某區(qū)人乳頭瘤狀病毒基因型的分布研究

李春燕（云南省楚雄彝族自治州人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，云南 楚雄 675000）

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某區(qū)人乳頭瘤狀病毒基因型的分布研究

李春燕
（云南省楚雄彝族自治州人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，云南 楚雄 675000）

【摘要】目的 了解楚雄地區(qū)女性人群人乳頭狀瘤病毒（HPV）基因型在宮頸疾病中的感染狀況及其分布特點(diǎn)。方法 采用PCR-反向點(diǎn)雜交法對2013年12月至2014年3月在楚雄州人民醫(yī)院婦科就診的1936例女性患者進(jìn)行23種HPV（低危型6、11、42、43、81，高危型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、53、66、73、82、83）基因型的分型檢測，分析常見感染亞型和分布特點(diǎn)。結(jié)果 研究人群HPV感染總陽性率為18.8%，常見的5種高危型為52、58、16、53、51；常見的2種低危型為81、42。單重感染的比例為87.3%，多重感染的比例為12.7%。結(jié)論 楚雄地區(qū)HPV感染亞型有獨(dú)特的區(qū)域分布特點(diǎn)，HPV 52和58型有相當(dāng)高的流行率，值得重視。

【關(guān)鍵詞】人乳頭狀瘤病毒；宮頸癌；基因分型 ；PCR；雜交

宮頸癌是婦科腫瘤中僅次于乳腺癌的第二大惡性腫瘤［1］，人乳頭狀瘤病毒已明確為宮頸癌的病因［2-3］，HPV感染檢測也因此成為宮頸癌篩查的必不可少的內(nèi)容。HPV是一種小分子雙鏈DNA病毒，按其基因型序列的多態(tài)性可分為100多型，根據(jù)不同基因型與癌分生危險(xiǎn)性高低又可分為：低危型HPV，如6、11等，常引起外生殖器濕疣、宮頸上皮內(nèi)低度病變（CIN1）等良性病變；高危型HPV，如16、18等，與宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)高度病變（CIN2/3）的發(fā)生相關(guān)［4］。但中國各地區(qū)宮頸癌中HPV感染及型別分布情況可能存在較大差異。為了解楚雄地區(qū)HPV感染的基因型分布，對1936例婦科患者進(jìn)行了HPV感染分型檢測，報(bào)道如下。

l 材料與方法

1.1 研究對象：2013年12月至2014年3月到楚雄州人民醫(yī)院婦科就診的女性患者1936例，受檢者年齡16～74歲，平均年齡37.7歲。

1.2 試劑與儀器：采用PCR體外擴(kuò)增和DNA反向點(diǎn)雜交相結(jié)合的DNA芯片技術(shù)。利用HPV的基因特點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物，可以擴(kuò)增出23種HPV基因型的目標(biāo)片段，再將擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在膜條上的包括18種高危型和5種低危型在內(nèi)的分型探針進(jìn)行雜交，依據(jù)雜交信號的有無來判斷是否有這些HPV基因型的存在。試劑：人乳頭瘤病毒基因分型檢測試劑盒（深圳亞能生物技術(shù)有限公司），可檢測23種HPV基因型別，包括18種高危型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、53、66、73、82、83型；5種低危型：6、11、42、43、81型。儀器：HEMA9600擴(kuò)增儀及YN-H16恒溫雜交儀。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本取樣與要求：利用專用采樣器對就診女性患者進(jìn)行宮頸脫落細(xì)胞的取樣，放入細(xì)胞保存液中送檢，4 ℃保存，2 d內(nèi)檢測。

1.3.2 HPV-DNA提取：利用試劑盒提取DNA，具體操作步驟詳見說明書。

1.3.3 PCR擴(kuò)增：采用HEMA9600擴(kuò)增儀按照以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：50 ℃15 min，95 ℃ 10 min，94 ℃ 10 s、42 ℃ 90 s、72 ℃ 30 s擴(kuò)增10個循環(huán)，94 ℃ 10 s、46 ℃ 60 s、72 ℃ 20 s擴(kuò)增30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

1.3.4 雜交顯色：打開YN-H16恒溫雜交儀，預(yù)熱至51 ℃。取出標(biāo)記有23種HPV基因型寡核苷酸探針基因芯片的膜條，在膜條編號區(qū)標(biāo)上與PCR反應(yīng)液相對應(yīng)的編號及陽性對照和陰性對照。按順序分別放入雜交管中，然后加入6 mL A液。把對應(yīng)編號的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物依次全部加入到雜交管中，擰緊管蓋，放入沸水浴中煮沸10 min，且確保A液液面完全位于沸水液面之下。沸水浴完成后，取出雜交管，放入雜交儀中雜交不少于1.5 h，完成后進(jìn)行膜條酶標(biāo)顯色。具體操作步驟詳見試劑盒說明書。

1.3.5 結(jié)果判定：肉眼觀察檢測結(jié)果，陽性點(diǎn)呈現(xiàn)藍(lán)色圓點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)的每張膜條在IC位點(diǎn)必須出現(xiàn)藍(lán)色雜交信號；陰性對照除IC位出現(xiàn)雜交信號外其余位點(diǎn)均不出現(xiàn)雜交信號；陽性對照必須在相應(yīng)的HPV基因型位點(diǎn)出現(xiàn)雜交信號。根據(jù)膜條上顯色位點(diǎn)判讀相應(yīng)的HPV基因型，記錄結(jié)果后把膜條裝至密封袋中掃描，最后放入4 ℃保存。

2 結(jié) 果

2.1 共檢測到23種基因型，其中陽性例數(shù)363例，陽性率為18.8% （363/1936）。高危型中的73、82型僅各占1例。見表1。

2.2 各亞型感染率見表1，分布從高到低依次為52型、58型、81型、16型、53型、42型、51型、43型、39型、18型、56、66型、68、6型、33、59型、35、11型、45型、31型、83型、73、82型。

表1 HPV各基因型陽性率

2.3 單重感染人數(shù)317例（87.3%），多重感染人數(shù)46例（12.6%）。低危感染人數(shù)67例（18.5%），高危感染人數(shù)250例（68.9%），混合感染人數(shù)46例（12.7%）。

3 討 論

宮頸癌是嚴(yán)重威脅婦女生命健康的惡性腫瘤，近年來呈年輕化趨勢［5］。大量的流行病學(xué)資料和相關(guān)研究證實(shí)，HPV是引起宮頸癌及癌前病變的主要原因，其感染檢測已成為宮頸癌防治中必不可少的篩查內(nèi)容。國外宮頸癌HPV感染以HPV16和18亞型為主 ，而我國在HPV型別及感染率上與國外存在較大差異，且國內(nèi)不同地域之間亦有差異。吳玉萍等［6］報(bào)道，江西省宮頸癌患者主要感染 HPV亞型依次為16、58、33、31型；趙健等［7］對北京地區(qū)3086例患者篩查 HPV陽性率為63.1%，最常見亞型為 HPV16、58、52、33、53、6和CP8304型；蔣衛(wèi)平等［8］調(diào)查浙江麗水地區(qū)365例婦科患者HPV陽性率為49.6%，前5位HPV基因型依次為16、52、58、33、53型，未發(fā)現(xiàn)43及35型。根據(jù)上述結(jié)果可見，國內(nèi)報(bào)道HPV16型感染率最高，其次為58型，其他型別的HPV感染率存在較大地區(qū)差異，其中HPV18和45型在國內(nèi)報(bào)道中感染率均較低，而其分別在歐美和非洲西部較常見。本研究發(fā)現(xiàn)，楚雄地區(qū)檢出 HPV最常見型別依次為高危型 52（16.8%）、58（12.9%）、16（10.7%）、53（9.9%）、51（8.0%）。低危型81 （11.0%）、42（8.8%），其余亞型感染率均低于8%。表明楚雄地區(qū)HPV型別及感染率與國內(nèi)其他地區(qū)存在較大差異，HPV52和58型有相當(dāng)高的流行率，國內(nèi)常見的HPV16型位居第三，HPV18型則較少見，僅5.5%。低危型以HPV81和42型較常見，6型、11型感染率相對較低。也進(jìn)一步證明即使同種族人群 ，HPV感染的基因型也存在明顯的人群和地域特點(diǎn)。

由于目前檢測樣品數(shù)量的限制，在HPV型別的分布上存在著一定的偏差。但是隨著工作的進(jìn)一步進(jìn)行，將會得到較完善的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，對楚雄地區(qū)一般人群及高危人群的HPV型別有比較明確的了解。本研究為HPV感染的進(jìn)一步預(yù)防和治療作出了有益的參考，為HPV疫苗的研制和應(yīng)用提供有力的分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)。

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［7］ 趙健 ，楊英捷，廖秦平.導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)在人乳頭狀瘤 病毒感染分型檢測中的臨床應(yīng)用 ［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，29（12）：1148-1151.

［8］ 蔣衛(wèi)平，丁茂文，張曉梅，等.浙江省麗水地區(qū)婦科患者21種人乳頭狀瘤病毒感染狀況分析［J］.浙江醫(yī)學(xué)雜志，2009，31（9）：1323-1324.

中圖分類號：R737.33

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1671-8194（2016）16-0008-02

A Region Human Papilloma Virus Genotype Distribution Research

LI Chun-yan
（Department of Medical Laboratory， Chuxiong Yi Nationality Autonomous Prefecture People's Hospital， Chuxiong 675000， China）

［Abstract］Objective Understanding of chuxiong region women Human papilloma virus（HPV）genotypes infection status in cervical disease and its distribution characteristics. Methods By the method of PCR to reverse hybridization， in December 2013， the current conditions are， in March 2014， the people's hospital of department of gynaecology clinic of 1936 female patients with 23 kinds of HPV （low-risk type 6， 11， 42， 43， 81， high-risk HPV16， 18， 31，33， 35， 39， 45， 51， 52， 56， 58， 59， 68， 53， 66， 73， 82， 83） genotype classification test， analysis of common subtype infection and distribution characteristics. Results The study population HPV total positive rate was 18.8%， the common type 5 kinds of high-risk for 52， 58， 16， 53， 51； Common two low-risk type of 81， 42. The single infection ratio of 87.3%， Multiple infections proportion was 12.7%. Conclusion HPV infection subtype chuxiong region are the unique characteristics of regional distribution， HPV type 52 and 58 have quite high prevalence rate， worthy of attention.

［Key words］Human papilloma virus（HPV）； Cervical cancer； Genotyping； PCR； The hybrid translation