雨生紅球藻蝦青素合成關(guān)鍵酶的原核表達(dá)及純化

叢曉梅，臧曉南，王振東，衛(wèi)雪紅，昝佳偉

(中國海洋大學(xué) 海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

引 言

蝦青素(Astaxanthin，3-3’-二羥基-β-β’胡蘿卜素-4-4’-二酮)，是一種紅色的酮式類胡蘿卜素，具有極強(qiáng)的清除氧自由基的能力，其抗氧化性是維生素E的550倍、β-胡蘿卜素的10倍，被稱為“超級抗氧化劑”[1-2]。蝦青素具有良好的著色功能，還有抗癌、抗輻射、增強(qiáng)免疫力等作用，在水產(chǎn)養(yǎng)殖、飼料添加劑、食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的市場[3]。

雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)是自然界中天然蝦青素最好的生物來源，在脅迫條件下能大量積累蝦青素，積累量能達(dá)到細(xì)胞干重的5%[4]。在類胡蘿卜素合成途徑中，八氫番茄紅素合成酶(PSY)是第一個限速酶，它通過催化2分子GGPP縮合產(chǎn)生1,5-順式八氫番茄紅素完成類胡蘿卜素合成的第一個特征反應(yīng)，是八氫番茄紅素合成的關(guān)鍵酶[5-6]。β-胡蘿卜素羥化酶(CRTZ)是雨生紅球藻體內(nèi)蝦青素合成途徑中的一種關(guān)鍵酶，能夠?qū)ⅵ?胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成玉米黃素，也能將角黃質(zhì)轉(zhuǎn)化成蝦青素。β-胡蘿卜素酮化酶(CRTW)是雨生紅球藻蝦青素合成的又一種關(guān)鍵酶，能夠以β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)為底物分別合成角黃質(zhì)和蝦青素[7-8]，這3個酶在雨生紅球藻蝦青素合成過程中發(fā)揮了重要作用。相對于真核生物，原核生物具有成本低，周期短，效率高等特點，是生產(chǎn)重組蛋白常見的方法。雖然雨生紅球藻的這3個關(guān)鍵酶基因都已經(jīng)有實驗完成了克隆，但是其在大腸桿菌中的表達(dá)純化卻未見報道。

本實驗以雨生紅球藻為研究對象，將八氫番茄紅素合成酶(PSY)、β-胡蘿卜素酮化酶(CRTW)和β-胡蘿卜素羥化酶(CRTZ)的基因進(jìn)行異源表達(dá)、純化制備并利用ELISA試劑盒進(jìn)行酶活性測定，為特異性抗體的制備及后續(xù)基因功能的研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

雨生紅球藻HaematococcuspluvialisOUC H2來自中國海洋大學(xué)藻類遺傳學(xué)實驗室藻種室。轉(zhuǎn)化菌株E.coliTrans-T1、克隆載體pEASY?-T3 Cloning Vector購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。表達(dá)載體PET-24a、表達(dá)菌株E.coliRosetta(DE3)均為本實驗室保存。

1.1.2 實驗試劑

Plant RNA Kit試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司，Takara MiniBest Plant Genomic DNA Extraction Kit試劑盒購自Takara公司。限制性內(nèi)切酶購自美國Thermo科技公司。ELISA試劑盒購自臺灣生工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成

利用Plant RNA Kit試劑盒提取雨生紅球藻總RNA，經(jīng)Nanodrop 2000c測定濃度及OD260/OD280以及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。檢測合格后，用DNase處理后，以RNA為模板將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，檢測待用。

1.2.2 雨生紅球藻DNA的提取

DNA提取方法參照TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit試劑盒使用說明，經(jīng)Nanodrop 2000c(Thermo Scientific，USA)測定DNA濃度及OD260/OD280以及瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，檢測合格后待用。

1.2.3 引物設(shè)計及基因克隆

根據(jù)實驗室前期轉(zhuǎn)錄組測序序列設(shè)計crtz基因的引物Z-F(ATGCTGTCGAAGCTGCAGTCAATCAG)和Z-R(CCGCTTGGACCAGTCCAGTTC)，crtw基因的引物W-F(ATGCACGTCGCATCGGCACTAATG)和W-R(TGCCAAGGCAGGCACCAG)，以及psy基因的引物P-F(ATGCTTCACCAATCGCTGCCTG)和P-R(GCCTCTGTGCTGAGGCA)，引物設(shè)計過程中均去掉終止密碼子，且5’端和3’端分別引入限制性酶切位點BamHI和SacI。分別以雨生紅球藻的cDNA和DNA為模板，用上述引物對crtz，crtw，psy進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。對與目的片段大小一致的條帶進(jìn)行回收，連接T載體，轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.4 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒

以BamHI和SacI為酶切位點將擴(kuò)增得到的crtz，crtw，psy基因分別連接到表達(dá)載體pET-24a上，得到目標(biāo)質(zhì)粒分別命名為pET-24a-crtz，pET-24a-crtw，pET-24a-psy。將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株Rosetta，得到的重組菌株分別命名為E.coliRZ，E.coliRW，E.coliRP?？瞻讓φ諡榭蛰d體pET-24a轉(zhuǎn)化Rosetta的菌株E.coliRosetta/pET-24a。

1.2.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取轉(zhuǎn)化的E.coliRZ，E.coliRW，E.coliRP單菌落接種于含硫酸卡那霉素和氯霉素兩種抗生素的100 mL LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，按1:100的比例將菌株接種于新鮮的LB液體培養(yǎng)基活化，當(dāng)OD600在0.6～0.8時加入IPTG在30 ℃搖床中誘導(dǎo)表達(dá)，使IPTG終濃度為1 mM，誘導(dǎo)時間設(shè)置梯度分別為2，4，6，8 h。

1.2.6 SDS-PAGE檢測

取誘導(dǎo)后的菌液2 mL離心收集沉淀，按4:1的比例加入5×SDS-PAGE loading buffer(購自上海生工生物股份有限公司)，沸水浴5 min使蛋白變性，取20 μL上樣，電泳時間約45 min，用10%的三氯乙酸固定30 min，考馬斯亮藍(lán)染色2-3 h，過夜脫色至背景清晰后加入蒸餾水保存。

1.2.7 Western blotting檢測

將電泳后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜封閉液4 ℃過夜，用2×PBS洗膜，6×His標(biāo)簽抗體進(jìn)行一抗反應(yīng)2 h，洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗反應(yīng)1 h。洗膜4次，加入DAB顯色液至出現(xiàn)明顯的條帶。

1.2.8 重組蛋白的純化與檢測

分別將菌液E.coliRZ，E.coliRW，E.coliRP轉(zhuǎn)接到200 mL含雙抗的LB液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)6 h，4 000 rpm離心收集沉淀，用5 mL 0.9% NaCl清洗，10 000 rpm離心20 min，沉淀用5 mL PBS母液重懸超聲破碎6 min，離心收集上清。采用親和色譜的方法通過AKTA explorer蛋白純化儀(GE Healthcare)進(jìn)行純化，將上清液上HisTrapTMFF(GE Healthcare)。Wash buffer咪唑濃度為20 mM，Elution buffer咪唑濃度為500 mM，收集洗脫液。將洗脫的蛋白制樣，進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.9 ELISA測定酶活性

將誘導(dǎo)表達(dá)的菌株E.coliRZ，E.coliRW，E.coliRP取出1 mL新鮮的菌液待用，純化后的蛋白液取出100 μL待用，酶活性分別用植物β-胡蘿卜素羥化酶(CRTR-B)、β-胡蘿卜素酮化酶(BKT)、八氫番茄紅素合成酶(PSY)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(均購自北京索萊寶科技有限公司)進(jìn)行測定，具體方法參照試劑盒說明書，并對酶活性(IU/L)進(jìn)行計算。

2 結(jié)果

2.1 目的片段的克隆

以雨生紅球藻cDNA為模板，PCR擴(kuò)增經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示結(jié)果如圖1所示。以DNA為模板，瓊脂糖凝膠電泳檢測crtw，crtz，psy基因的結(jié)果如圖2所示。經(jīng)測序結(jié)果比對，分別得到crtw基因大小為963 bp(GenBank：MN561260)，無內(nèi)含子，預(yù)期編碼320個氨基酸，推測蛋白大小約為36 kDa；crtz基因大小為882 bp(GenBank：MN561261)，無內(nèi)含子，預(yù)期編碼293個氨基酸，推測蛋白大小約為32 kDa；psy基因序列全長為2002 bp，ORF大小為1 146 bp(GenBank：MN561262)，4個內(nèi)含子，位置分別為426～550 bp，815～1 052 bp，1 211～1 411 bp，1 564～1 848 bp，預(yù)期編碼381個氨基酸，推測蛋白大小約為43 kDa。

圖1 crtw (a)、crtz (b)、psy (c)的cDNA PCR擴(kuò)增 Marker:Trans2k Plus DNA MarkerFig.1 The cDNA amplification of crtw (a), crtz (b), psy (c) Marker:Trans2k Plus DNA Marker

圖2 crtw (a)、crtz (b)、psy (c)的DNA PCR擴(kuò)增 Marker:Trans2k Plus DNA MarkerFig.2 The DNA amplification of crtw (a), crtz (b), psy (c) Marker:Trans2k Plus DNA Marker

2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

三個基因crtw，crtz和psy分別去掉終止密碼子連在不同的pET-24a表達(dá)載體的6×His標(biāo)簽前，得到的表達(dá)載體分別命名為pET-24a-crtw，pET-24a-crtz，pET-24a-psy，質(zhì)粒圖譜如圖3所示，轉(zhuǎn)化E.coliRosetta菌株后得到的重組菌株分別命名為E.coliRW，E.coliRZ，E.coliRP。

圖3 質(zhì)粒圖譜Fig.3 The plasmid profiles

2.3 重組蛋白的SDS-PAGE檢測

重組菌株E.coliRW，E.coliRZ，E.coliRP分別在誘導(dǎo)2 h后，開始出現(xiàn)與目的蛋白大小一致的條帶，分別出現(xiàn)在36，32，43 kDa附近(圖4)，而對照中的相應(yīng)位置沒有條帶出現(xiàn)，說明重組蛋白在原核系統(tǒng)中成功表達(dá)。圖4(a)顯示，在誘導(dǎo)2 h后條帶較淺，隨著誘導(dǎo)時間的增加條帶加深；圖4(b)顯示，誘導(dǎo)2 h條帶不明顯，4 h后條帶明顯加深；圖4(c)顯示，誘導(dǎo)2 h條帶相對較淺，4 h后條帶加深。

圖4 重組菌株的SDS-PAGE檢測(a)E. coli RW：泳道1：Blue Plus Marker(10 μL)，泳道2-3：對照菌株E. coli Rosetta/pET-24a，泳道4-7：IPTG誘導(dǎo)2、4、6、8 h的菌株制樣；(b)E. coli RZ：泳道1-4：IPTG誘導(dǎo)2、4、6、8 h的菌株制樣，泳道5：Blue Plus Marker(10 μL)，泳道6：對照菌株E. coli Rosetta/pET-24a；(c)E. coli RP：泳道1：Blue Plus Marker(10 μL)，泳道2-3：對照菌株E. coli Rosetta/pET-24a，泳道4-7：IPTG誘導(dǎo)8、6、4、2 h的菌株制樣Fig.4 The SDS-PAGE detection of the recombinant strains (a) E. coli RW: lane 1: Blue Plus Marker (10 μL), lane 2-3: E. coli Rosetta/pET-24a, lane 4-7: samples of strains induced by IPTG for 2, 4, 6, 8h, respectively; (b) E. coli RZ: lane 1-4: samples of strains induced by IPTG for 2, 4, 6, 8h, respectively, lane 5: Blue Plus Marker (10 μL), lane 6: E. coli Rosetta/pET-24a; (c) E. coli RP: lane 1: Blue Plus Marker (10 μL), lane 2-3: E. coli Rosetta/pET-24a; lane 4-7: samples of strains induced by IPTG for 8, 6, 4, 2 h, respectively.

2.4 重組蛋白的Western blotting檢測

重組蛋白的Western blotting結(jié)果如圖5所示，E.coliRW，E.coliRZ，E.coliRP中均出現(xiàn)與預(yù)期蛋白大小一致的條帶，說明重組蛋白能與6×His標(biāo)簽抗體特異性結(jié)合，同時該結(jié)果與蛋白電泳的檢測結(jié)果相吻合，分別為36，32，43 kDa，證明三種蛋白CRTW、CRTZ、PSY均能正常表達(dá)。

圖5 重組菌株的Western blotting檢測 (a)E. coli RW：泳道1-4：IPTG誘導(dǎo)2、4、6、8 h的菌株制樣，泳道5：Blue Plus Marker(10 μL)，泳道6：對照菌株E. coli Rosetta/pET-24a；(b)E. coli RZ：泳道1-4：IPTG誘導(dǎo)2、4、6、8 h的菌株制樣，泳道5：Blue Plus Marker(10 μL)，泳道6：對照菌株E. coli Rosetta/pET-24a；(c)E. coli RP：泳道1：Blue Plus Marker(10 μL)，泳道2-3：對照菌株E. coli Rosetta/pET-24a，泳道4-7：IPTG誘導(dǎo)8、6、4、2 h的菌株制樣Fig.5 The western blotting detection of the recombinant strains (a) E. coli RW: lane 1-4: samples of strains induced by IPTG for 2, 4, 6, 8 h, respectively, lane 5: Blue Plus Marker (10 μL), lane 6: E. coli Rosetta/pET-24a; (b) E. coli RZ: lane 1-4: samples of strains induced by IPTG for 2, 4, 6, 8h, respectively, lane 5: Blue Plus Marker (10 μL), lane 6: E. coli Rosetta/pET-24a; (c) E. coli RP: lane 1: Blue Plus Marker (10 μL),lane 2-3: E. coli Rosetta/pET-24a, lane 4-7: samples of strains induced by IPTG for 8, 6, 4, 2 h, respectively.

2.5 純化蛋白的SDS-PAGE檢測

純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖6所示。圖6(a)中在30～40 kDa之間出現(xiàn)一條明顯加深的條帶，與重組菌株RW中的蛋白CRTW(36 kDa)大小相符，圖6(b)中在30 kDa與40 kDa之間也有一條明顯加深的條帶，與重組菌株RZ中的目的蛋白CRTZ(32 kDa)的大小一致，圖6(c)中在40 kDa左右有一條明顯條帶，與重組菌株RP中的目的片段PSY(43 kDa)的大小相符合。表明三種蛋白都得到了有效的純化，純化后目的蛋白濃度提高。

圖6 純化后重組蛋白的SDS-PAGE檢測 M：Blue Plus Marker(10 μL)(a)泳道1-2：E. coli RW；(b)泳道1-2：E. coli RZ；(c)泳道1-2：E. coli RPFig.6 The SDS-PAGE detection of recombinant proteins after purification M: Blue Plus Marker (10 μL) (a) lane 1-2: E. coli RW; (b) lane 1-2: E. coli RZ; (c) lane 1-2: E. coli RP

圖7 純化前后的酶活性檢測Fig.7 The concentration of enzymatic activity before and after protein purification

2.6 ELISA測定酶活性

對誘導(dǎo)后的重組菌株E.coliRW，E.coliRZ，E.coliRP及對照菌株E.coliRosetta/pET-24a分別進(jìn)行酶活性測定，將重組菌株測定的酶活性減掉相應(yīng)對照菌株測定得到的酶活性，得到的即為菌液中相應(yīng)的酶活性，CRTZ，CRTW，PSY對應(yīng)的酶活性分別為3.0，10.5，10.0 IU/L。而在將菌液破碎得到的蛋白上清進(jìn)行純化后，純化蛋白的酶活性對比菌液有大大的提升，分別為125.5，124.7，118.0 IU/L，如圖7所示。菌液測定的結(jié)果表示目的蛋白在相應(yīng)的重組菌株中確實有所表達(dá)，但是含量比較低。純化后酶活性的顯著增加，說明純化所得到的蛋白確實為所需要的蛋白；純化后蛋白濃度顯著增加，可以用于后續(xù)的功能分析和抗體制備。

3 討論

本實驗克隆的八氫番茄紅素合成酶基因，序列全長2 002 bp，ORF為1 146 bp，含有4個內(nèi)含子，編碼381個氨基酸，蛋白分子量為43.13 kDa。Liang等人[9]在雨生紅球藻中克隆過psy基因，并且發(fā)現(xiàn)在不同生物體中該基因具有不同的調(diào)節(jié)特性。將其序列與GenBank中的序列進(jìn)行對比分析，顯示其與萊茵衣藻Chlamydomonasreinhardtii中的該基因(XP_001701192.1)相似性為70%，與杜氏鹽藻Dunaliellasalina的序列相似性為69%。本文克隆的β-胡蘿卜素酮化酶基因，序列全長為963個核苷酸，無內(nèi)含子，編碼320個氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)的大小為36.04 kDa。經(jīng)過序列比對分析，與萊茵衣藻Chlamydomonasreinhardtii(XP_001698699.1)的序列相似性只有57%，杜氏鹽藻中沒有β-胡蘿卜素酮化酶。得到的β-胡蘿卜素羥化酶基因全長為882 bp，無內(nèi)含子，編碼293個氨基酸，序列比對結(jié)果顯示，其與杜氏鹽藻Dunaliellasalina(APW83732.1)的序列相似性為67.32%，與萊茵衣藻Chlamydomonasreinhardtii(XP_001698698.1)的相似性為50.35%。Linden[10]最早從雨生紅球藻中分離得到crtR-B基因，并將其與雨生紅球藻的bkt基因，以及嗜夏孢歐文氏菌的β-胡蘿卜素基因簇一并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，產(chǎn)生了蝦青素。根據(jù)序列比對結(jié)果，八氫番茄紅素合成酶(PSY)、β-胡蘿卜素酮化酶(CRTW)和β-胡蘿卜素羥化酶(CRTZ)在萊茵衣藻Chlamydomonasreinhardtii等綠藻中也有相似序列，但是只有雨生紅球藻能夠高效產(chǎn)生蝦青素，可能是這些序列的結(jié)構(gòu)不同，因此功能不同，因而有必要對相關(guān)基因的功能深入研究。

本實驗構(gòu)建了三個重組菌株E.coliRW，E.coliRZ和E.coliRP，采用pET表達(dá)系統(tǒng)，通過IPTG誘導(dǎo)，重組菌株均表達(dá)出有活性的蛋白。該系統(tǒng)以噬菌體的T7為啟動子，可從各種基因生產(chǎn)大量的目的蛋白[11]，但是受多種因素影響，一些真核基因的表達(dá)量卻很少。本文中雨生紅球藻蝦青素合成關(guān)鍵酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)量不太一致，這可能是受到宿主細(xì)胞的調(diào)控有關(guān)，也可能是形成不同程度的包涵體導(dǎo)致的。有實驗表明，選擇大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)雖然有倍增速度快，容易誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白的優(yōu)點，但是也存在一定的缺點，如外源蛋白表達(dá)速度過快或者表達(dá)后未能正確折疊而導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物多以不溶性的包涵體的形式存在。而包涵體的溶解可以采用超聲或高壓勻漿的方法進(jìn)行破碎細(xì)菌，洗滌后進(jìn)一步加入變性溶液，復(fù)性后可得到有活性的蛋白[12]，因此本研究中純化后條帶的顯著增加(圖6)可能是包涵體的變性溶解使目的蛋白釋放。

由于不同蛋白的最適誘導(dǎo)時間不同，隨著誘導(dǎo)時間的增加，蛋白表達(dá)量會增加，但是時間太長也會導(dǎo)致目的蛋白降解或者菌體老化等問題，反而會導(dǎo)致蛋白得率降低[13]。本文設(shè)置了2，4，6，8 h這四個時間梯度。結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)不同的時間時，4 h與6 h的表達(dá)量比2 h與8 h要多，確定最終誘導(dǎo)時間為6 h。由于本文Western blotting所用的抗體為6×His標(biāo)簽抗體，不能完全證明所得到的蛋白即為目的蛋白，因此進(jìn)一步利用特異性檢測三種酶活性的ELISA試劑盒進(jìn)行生物活性檢測。雖然菌株的ELISA檢測結(jié)果顯示(圖7)酶活性較低，但是也證明了蛋白的正常表達(dá)及活性。含量低可能也是由于包涵體的存在導(dǎo)致部分蛋白沒有活性。對比本實驗中純化前后SDS-PAGE條帶的變化，純化后蛋白條帶明顯加深，蛋白含量也顯著增加，經(jīng)ELISA檢測發(fā)現(xiàn)純化后蛋白酶活性明顯增加(p<0.05)，表明本研究可以成功表達(dá)并純化這三種酶，而且這三個酶有生物學(xué)活性。

綜上所述，本實驗中雨生紅球藻蝦青素合成的關(guān)鍵酶-八氫番茄紅素合成酶(PSY)、β-胡蘿卜素酮化酶(CRTW)和β-胡蘿卜素羥化酶(CRTZ)都能夠成功在大腸桿菌中表達(dá)，這為接下來的功能研究提供了基礎(chǔ)，目的蛋白的成功純化為進(jìn)一步抗體的制備提供了條件。