病原體感染角膜炎機(jī)制及動物模型研究進(jìn)展

陳 柳 ,邱 敏 ,代解杰*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,昆明 650118；2.昆明醫(yī)科大學(xué),昆明 650500)

角膜是眼球最先接觸外界的部分,易受外傷,容易與各類微生物接觸,繼而引發(fā)感染性角膜炎[1]。完整的眼表屏障抵制了大多數(shù)微生物的入侵,但一旦解剖屏障被打破,宿主對病原體的防御就不足以抵制感染,可引起角膜炎癥,嚴(yán)重時導(dǎo)致失明。感染性角膜炎是一種潛在的威脅視力的眼部疾病,由細(xì)菌、真菌、病毒、原生生物等病原體引起。由致病病原體引起的角膜炎癥,能侵入角膜基質(zhì)引起炎癥,并最終破壞這些結(jié)構(gòu)[2-3]。探索其發(fā)病機(jī)制,是目前研究的焦點(diǎn),實驗動物模型的建立有助于感染機(jī)制及防治的研究。本文就近年來病毒、真菌和細(xì)菌感染的動物模型建立及相關(guān)的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行歸納總結(jié),為開展該領(lǐng)域研究的相關(guān)人員提供幫助。

1 病毒感染性動物模型

1.1 單純皰疹病毒感染及動物模型

在發(fā)達(dá)國家,單純皰疹病毒1 型(herpes simplex virus,HSV-1)是感染性失明的主要原因。HSV-1 感染可發(fā)生在眼睛的任何部位；最常見的表現(xiàn)是上皮性或樹突狀角膜炎。對兔眼部接種病毒證實HSV-1感染也可誘發(fā)角膜內(nèi)皮炎[4]。宿主細(xì)胞對HSV-1的應(yīng)答在眼內(nèi)HSV-1 感染的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[5]。

原發(fā)性HSV 感染可發(fā)生在兒童或青年通過粘膜直接接觸,常表現(xiàn)為結(jié)膜炎伴眼瞼囊泡。大多數(shù)眼部HSV 是由三叉神經(jīng)節(jié)潛伏的HSV 感染再激活引起的,并伴有角膜內(nèi)的病毒脫落。HSV 的再激活是由各種環(huán)境因素引發(fā)的,包括壓力、發(fā)燒、紫外線照射以及激光治療或外用糖皮質(zhì)激素等醫(yī)源性因素[6]。Li 等[7]研究了眼部接種后樹鼩三叉神經(jīng)節(jié)中的HSV-1 感染,證實HSV-1 潛伏感染三叉神經(jīng)元。并且發(fā)現(xiàn)與小鼠相比,樹鼩三叉神經(jīng)節(jié)的病毒急性感染更微弱,沒有來自感覺神經(jīng)元的可檢測的傳染性病毒。其輕度感染可能與人類感染更相似,樹鼩可能是研究HSV-1 潛伏感染的很好的模型。夏麗坤等[8]用雌性NIH 小鼠成功地先建立了HSV-1 潛伏感染的動物模型,再通過中波長紫外線照射小鼠角膜建立起了復(fù)發(fā)性單純皰疹性角膜炎的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

感染期間,HSV-1 病毒在角膜上皮細(xì)胞中復(fù)制,并形成巨大的合胞體結(jié)構(gòu)。這些細(xì)胞最終以壞死的方式破裂,并在周圍組織中釋放HSV-1 病毒粒子,導(dǎo)致在角膜的不同層(上皮細(xì)胞、間質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞)形成較大的角膜炎病變[9]。單純皰疹病毒性角膜炎(HSK)是由HSV 感染的角膜細(xì)胞與浸潤的炎癥細(xì)胞相互作用引起的,在24 h 內(nèi),炎癥細(xì)胞(主要是中性粒細(xì)胞)涌入,但也有NK 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,它們在這一階段的功能是限制病毒在組織內(nèi)的傳播。在感染后7 d 開始,CD4+T 細(xì)胞到達(dá)角膜,產(chǎn)生各種細(xì)胞因子,如IFN-g 和IL-17,這些細(xì)胞因子促進(jìn)第二波中性粒細(xì)胞的浸潤和激活,本質(zhì)上更具致病性。這些中性粒細(xì)胞在角膜并被CD4+T 細(xì)胞激活,脫粒并分泌炎癥介質(zhì)、蛋白酶和自由基,這是HSK 中觀察到的大部分組織損傷的原因。有報道稱,原發(fā)性HSK 小鼠角膜中IFN-γ、IL-2和TNFα/β 的水平顯著升高,提示病毒感染后眼內(nèi)CD4+T 細(xì)胞均為Th1 細(xì)胞[10]。又有研究小組證明CD8+T 細(xì)胞在小鼠單純皰疹病毒潛伏感染中起旁觀者作用[11]。

Mott 等[12]用FMS 樣酪氨酸激酶3 配體(Flt3L)免疫BALB/c 或C57BL/6 小鼠,其中Flt3L 是體內(nèi)DCs(CD11+CD8α+) 的強(qiáng)刺激因子,發(fā)現(xiàn)CD11+CD8α+細(xì)胞數(shù)量的增加與HSV-1 潛伏期的增加有關(guān)。此外,CD11c+CD8α-樹突狀細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移與HSV-1 潛伏期的降低有關(guān)。Bryant-Hudson 等[13]已經(jīng)證明,抑制程序性死亡1 配體(PD-L1)與其受體PD-1 的相互作用阻礙了DCs 的激活和病毒滴度的升高。此外,研究還發(fā)現(xiàn),HSV-1 感染過程中樹突狀細(xì)胞失活與多種樹突狀細(xì)胞命令性分子的下調(diào)有關(guān),如 CD80、CD86、CD54、CCR7、CXCR4和MHC1[14]。

在HSV-1 感染期間,角膜上皮細(xì)胞顯示出toll樣受體(TLRs)的不同表達(dá)動態(tài),TLR-4,7,8,9 在活動性角膜炎中顯著上調(diào)[15]。在小鼠模型中,敲除TLR-2 已被證明是抑制角膜炎損傷的有效策略。相反,TLR-4 敲除小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重角膜炎病變的速度更快[16]。雖然TLR-9 與HSV-1 DNA 的連接啟動了清除HSV-1 的強(qiáng)烈免疫反應(yīng),但它也促進(jìn)了導(dǎo)致角膜破壞的炎癥過程[17]。因此,通過分子模擬技術(shù)阻斷TLR-2 和TLR-9 并激活TLR-4 可能是一種新的、有效的策略來避免先天免疫介導(dǎo)的角膜損傷。

1.2 巨細(xì)胞病毒感染及動物模型

巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus,CMV)是β-皰疹病毒家族的成員,是世界范圍內(nèi)先天性感染的主要原因之一[18]。Zhang 等[19]建立了大鼠巨細(xì)胞病毒角膜炎動物模型,發(fā)現(xiàn)CMV 可在體內(nèi)廣泛感染前段組織,包括角膜內(nèi)皮、虹膜和小梁網(wǎng),誘發(fā)相應(yīng)的臨床表現(xiàn)。Kandori 等[20]的一項研究顯示巨細(xì)胞病毒傾向于角膜內(nèi)皮炎,而不是上皮性或基質(zhì)性角膜炎。

雖然不像HSK 那么頻繁,但CMV 引起的角膜炎由于確診的角膜炎患者數(shù)量急劇增加而在最近引起了人們的關(guān)注[21]。使用小鼠中的鼠巨細(xì)胞病毒(mouse cytomegalovirus,MCMV)作為模型系統(tǒng),結(jié)果表明持續(xù)性MCMV 同時存在于慢性活動狀態(tài)和潛伏狀態(tài)中[22]。病毒對CD34+髓系祖細(xì)胞(主要表現(xiàn)為CMV 潛伏期)和其他存在于肺、角膜、視網(wǎng)膜和唾液組織中的細(xì)胞的嗜性使其成為最普遍和適應(yīng)性最強(qiáng)的病原體之一。因此,在免疫缺陷和免疫抑制的宿主中,機(jī)會性巨細(xì)胞病毒感染會出現(xiàn)廣泛的癥狀:從無癥狀的病毒血癥到巨細(xì)胞病毒綜合征和組織侵襲性疾病,主要是由于1 型免疫激活[23]。

在CMV 誘導(dǎo)的角膜炎期間,病毒在離開宿主細(xì)胞感染鄰近細(xì)胞之前有策略地在偽G1 期復(fù)制和組裝[24]。CMV 的這種復(fù)制現(xiàn)象已被證明與上皮性角膜炎、基質(zhì)角膜炎和伴有不透明、分支、非潰瘍性上皮病變的內(nèi)皮炎有關(guān)[25]。但是目前對于CMV 如何導(dǎo)致病毒性角膜炎的機(jī)理仍不明確,只有相關(guān)動物模型的建立。CMV 導(dǎo)致角膜炎發(fā)生的具體途徑仍在研究,尚無文獻(xiàn)說明。

目前有關(guān)CMV 感染的關(guān)鍵分子研究較多,可能會對CMV 導(dǎo)致角膜炎機(jī)制研究提供有效靶點(diǎn)。比如,Puttur 等[26]利用轉(zhuǎn)基因小鼠,CD11c+樹突狀細(xì)胞中的TLR9/MyD88 信號通路通過促進(jìn)NK 細(xì)胞CD69 的表達(dá)和IFN-g 的產(chǎn)生,增強(qiáng)了MCMV 的清除。同時,在漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cells,pDCs)缺失的情況下,常規(guī)樹突狀細(xì)胞(conventional dendritic cells,cDCs)可通過TLR9/MyD88 依賴的方式促進(jìn)健壯的NK 細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞功能和MCMV 的清除。同時,cDCs 來源的IL-15 通過不依賴TLR9/MyD 88 的機(jī)制調(diào)控NK 細(xì)胞脫顆粒。Szomolanyi-Tsuda 等[27]發(fā)現(xiàn)在TLR2 KO 小鼠中,MCMV 復(fù)制的早期控制受損,第4 天在脾和肝中發(fā)現(xiàn)病毒滴度升高,TLR2 對MCMV 的清除作用是由NK 細(xì)胞介導(dǎo)的。以上研究發(fā)現(xiàn)TLR2、TLR9 和DC與CMV 感染有關(guān),但病毒性角膜炎的潛在機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

2 真菌性感染動物模型

2.1 茄病鐮刀菌感染及動物模型

鐮刀菌屬絲狀真菌的成員,是最常引起人類角膜真菌病的病原體之一。鐮刀菌角膜炎在炎熱、潮濕、熱帶或亞熱帶氣候地區(qū)的農(nóng)業(yè)工人中最常見。鐮刀菌病最常見的是角膜局部感染,但在不同國家經(jīng)培養(yǎng)證實的真菌性角膜炎病例中,鐮刀菌的發(fā)病率不同。在許多調(diào)查中,鐮刀菌是主要的角膜真菌病病原,而曲霉屬和念珠菌屬則以其他研究為主,報道最多的病原體是茄病鐮刀菌(Fusarium solani)[28]。

所有主要的真菌病原體都產(chǎn)生無性孢子(分生孢子),從環(huán)境中引入淚膜和眼表。Pinnock 等[29]用手術(shù)刀傷法或注射法均成功誘導(dǎo)了兔和人角膜的感染,對于茄病鐮刀菌,感染后的體內(nèi)培養(yǎng)組織學(xué)與臨床感染的組織學(xué)相似,有致密的白色真菌斑塊、角膜混濁、角膜浸潤、水腫、潰瘍形成、附著物病變、角膜新生血管和細(xì)胞減少。在兔和人的角膜中觀察茄病鐮刀菌的分生孢子粘附在基質(zhì)上,一段時間后,菌絲穿透基質(zhì)。鐮刀菌分生孢子的細(xì)胞表面覆蓋著一層保護(hù)性的疏水蛋白和小球藻層,這有助于屏蔽高免疫原性真菌細(xì)胞表面蛋白β-葡聚糖和α-甘露聚糖(被稱為病原體相關(guān)分子模式),使其無法被免疫細(xì)胞識別[30]。

Mukherjee 等[31]利用體外接觸鏡方法建立的小鼠模型研究發(fā)現(xiàn),茄病鐮刀菌和尖鐮孢菌的生物膜形成能力是致病的關(guān)鍵因素。在小鼠模型中引起角膜炎的能力似乎與生物膜的形成有關(guān),但與生物膜的厚度無關(guān)。另外,鐮刀菌產(chǎn)生的多種毒素包括鐮刀菌醇、T-2 毒素、脫氧鐮刀菌醇、二乙酰氧環(huán)萜醇和鐮刀菌酸[32],具有抑制吞噬功能、細(xì)胞內(nèi)殺傷、細(xì)胞因子、抗原呈遞和巨噬細(xì)胞活性氧(ROS)的產(chǎn)生,此外,它們還可能發(fā)揮抑制T 細(xì)胞功能的作用[33]。

Jin 等[34]用滅活的茄病鐮刀菌刺激人永生化角膜上皮細(xì)胞,證實了來自鐮刀菌的菌絲片段增加了TLR2、3、4 和6 mRNA 的表達(dá)以及IL-6 和IL-8 的釋放。TLR2 和TLR4 蛋白的表達(dá)也通過暴露菌絲片段得到增強(qiáng)?？筎LR2 和抗TLR4 單克隆抗體預(yù)處理也能抑制IL-6 和IL-8 的釋放,結(jié)果表明TLR2 和TLR4 都參與了鐮刀菌暴露后的信號響應(yīng)。苗雨潤等[35]用茄病鐮刀菌感染樹鼩角膜,發(fā)現(xiàn)樹鼩角膜上皮與角膜內(nèi)皮經(jīng)真菌刺激后表達(dá)Dectin-1 與甘露糖受體(MR),但并不能產(chǎn)生IL-1β,提示真菌性角膜炎的發(fā)生可能仍需要免疫系統(tǒng)的參與調(diào)節(jié)。其建立的真菌性角膜炎樹鼩模型,病理表現(xiàn)與人類真菌性角膜炎癥狀接近,甘露糖受體可能參與調(diào)控機(jī)體對真菌感染的免疫應(yīng)答反應(yīng),機(jī)體自身的免疫能力可能對角膜炎病的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸有重要作用,提示樹鼩是角膜炎適合的動物模型。此外,角膜上皮細(xì)胞中表達(dá)的Dectin-1、Dectin-2 可通過激活Syk-MAPK通路,促進(jìn)細(xì)胞因子IL-2、IL-10 和TNF-α 的分泌,進(jìn)而發(fā)揮抗真菌免疫功能[36-37]。

2.2 白色念珠菌感染及動物模型

白色念珠菌(Monilia albican)是溫帶地區(qū)真菌性角膜炎的最常見原因。慢性眼表疾病和長期或全身性使用皮質(zhì)類固醇激素,似乎是念珠菌性角膜炎的主要誘因[38]。酵母樣及相關(guān)真菌引起的角膜炎可能類似細(xì)菌性角膜炎,具有上皮組織缺損、離散浸潤和緩慢進(jìn)展等特征[39]。

酵母細(xì)胞壁的外層纖維由甘露聚糖或甘露蛋白組成,黏附性甘露蛋白在真菌與角膜組織的結(jié)合中發(fā)揮重要作用。這些凝集素樣蛋白識別角膜上皮細(xì)胞表面的甘露糖或甘露糖糖蛋白。角膜損傷導(dǎo)致角膜表面上的甘露糖糖蛋白上調(diào),因此,它可能在真菌性角膜炎的粘連和發(fā)病機(jī)制中起重要作用[40]。形態(tài)發(fā)生是真菌病原體從酵母形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫z形態(tài)的能力。雖然病原體在酵母階段可以更有效地傳播,菌絲形式卻可以很好地適應(yīng)入侵和破壞組織[41]。菌絲能夠生長并通過上皮細(xì)胞,進(jìn)入間質(zhì),如果不減少菌絲,將最終進(jìn)入前房。Sheppard等[42]證明念珠菌和絲狀真菌通過胞吞作用侵入角膜上皮,胞吞作用由入侵蛋白介導(dǎo),并通過蛋白水解酶破壞上皮細(xì)胞的緊密連接。

對真菌的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)主要是由信號c 型凝集素受體(CLR)介導(dǎo)的,其中Dectin-1 在真菌感染的背景下是最典型的[43]。對于真菌感染,先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)主要由CLR 調(diào)節(jié)。Dectin-1可以識別β-葡聚糖,并通過其胞質(zhì)信號域誘導(dǎo)多種細(xì)胞功能,在小鼠和人類對白色念珠菌和其他真菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答中至關(guān)重要。Marakalala 等[44]利用小鼠模型發(fā)現(xiàn),控制白色念珠菌對Dectin-1 的要求是菌株特異性的,因為不同的白色念珠菌菌株在其細(xì)胞壁的組成和性質(zhì)上存在差異,只有在體內(nèi)感染時才會明顯。Dectin-1 介導(dǎo)的對白色念珠菌感染的保護(hù)最近也被認(rèn)為是由于腎浸潤DC 產(chǎn)生I 型IFN,這需要Syk、CARD9 和IRF5[45]。其他起重要作用的信號CLR 包括Dectin-2、Mincle、DC-SIGN 和MR[43]。另外,鄒嫣麗[46]選用BALB/c 小鼠和C57BL/6 小鼠,用角膜基質(zhì)注射法注射白色念珠菌孢子建立了真菌性角膜炎模型,結(jié)果顯示感染早期兩種品系小鼠血漿及受染角膜組織中均有較高水平IL-17 的表達(dá),中后期IL-17 的表達(dá)下降,IFN-γ 的表達(dá)量明顯升高。

3 細(xì)菌性感染動物模型

3.1 銅綠假單胞菌感染及動物模型

細(xì)菌性角膜炎約占所有微生物性角膜炎病例的 90%,其中銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)最常見[47]。其起病急、發(fā)展迅速,若未及時治療,極易形成角膜潰瘍,嚴(yán)重時可致盲。

假單胞菌的角膜感染與隱形眼鏡的使用有關(guān),在隱形眼鏡出現(xiàn)之前很少被報道為一個問題。其菌毛與鞭毛以及細(xì)胞表面的疏水性都可以幫助其隱形眼鏡的黏附[47]。一些研究報道了使用戴隱形眼鏡的動物模型來研究隱形眼鏡相關(guān)的微生物角膜炎的發(fā)病機(jī)制,例如建立銅綠假單胞菌性角膜炎兔模型,研究中性粒細(xì)胞浸潤和嚴(yán)重程度的關(guān)系[48],銅綠假單胞菌性角膜炎大鼠模型研究細(xì)胞因子和趨化因子的變化[49]。但這些動物模型有一些局限性,兔需要眼瞼閉合或立膜手術(shù)來保留眼鏡[48],大鼠盡管反復(fù)進(jìn)行細(xì)菌接種,但沒有發(fā)生或低水平明顯的微生物性角膜炎[49]。Metruccio 等[50]成功地建立了小鼠隱形眼鏡佩戴模型,該模型在小鼠身上忠實地復(fù)制了幾種與晶體相關(guān)的現(xiàn)象。通過佩戴隱形眼鏡感染銅綠假單胞菌的小鼠模型,發(fā)現(xiàn)其與人類配戴隱形眼鏡時對機(jī)會性微生物的感染風(fēng)險是一致的。還發(fā)現(xiàn)在其他健康的角膜中,未接種銅綠假單胞菌的隱形眼鏡佩戴可導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞募集的副炎癥反應(yīng)發(fā)生,這一反應(yīng)依賴于MyD88 和IL-1R。除此之外多種動物模型已被運(yùn)用。例如,Pinnock 等[29]發(fā)現(xiàn),角膜基質(zhì)注射法和角膜損傷法相比,前者角膜感染后表面覆蓋的細(xì)菌更多,而兔和人的角膜感染結(jié)果相似,在感染24 或48 h 后測定菌落形成單位(CFU),盡管每種模型的細(xì)菌和處理技術(shù)存在差異,但CFU 的變化很小。與Pinnock 等[29]人的觀點(diǎn)一致,Okurowska 等[51]采用兩種不同菌株的銅綠假單胞菌,證實了在體外感染的豬和兔的角膜24 h 后,細(xì)菌活細(xì)胞計數(shù)沒有顯著差異。這些動物模型已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌性角膜炎諸多的研究。

當(dāng)銅綠假單胞菌粘附于宿主表面時,細(xì)菌可以向胞外分泌粘性物質(zhì),將形成的微菌落包裹,逐漸形成生物膜[52]。生物膜除了可以牢固粘附于宿主細(xì)胞表面之外,還可以分泌胞外聚合物和毒力因子,不但使生物膜具有自身的空間結(jié)構(gòu),保護(hù)細(xì)菌免受宿主的免疫攻擊,還能改變菌體結(jié)構(gòu)或表型,逃避免疫識別。生物膜特異性免疫逃避的機(jī)制包括機(jī)械保護(hù)、屏蔽免疫識別、改變基因表達(dá)和抑制免疫細(xì)胞功能[53-55]。

銅綠假單胞菌能夠分泌至少7 種不同的蛋白酶,其中一些在角膜炎的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮潛在作用。例如基質(zhì)金屬蛋白酶,特別是彈性蛋白酶B(Las B)和堿性蛋白酶(AP),在角膜炎中起著相當(dāng)重要的作用,因為將Las B 注射到角膜基質(zhì)中會導(dǎo)致嚴(yán)重的角膜損傷。銅綠假單胞菌小蛋白酶(PASP)能夠破壞膠原蛋白,其是角膜基質(zhì)的主要構(gòu)成部分,因此PASP 可能在角膜損傷中發(fā)揮重要作用。將純化的PASP 注射到兔角膜中,會導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞的破壞,并可進(jìn)一步損傷基質(zhì)[56]。

Cole 等[57]證明IL-6 在銅綠假單胞菌感染的角膜組織中快速上調(diào),IL-6 基因缺陷型小鼠與野生型相比,病程延長,炎癥反應(yīng)更重,預(yù)后更差。IL-1、IL-6 等可以趨化多核中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear,PMN)向病變部位集中,募集的PMN 浸潤于感染角膜,引起炎癥反應(yīng)以清除細(xì)菌。機(jī)體抵抗銅綠假單胞菌的特異性免疫主要是由CD4+T 細(xì)胞介導(dǎo)。在相關(guān)的研究中表明,傾向于Th1 型反應(yīng)的C57BL/6小鼠角膜感染PA 后在感染早期即可出現(xiàn)角膜混濁,角膜基質(zhì)及前房有大量炎性細(xì)胞浸潤,病情較重、發(fā)展迅速,極易導(dǎo)致角膜穿孔。BALB/c 小鼠更傾向于Th2 型反應(yīng),感染后比C57BL/6 小鼠的病程更長,但角膜潰瘍或穿孔的發(fā)生率卻明顯更低[58]。因此Th1 和Th2 型免疫應(yīng)答的促炎與抗炎平衡對角膜炎的病程發(fā)展起到重要作用。

3.2 金黃色葡萄球菌感染及動物模型

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是細(xì)菌性角膜感染的常見原因,其進(jìn)展迅速,導(dǎo)致角膜瘢痕形成、穿孔和嚴(yán)重的視力喪失。它在免疫功能低下、糖尿病和艾滋病患者中更常見,使用隱形眼鏡的人也更容易出現(xiàn)這種問題[59]。

Hume 等[60]建立金黃色葡萄球菌感染角膜炎小鼠模型,研究表明葡萄球菌蛋白酶通過增加纖維連接蛋白的結(jié)合而增加了角膜細(xì)胞的粘附和侵襲,其抑制對金黃色葡萄球菌在角膜炎中的致病性有顯著影響。不同動物的感染模型具有其局限性。例如,使用間質(zhì)內(nèi)注射細(xì)菌的兔角膜炎模型技術(shù)簡單、可控,重復(fù)率高[61],但該模型并沒有復(fù)制人類細(xì)菌性角膜炎的發(fā)展過程,而且它繞過了感染過程中的重要步驟；與人類的感染不同,一些小鼠模型無需治療就能清除感染。對小鼠角膜上皮進(jìn)行清創(chuàng)后接種細(xì)菌[59],也不是人類角膜在感染前受損的最精確模型,除非有化學(xué)或機(jī)械創(chuàng)傷造成的大傷口。迄今為止,劃痕模型的假單胞菌和金黃色葡萄球菌角膜炎研究中使用的模型相似[62],與人類角膜炎發(fā)生的情況非常接近。

使用角膜炎兔模型最重要的發(fā)現(xiàn)是金黃色葡萄球菌分泌的α-溶血素是導(dǎo)致疾病嚴(yán)重程度的主要細(xì)菌毒力因子,α-溶血素免疫對金黃色葡萄球菌角膜炎具有保護(hù)作用[63]。兔角膜注射純化α-毒素可引起角膜和虹膜顯著的、劑量依賴的炎癥反應(yīng)[64]。這些結(jié)果在角膜劃痕術(shù)后的小鼠角膜炎模型中得到了證實。Putra 等[59]在體外使用劃痕試驗和體內(nèi)使用小鼠上皮清創(chuàng)模型證實了金黃色葡萄球菌對角膜上皮傷口愈合的抑制作用很大程度上歸因于α-溶血素。結(jié)果表明,金黃色葡萄球菌定植的患者更容易出現(xiàn)角膜上皮傷口愈合延遲,而α-溶血素是這一過程的主要因子。在建立的小鼠金黃色葡萄球菌角膜炎也證實金黃色葡萄球菌的侵襲力依賴于α-溶血素。此研究中使用的感染模型涉及角膜上皮細(xì)胞的徹底清創(chuàng),以促進(jìn)細(xì)菌侵入基質(zhì)。金黃色葡萄球菌相關(guān)α-溶血素導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞溶解暴露底層基質(zhì),增加中性粒細(xì)胞密度。細(xì)菌性角膜炎的角膜浸潤是中性粒細(xì)胞的聚集,其聚集是為了清除入侵的病原體及其抗原。主要是浸潤的白細(xì)胞、角膜組織和角膜緣血管內(nèi)皮之間的細(xì)胞間連接決定了中性粒細(xì)胞的募集[65]。

在動物研究中,中性粒細(xì)胞快速募集是通過激活感染部位的Th1 細(xì)胞來驅(qū)動宿主的先天免疫應(yīng)答。中性粒細(xì)胞長期募集可能會觸發(fā)細(xì)胞外溶酶體酶的釋放,從而導(dǎo)致角膜進(jìn)一步損傷。巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2(MIP-2),也被稱為CXCL2,是一個強(qiáng)有力的嗜中性粒細(xì)胞化學(xué)誘導(dǎo)物?；蚯贸?gene knockout)和轉(zhuǎn)基因小鼠角膜感染過程中炎癥介質(zhì)的恢復(fù)表明,許多受體例如CXCR2,TLR4,TLR9 與IL-1β 蛋白共同介導(dǎo)MIP-2 的釋放和活性[66]。例如,在小鼠研究中發(fā)現(xiàn),CXCR2 受體與MIP-2 結(jié)合是必要的,可以有效地使中性粒細(xì)胞趨化并滲出到金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌角膜炎的部位[67-68]。盡管在CXCR2 敲除小鼠的角膜感染后MIP-2 水平高,中性粒細(xì)胞仍局限于外緣區(qū)域。CXCR2 的缺失破壞了MIP-2 驅(qū)動的中性粒細(xì)胞遷移到感染部位,阻礙了細(xì)菌清除,導(dǎo)致角膜炎進(jìn)展甚至穿孔[67-68]。

4 總結(jié)與展望

所有的角膜炎動物模型都有其局限性。兔和小鼠,已經(jīng)被證明是研究微生物性角膜炎的有用模型。然而,當(dāng)使用具有不同于人類特征的物種時,也存在一些缺點(diǎn)。大多數(shù)用作模型的小鼠都是近交系,其優(yōu)點(diǎn)是保證實驗的一致性；然而,近交系動物并不像遠(yuǎn)交系動物能真實代表人類的癥狀。各種實驗動物和人類的解剖特征、組織組成和眼部成分的各種功能差異明顯。例如,人類的角膜直徑約為11 mm,而兔和小鼠的角膜大小分別為13 mm 和2.2～3.5 mm[69-70]；人類角膜厚度比兔和小鼠更大；人類眨眼的時間間隔大約是2.8 s,而兔和小鼠眨眼的時間間隔超過30 s[69]；兔有瞬態(tài)膜,而人類和小鼠沒有；兔、小鼠和人類的角膜膠原蛋白[69]和角膜上皮細(xì)胞[71]的排列方式不同,這可能導(dǎo)致角膜對入侵的病原體產(chǎn)生不同的反應(yīng)。同樣,人類的角膜上皮基膜是由纖維組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),類似于鳥窩,而兔的角膜上皮基膜是直而平的。所有這些解剖上的差異,以及眨眼間隔時間,都對細(xì)菌粘附和可能的入侵、對細(xì)菌酶和其他毒力因子的易感性以及淚膜中宿主防御分子的可利用性有影響。由于它們是嚙齒類動物,在進(jìn)化上與靈長類動物距離較遠(yuǎn),在免疫方面也存在差異,因此在感染和發(fā)病機(jī)制上與人類顯著不同[72-73]。

即便如此,大多數(shù)動物模型都能提供有用的信息。動物模型不僅讓我們了解了啟動感染的過程,而且還有助于研究宿主對感染的免疫反應(yīng),這是細(xì)胞或組織培養(yǎng)模型中缺失的一個重要角色[74]。通過開發(fā)和使用與生理更相關(guān)的模型,并接近病原微生物感染人眼的環(huán)境和機(jī)制,將促進(jìn)對疾病的發(fā)生發(fā)展有更全面的理解。

尋找一種接近人類但成本效益適中的合適動物作為疾病研究的模型是一項長期追求的任務(wù)。由于非人靈長類模型成本太高,難以進(jìn)行大規(guī)模的模型建立。所以在非人靈長類動物中尋找到一種合適的、且成本較低的動物模型是十分重要的。小鼠的角膜較小,且結(jié)構(gòu)與人類角膜存在差異,但是由于近年來轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)展迅速,可以用其對某些特定的因子進(jìn)行研究,這個是其他的動物模型難以替代的優(yōu)點(diǎn)。并且我們常用的BALB/c 小鼠對細(xì)菌感染的敏感性較好,可以作為細(xì)菌性角膜炎良好的實驗動物模型[75]。而在真菌感染導(dǎo)致的角膜炎中,兔模型和實際情況感染中的人表現(xiàn)出了相同的癥狀,具有較好的參考價值。而且由于兔角膜相對于小鼠較大,易于觀察其病變情況,所以在真菌感染角膜炎模型的建立中,兔模型有其獨(dú)有的優(yōu)勢[30]。而目前角膜炎動物模型中,樹鼩模型得到了更多的關(guān)注。樹鼩是我國自主研發(fā)的實驗動物新品種,在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上比嚙齒動物更接近靈長類動物[76]。樹鼩有一個非常發(fā)達(dá)的視覺系統(tǒng),它的視覺功能與人類相似。從解剖學(xué)上講,樹鼩角膜的5層結(jié)構(gòu)(角膜上皮層,前彈力層,基質(zhì)層,后彈力層和角膜內(nèi)皮層)、角膜厚度和形態(tài)排列等與人類的極為相似,相似率接近98%[77],相比非人靈長類動物價格昂貴、繁殖周期長、研究周期長等原因,樹鼩是研究角膜炎、近視弱視等視覺系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制與治療研究的理想適合的動物。