圍廣，主要危害蘋果、棗、梨、桃、李、杏、山楂等多種果樹的果實(shí)，每年造成果樹落果和蟲果率高達(dá)50%，是果園中危害最大、發(fā)生最普遍的主要害蟲之一(孫麗娜等, 2015)。桃小食心蟲初孵幼蟲蛀果后，整個(gè)幼蟲時(shí)期均在果內(nèi)為害，直至老熟幼蟲脫果后，落入土中結(jié)繭化蛹。目前我國對桃小食心蟲的防控方法，主要以套袋和化學(xué)防治為主，由于用藥量多、用藥品種泛濫、種植模式調(diào)整、全球氣候變暖等原因，桃小食心蟲的危害大幅回升，抗藥性發(fā)展加快。因此，桃小食心蟲可能再次成為嚴(yán)重危害果樹的重要害蟲。

昆蟲對外界氣味分子的識別是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，目前普遍的說法是氣味分子通過昆蟲嗅覺感器表面的小孔進(jìn)入觸角感器，與氣味結(jié)合蛋白(odorant-binding protein, OBP)特異結(jié)合，穿過嗅覺感器淋巴液，最終激活結(jié)合受體，受體被氣味分子激活后，化學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，引發(fā)一系列神經(jīng)活動，指導(dǎo)昆蟲產(chǎn)生各種行為反應(yīng)(Rützler and Zwiebel, 2005; 楊安等, 2019; 彭竹等, 2021)。參加昆蟲嗅覺識別過程的氣味蛋白主要包括氣味結(jié)合蛋白(OBP)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory protein, CSP)、氣味降解酶(odorant-degrading enzyme, ODE)、氣味受體(odorant receptor, OR)、離子型受體(ionotropic receptor, IR)和感覺神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane protein, SNMP)(Leal, 2013)。其中，OBPs是受體ORs與外界環(huán)境的重要載體，OBPs對化學(xué)物質(zhì)的識別被認(rèn)為是氣味分子對昆蟲行為產(chǎn)生影響的第一步。OBPs作為昆蟲體內(nèi)最早被發(fā)現(xiàn)并開始研究的嗅覺結(jié)合蛋白，已經(jīng)在雙翅目、鱗翅目、鞘翅目等昆蟲中被發(fā)現(xiàn)，到目前被鑒定的OBPs超過600多個(gè)(Pelosietal., 2006, 2018; Zhouetal., 2010)。OBPs是一種小分子酸性、水溶性蛋白，主要存在于觸角淋巴液中(Pelosi and Maida， 1995)，分子質(zhì)量為15～17 kD，大約由120～160個(gè)氨基酸組成。根據(jù)結(jié)合的氣味分子不同，OBPs可以分為性信息素結(jié)合蛋白(pheromone-binding protein, PBP)、普通氣味結(jié)合蛋白(general odorant-binding protein, GOBP)和觸角結(jié)合蛋白(antennal-binding protein x, ABPx)(王桂榮等, 2002)。目前，OBPs功能已經(jīng)通過分子生物學(xué)、生物化學(xué)、生物物理學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、動力學(xué)和電生理學(xué)等手段逐步解析(Sandleretal., 2000; Zhangetal., 2017; Zhuetal., 2017)。通過qRT-PCR技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)OBPs不僅在觸角中表達(dá)，同時(shí)在其他組織中也有表達(dá)，例如在頭、下唇須、喙、腹、足、性腺中等，此外在幼蟲及蛹期也有表達(dá)，根據(jù)基因表達(dá)與功能的聯(lián)系，研究認(rèn)為在觸角中特異性或高豐度表達(dá)的OBPs主要參與昆蟲的嗅覺識別(De Biasioetal., 2015; Yuanetal., 2015)。免疫定位和原位雜交等技術(shù)進(jìn)一步明確了每種感器一般只表達(dá)單一類型的OBPs，例如，PBPs在毛形感器中專一表達(dá)，GOBPs則大多數(shù)在錐形感器中表達(dá)(Vogtetal., 2002)。

昆蟲嗅覺識別機(jī)制的解析，對害蟲生物防治具有重要的意義。對昆蟲嗅覺識別機(jī)制的探討, 有利于尋找新的化合物，通過干擾昆蟲嗅覺識別，進(jìn)而達(dá)到對靶標(biāo)害蟲的有效控制。桃小食心蟲成蟲期是控制此害蟲發(fā)生為害的關(guān)鍵時(shí)期。因此，解析桃小食心蟲成蟲嗅覺識別的分子機(jī)制，對于制定有效的綠色防控措施具有重要的意義?；诖耍狙芯扛鶕?jù)前期獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Tianetal., 2018)，篩選在桃小食心蟲雌雄成蟲觸角中相對表達(dá)量較高的5個(gè)氣味結(jié)合蛋白(OBP)基因(CsasOBP7,CsasOBP12,CsasOBP15,CsasOBP19和CsasOBP21)，采用RACE克隆技術(shù)對其cDNA全長序列進(jìn)行克隆，并對這5個(gè)CsasOBP基因在桃小食心蟲不同發(fā)育階段及剛羽化、交配高峰期及交配后6 h成蟲不同組織內(nèi)的表達(dá)量進(jìn)行測定，以明確桃小食心蟲發(fā)育及交配過程中關(guān)鍵氣味結(jié)合蛋白的表達(dá)模式，為制定利用基因編輯等方式定向調(diào)控桃小食心蟲的嗅覺行為的新型防治策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試桃小食心蟲采自中國農(nóng)科院果樹研究所(40.61°N, 120.73°E)，實(shí)驗(yàn)室置于溫度(25±1)℃、相對濕度(70±5)%、光周期15L∶9D的人工氣候箱中飼養(yǎng)。昆蟲飼養(yǎng)方法：將卵卡放置于未成熟金冠蘋果上，初孵幼蟲蛀果后，將蟲果置于上述培養(yǎng)箱中，待老熟幼蟲脫果后放入木屑中化蛹，羽化后成蟲飼喂10%蜂蜜水。

1.2 RNA提取及cDNA合成

取100對桃小食心蟲成蟲觸角，提取RNA用于CsasOBP基因全長克隆。為明確CsasOBP基因在桃小食心蟲不同發(fā)育階段及成蟲交配前后的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)選取完整的桃小食心蟲1日齡卵、5日齡卵、初孵幼蟲、老熟幼蟲和蛹(3日齡)迅速置于液氮中。分別切取剛羽化、交配高峰期和交配后6 h桃小食心蟲雌雄成蟲觸角、頭(不含觸角)、胸、腹、足及翅樣品，每個(gè)樣品取50～60頭。按照MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (TaKaRa，大連)，總RNA提取試劑盒說明書提取上述所有樣品總RNA，用超微量紫外分光光度計(jì)(IMPLEN-P330，德國)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的濃度及質(zhì)量。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第1鏈，在-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RACE全長基因克隆

基于前期桃小食心蟲轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(Tianetal., 2018)，篩選并獲得在桃小食心蟲雌雄成蟲觸角中相對表達(dá)量較高的5個(gè)CsasOBP基因(CsasOBP7,CsasOBP12,CsasOBP15,CsasOBP19和CsasOBP21)的片段序列，設(shè)計(jì)目的基因序列3′RACE和5′RACE片段特異性引物(表1)。中間片段擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系: 成蟲觸角cDNA模板1 μL, 正反向引物(10μmol/L)各1 μL, Premix TaqTM(V2.0 plus Dye)(TaKaRa，大連)12.5 μL, ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性3 min; 94℃變性30 s, 50℃ 退火30 s, 72℃ 延伸1 min, 30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，用 DNA凝膠回收試劑盒回收純化目的片段，連接pMD19-T克隆載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Escherichiacoli感受態(tài)細(xì)胞DH5α后涂布含有氨芐的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12 h，挑取白色單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證后再將驗(yàn)證正確的菌液于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，送樣測序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

續(xù)表1 Table 1 continued

CsasOBP基因的3′末端和5′末端序列擴(kuò)增：根據(jù)測序驗(yàn)證結(jié)果設(shè)計(jì)3′-和5′-特異性引物(表1)，按照SMARTer?RACE 5′/3′ Kit試劑盒(TaKaRa，大連)說明書進(jìn)行擴(kuò)增，巢氏PCR程序: 94℃ 30 s, 72℃ 2 min, 5個(gè)循環(huán); 94℃ 30 s, 70℃ 30 s, 72℃ 2 min, 5個(gè)循環(huán); 94℃ 30 s, 68℃ 30 s, 72℃ 2 min, 20個(gè)循環(huán)。再以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行巢氏PCR: 94℃ 30 s, 68℃ 30 s, 72℃ 2 min, 25個(gè)循環(huán)。得到擴(kuò)增PCR產(chǎn)物處理方法同上。測序得到的3′與5′端序列片段與中間片段拼接，最終得到全長cDNA序列。

1.4 基因序列生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 6.0軟件將翻譯后的基因序列與其他昆蟲的OBP基因序列進(jìn)行比對；使用在線程序Expasy(http:www.expasy.org/tools/pi_tool.html)對5個(gè)CsasOBPs的分子量及理論等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測；使用Signal P 5.0(https:∥services.healthtech.dtu/service.php?SignalP-5.0)預(yù)測5個(gè)CsasOBPs的信號肽序列。運(yùn)用NCBI Conserved Domains(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析5個(gè)CsasOBPs的保守結(jié)構(gòu)域；用ProtScale(http:∥web.expasy.org/ cgi-bin/protscale/protscale.pl)對5個(gè)CsasOBPs進(jìn)行疏水性分析；使用PredictProtein(https:∥www.predictprotein.org/)預(yù)測氨基酸序列中的二硫鍵位置和蛋白二級結(jié)構(gòu)；運(yùn)用在線軟件Swiss-Model(https:∥www. swissmodel.expasy.org/)對蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；在NCBI中利用Blast進(jìn)行5個(gè)CsasOBP蛋白的同源搜索和比對(e值設(shè)定為10-5)，選擇其他鱗翅目昆蟲的氣味結(jié)合蛋白氨基酸序列，經(jīng)Clustal X進(jìn)行多序列比對。 使用MEGA 6.0軟件的鄰接法(neighbor-joining method, NJ method)(重復(fù)運(yùn)行1 000次)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 基因時(shí)空表達(dá)測定

基于1.3節(jié)克隆的5個(gè)CsasOBP基因序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)半定量RT-PCR引物(表1)， 利用PrimerBank在線軟件(https:∥pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表1)，選用Actin作為內(nèi)參基因，以1.2節(jié)合成的cDNA為模板，每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)，4次技術(shù)重復(fù)。半定量RT-PCR反應(yīng)體系(25 μL): Premix TaqTM(V2.0 plus Dye) 12.5 μL, cDNA模板1 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, Nuclease-Free Water 9.5 μL。RT-PCR反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性3 min; 94℃變性 30 s, 55℃退火 30 s, 72℃延伸2 min, 35次循環(huán);72℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測表達(dá)量。qRT-PCR反應(yīng)體系(20 μL): SYBRⅡMix 10 μL, cDNA模板2 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL, Nuclease-Free Water 7.2 μL。qPCR反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性10 min; 95℃變性15 s, 60℃退火15 s, 72℃延伸30 s, 40次循環(huán)。所有處理均以CsasOBP7在剛羽化的雌成蟲觸角中的表達(dá)量為對照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算5個(gè)CsasOBP基因在不同發(fā)育階段及不同組織的相對表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 20統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析和Duncan氏多重極差檢驗(yàn)，對每個(gè)基因在不同發(fā)育階段及在相同性別不同組織中的表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析，利用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)對每個(gè)基因在相同組織不同性別的表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 桃小食心蟲OBP基因的序列特征

克隆獲得桃小食心蟲5個(gè)氣味結(jié)合蛋白基因CsasOBP7,CsasOBP12,CsasOBP15,CsasOBP19和CsasOBP21全長cDNA序列(GenBank登錄號分別為MZ476786-MZ476790)。這5個(gè)基因具有完整的開放閱讀框，開放閱讀框長度分別為432, 543, 411, 765和483 bp，分別編碼143, 180, 136, 254和160個(gè)氨基酸，蛋白分子量分別為16.35, 19.94, 14.86, 29.01和18.48 kD，等電點(diǎn)分別為5.06, 6.88, 4.32, 6.91和5.11，均含有信號肽。序列比對(圖1)發(fā)現(xiàn)，CsasOBP7, CsasOBP12, CsasOBP15和CsasOBP21均含有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，第2-3個(gè)半胱氨酸殘基之間間隔3個(gè)其他氨基酸殘基，屬于完整的Classical OBPs；CsasOBP19經(jīng)對比分析后確定為C端不完整的Minus-C OBP。

圖1 桃小食心蟲5個(gè)CsasOBPs的氨基酸序列比對Fig. 1 Amino acid sequence alignment of five CsasOBPs of Carposina sasakiiCsasOBPs的GenBank登錄號GenBank accession numbers of CsasOBPs: CsasOBP7: MZ476786.1; CsasOBP12: MZ476787.1; CsasOBP15: MZ476788.1; CsasOBP19: MZ476789.1; CsasOBP21: MZ476790.1. 6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)中，藍(lán)色區(qū)域相似度為100%，粉色區(qū)域相似度≥75%。Among the six conservative cysteine sites, the similarity of blue area is 100% and the similarity of pink area is ≥75%.

通過DNAMAN比對發(fā)現(xiàn)CsasOBP7與大螟Sesamiainferens的SinfOBP16(GenBank登錄號: AGS36756.1)的氨基酸序列一致性最高，為51.75%；CsasOBP12與馬尾松毛蟲Dendrolimuspunctatus的DpunOBP39(GenBank登錄號: ARO70198.1)氨基酸序列一致性最高，為76.5%；CsasOBP15與沙棘木蠹蛾Eogystiahippophaecolus的EhipOBP (GenBank登錄號: AOG12857.1)氨基酸序列一致性最高，為58.57%；CsasOBP19與二化螟Chilosuppressalis的CsupOBP(GenBank登錄號: AGM38607.1)氨基酸序列一致性最高，為65.75%；CsasOBP21與小菜蛾P(guān)lutellaxylostella的PxylOBP35(GenBank登錄號: AMR99729.1)氨基酸序列一致性最高，為58.48%。

2.2 桃小食心蟲OBP基因的系統(tǒng)發(fā)育

采用鄰接法對桃小食心蟲5個(gè)CsasOBPs與鱗翅目其他12個(gè)科昆蟲的OBPs構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，從圖中可以看出9種螟蛾科昆蟲、5種夜蛾科昆蟲、3種尺蛾科昆蟲、2種枯葉蛾科昆蟲、2種草螟科昆蟲以及卷葉蛾科、菜蛾科、斑蛾科、蛺蝶科、木蠹蛾科、蛀果蛾科、卷蛾科各1種昆蟲被分為4大分支。這5個(gè)CsasOBPs與其他科的昆蟲同源性表現(xiàn)不同，但與DNAMAN比對結(jié)果相同，如CsasOBP19與二化螟的CsupOBP聚為一個(gè)分支且自檢值高達(dá)100，說明它們有保守相似的功能。CsasOBP21和CsasOBP15與其他昆蟲的OBPs同源性比較低，自檢值分別為25和12，且CsasOBP15單獨(dú)聚為一個(gè)小分支，說明CsasOBP15與其他幾個(gè)OBPs相比可能有不同的功能。這5個(gè)CsasOBPs之間分別聚類在3個(gè)分支中，其中CsasOBP7和CsasOBP19聚在一個(gè)分支，其他3個(gè)CsasOBPs分別聚在2個(gè)分支中，表明CsasOBP7和CsasOBP19親緣關(guān)系較近且可能有相似的功能，其他3個(gè)CsasOBPs互相之間功能可能存在差異。

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的桃小食心蟲CsasOBPs與其他鱗翅目昆蟲OBPs的系統(tǒng)進(jìn)化樹(1 000次重復(fù))Fig. 2 Phylogenetic tree of CsasOBPs of Carposina sasakii and OBPs from other lepidopteran insects constructed by the neighbor-joining method based on amino acid sequence (1 000 replicates)蛋白來源物種Origin species of proteins: Pxyl: 小菜蛾P(guān)lutella xylostella; Sexi: 甜菜夜蛾Spodoptera exigua; Hrho: 重陽木斑蛾Histia rhodope; Cpun: 桃蛀螟Conogethes punctiferalis; Obru: 冬尺蠖蛾Operophtera brumata; Dple: 黑脈金斑蝶Danaus plexippus plexippus; Dpun: 馬尾松毛Dendrolimuspunctatus; Csup: 二化螟Chilo suppressalis; Sinf: 大螟Sesamia inferens; Ehip: 沙棘木蠹蛾Eogystia hippophaecolus; Sins: 小線角木蠹蛾Streltzoviella insularis; Adis: 雙委夜蛾Athetis dissimilis; Dabi: 冷杉梢斑螟Dioryctria abietella; Acon: 蘋果果蛾Argyresthia conjugella; Msep: 玉米黏蟲Mythimna separate; Dkik: 思茅松毛蟲Dendrolimus kikuchii; Dhou: 云南松毛蟲Dendrolimus houi; Eobl: 茶尺蠖Ectropis obliqua; Gpyl: 桑螟Glyphodes pyloalis; Hass: 煙草夜蛾Helicoverpa assulta; Cpin: 松蛀螟Conogethes pinicolalis; Gmel: 大蠟螟Galleria mellonella; Cmed: 稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis; Gmol: 梨小食心蟲Grapholita molesta; Scin: 國槐尺蠖Semiothisa cinerearia; Lbot: 葡萄花翅小卷蛾Lobesia botrana; Gcae: 黃翅絹絲野螟Glyphodes caesalis.

2.3 桃小食心蟲OBP基因的時(shí)空表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果表明，桃小食心蟲的5個(gè)CsasOBP基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)量不同。CsasOBP7和CsasOBP19均在蛹期表達(dá)量最高(P<0.05)，其中CsasOBP7在蛹期的表達(dá)量顯著高于其他發(fā)育階段的(P<0.05)，而CsasOBP19除了在蛹期高表達(dá)外，在卵期表達(dá)量也較高，僅次于蛹期的。CsasOBP12,CsasOBP15和CsasOBP21均在卵期表達(dá)量最高(P<0.05)，其中CsasOBP21除了在卵期高表達(dá)外，在蛹期的表達(dá)量也較高，僅次于卵期的,而CsasOBP15除了在卵期高表達(dá)外，在其他發(fā)育階段表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05)(圖3)。上述結(jié)果與半定量RT-PCR結(jié)果(圖4)一致。

圖3 桃小食心蟲不同發(fā)育階段5個(gè)CsasOBP基因表達(dá)量的qRT-PCR分析Fig. 3 Expression levels of five CsasOBP genes in Carposina sasakii at different developmental stages detected by qRT-PCRA: CsasOBP7: B: CsasOBP12; C: CsasOBP15; D: CsasOBP19; E: CsasOBP21. E1: 1日齡卵1-day-old egg; E5: 5日齡卵5-day-old egg; PL: 初孵幼蟲Newly hatched larva; ML: 老熟幼蟲Mature larva; P: 蛹Pupa. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05, Duncan氏多重極差檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE. Different letters above bars indicate significant difference (P<0.05, Duncan’s multiple range test).

圖4 桃小食心蟲不同發(fā)育階段成蟲不同組織中5個(gè)CsasOBP基因表達(dá)量的半定量RT-PCR分析Fig. 4 Semi-quantitative RT-PCR analysis of the expression levels of five CsasOBP genes in different tissues of Carposina sasakii adults at different developmental stagesAn: 觸角Antenna; He: 去除觸角的頭Head with antennae removed; Th: 胸Thorax; Ab: 腹Abdomen; Le: 足Leg; Wi: 翅Wing. NE: 剛羽化成蟲Newly emerged adult; MP: 交配高峰期成蟲Adult at the mating peak; M6: 交配后6 h的成蟲Adult at 6 h after mating.

在成蟲剛羽化時(shí)，5個(gè)CsasOBP基因的表達(dá)量在不同組織間均存在顯著差異，CsasOBP7,CsasOBP12和CsasOBP21的表達(dá)量在各組織中最高，其次為CsasOBP19的，最低為CsasOBP15的；除CsasOBP19在雌蟲腹部的表達(dá)量顯著高于在雄蟲腹部的(P<0.01)外，其他4個(gè)CsasOBP基因的表達(dá)量均在雄蟲組織中高于在雌蟲組織中(圖5)。在成蟲交配高峰期，5個(gè)CsasOBP基因在雄蟲觸角中表達(dá)量均顯著高于在其他組織中的(P<0.05)；CsasOBP7和CsasOBP15只在觸角中表達(dá)(P<0.05)，且在雄蟲觸角中的表達(dá)量顯著高于在雌蟲觸角中的(P<0.01)；CsasOBP12在雄蟲觸角中表達(dá)量最高(P<0.05)，其次為在腹部以及在雄蟲足和翅中的，在其他組織中不表達(dá)；CsasOBP19在雄蟲觸角中表達(dá)量最高(P<0.05)，其次為在雌蟲觸角、足、翅以及雄蟲頭部(不含觸角)和翅中，在胸部和腹部無表達(dá)；CsasOBP21 在雄蟲觸角中的表達(dá)量顯著高于其他CsasOBP的，大約是其他4個(gè)CsasOBP基因最高表達(dá)量的70～1 900 倍(圖6)。在成蟲交配后6 h，CsasOBP19在雄蟲觸角和雌蟲翅中高表達(dá)，CsasOBP21在觸角中高表達(dá)且在雄蟲觸角中表達(dá)量顯著高于雌蟲觸角中的(P<0.01)，兩者在其他組織中不表達(dá)或微量表達(dá)；CsasOBP7在雄蟲足和翅中高表達(dá)(P<0.05)，在其他組織中不表達(dá)或微量表達(dá)；CsasOBP12在雄蟲腹部高表達(dá)(P<0.05)，其次為在雄蟲翅中，在其他組織中不表達(dá)或微量表達(dá)；CsasOBP15在雌蟲腹部高表達(dá)(P<0.05)，其次為在雄蟲觸角中，在其他組織中不表達(dá)(圖7)。

圖5 5個(gè)CsasOBP基因在桃小食心蟲成蟲剛羽化時(shí)期不同組織中的表達(dá)量Fig. 5 Expressions levels of five CsasOBP genes in different tissues of the newly emerged adults of Carposina sasakiiA: CsasOBP7; B: CsasOBP12; C: CsasOBP15; D: CsasOBP19; E: CsasOBP21. An: 觸角 Antenna; He: 去除觸角的頭 Head (excluding antenna); Th: 胸Thorax; Ab: 腹Abdomen; Le: 足Leg; Wi: 翅Wing. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上星號表示同一組織雌雄間的基因表達(dá)量差異顯著(*P<0.05; **P<0.01)(T檢驗(yàn)); 柱上不同大寫和小寫字母分別表示基因表達(dá)量在雌和雄成蟲不同組織間差異顯著(P<0.05, Duncan氏多重極差檢驗(yàn))。圖6和7同。Data in the figure are mean±SE. Asterisks above bars indicate significant difference in the gene expression level in the same tissue between female and male adults (*P<0.05; **P<0.01) (T-test). Different capital and lowercase letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different tissues of female and male adults, respectively (P<0.05, Duncan’s multiple range test). The same for Figs. 6 and 7.

圖6 5個(gè)CsasOBP基因在桃小食心蟲交配高峰期成蟲不同組織中的表達(dá)量Fig. 6 Expressions levels of five CsasOBP genes in different tissues of Carposina sasakii adults at the mating peak stageA: CsasOBP7; B: CsasOBP12; C: CsasOBP15; D: CsasOBP19; E: CsasOBP21.

圖7 5個(gè)CsasOBP基因在桃小食心蟲交配后6 h成蟲不同組織中的表達(dá)量Fig. 7 Expressions levels of five CsasOBP genes in different tissues of Carposina sasakii adults at 6 h after matingA: CsasOBP7; B: CsasOBP12; C: CsasOBP15; D: CsasOBP19; E: CsasOBP21.

3 討論

本研究根據(jù)桃小食心蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，首次克隆了桃小食心蟲5個(gè)CsasOBP基因cDNA全長序列。序列分析表明，CsasOBP7, CsasOBP12, CsasOBP15和CsasOBP21均含有6個(gè)保守的半胱氨酸，且第2-3個(gè)半胱氨酸之間有3個(gè)其他氨基酸，屬于Classical OBPs；CsasOBP19為一段C端不完整的Minus-C OBP。與其他昆蟲OBP序列同源對比和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系發(fā)現(xiàn)(圖2)，CsasOBP19和二化螟的CsupOBP聚類在同一分支；序列比對中也發(fā)現(xiàn)兩個(gè)OBPs同源性最高。這也說明物種親緣關(guān)系越近，氣味蛋白間的序列相似性越高，同時(shí)也說明這兩種氣味結(jié)合蛋白在桃小食心蟲和二化螟在嗅覺識別過程中可能有相似的功能。

絕大部分OBP基因在昆蟲觸角中特異性或高表達(dá)(陳秀琳等, 2018; 胡軍等, 2019)，這與OBPs作為載體參與觸角淋巴液脂溶性氣味分子運(yùn)輸?shù)墓δ?(Bentonetal., 2007)相一致；同時(shí)OBP在雌雄蟲的相同組織也有明顯的偏向表達(dá)，可能與不同性別在昆蟲特定時(shí)期的承擔(dān)角色不同有關(guān)，如小菜蛾P(guān)xylOBP31在雄蛾觸角中的表達(dá)量是雌蛾觸角表達(dá)量的近2倍(覃江梅等, 2016)。在本研究中，雖然5個(gè)CsasOBP基因在桃小食心蟲剛羽化時(shí)在成蟲各組織中均有表達(dá)(圖5)，但在交配高峰期均在觸角中特異性高表達(dá)(圖6)，且在雄蟲觸角中遠(yuǎn)高于在雌蟲觸角，這意味著這些OBP可能結(jié)合桃小食心蟲雌成蟲揮發(fā)的性信息素，在雄蟲尋找雌蟲過程中起著重要的作用。特別是CsasOBP21和CsasOBP7在雄蟲觸角中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他3個(gè)CsasOBP基因，值得進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)桃小食心蟲剛羽化、交配高峰以及交配后6 h 3個(gè)時(shí)期(圖5～7)，5個(gè)CsasOBP基因的表達(dá)量總體上呈由高到低變化，這與桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis的BdorOBP61在桔小實(shí)蠅成蟲各個(gè)時(shí)期表達(dá)情況 (龔妃良, 2014)一致。OBPs存在的組織與其功能有關(guān)(Lietal., 2008)。桃小食心蟲雌雄成蟲在求偶時(shí)均會產(chǎn)生振翅行為，同時(shí)雌蟲求偶時(shí)前、中、后足會將整個(gè)蟲體抬起與支持物平行(蔣天小, 2017)。CsasOBP12，CsasOBP19和CsasOBP21在交配高峰期的翅和足中表達(dá)較高可能與雌雄蟲在交配高峰期的求偶行為有關(guān)。CsasOBP19在交配后6 h，在觸角及翅中表達(dá)量較交配前升高且在雌成蟲翅中大量表達(dá)，類似現(xiàn)象也出現(xiàn)在棉鈴蟲Helicoverpaarmigera中(李兆群等, 2017)。

綜上所述，本研究成功克隆了桃小食心蟲5個(gè)CsasOBP基因的全長cDNA序列，并對其生物信息學(xué)及表達(dá)特性進(jìn)行了分析。 研究結(jié)果表明5個(gè)CsasOBP基因可能在桃小食心蟲雄蟲尋找雌蟲過程中發(fā)揮著重要作用，為進(jìn)一步研究其在桃小食心蟲嗅覺識別中的功能，及其在桃小食心蟲尋找配偶、寄主定位及產(chǎn)卵地選擇等方面的作用奠定了必要的基礎(chǔ)。