絲裂原活化蛋白激酶信號通路在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用研究進(jìn)展

馬雪雯，張 晗，李 霖，鄧雁如，房士明，

（天津中醫(yī)藥大學(xué)1.方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，累及人體多處關(guān)節(jié)，表現(xiàn)為對稱性關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、畸形甚至殘疾，嚴(yán)重時可能引發(fā)肺炎、泌尿系統(tǒng)感染和心臟疾病等并發(fā)癥。據(jù)統(tǒng)計，1980-2019年，全球RA的年患病率為0.46%，造成嚴(yán)重的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。RA發(fā)病主要由遺傳、自身免疫和環(huán)境等因素共同作用，絕經(jīng)后婦女發(fā)生率顯著高于同齡男性[2]。RA的病理學(xué)特征為炎癥細(xì)胞浸潤引發(fā)的持續(xù)性滑膜組織炎癥和增生，異常增生的滑膜組織逐漸對軟骨組織進(jìn)行侵襲造成軟骨組織侵蝕和損傷[3]。

RA發(fā)病期間，巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等免疫細(xì)胞大量進(jìn)入滑膜組織，并分泌白細(xì)胞介素（interleukin，IL）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和轉(zhuǎn)化生長因子 β1等促炎因子。促炎因子作用于成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS）造成FLS異?；罨⒋碳て浞置诖罅扛蓴_素、集落刺激因子、生長因子和趨化因子，進(jìn)而使FLS進(jìn)一步活化并過度增殖。FLS過度增殖后向關(guān)節(jié)組織侵襲，加劇RA關(guān)節(jié)滑膜炎癥和基質(zhì)損傷[4]。FLS異常激活后高表達(dá)的整合素是介導(dǎo)FLS向軟骨組織侵襲的重要分子。整合素通過與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中的膠原蛋白和層粘連蛋白等結(jié)合，促進(jìn)FLS增殖并向軟骨組織遷移和侵襲。異?；罨腇LS誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）過度表達(dá)，水解ECM加重關(guān)節(jié)損傷[5-6]。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是真核細(xì)胞內(nèi)一組高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，參與調(diào)控細(xì)胞的有絲分裂、分化、增殖和凋亡以及炎癥反應(yīng)等過程。哺乳動物MAPK家族主要存在3條經(jīng)典途徑：P38途徑、c-Jun N端蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）途徑和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）途徑。MAPK信號通路的基本組成模式是三級激酶模式，包括MAPK激酶激酶（MAPK kinase kinase，MAPKKK），MAPK激酶（MAPK kinase，MAPKK）和MAPK，不同途徑可由不同生長因子和細(xì)胞因子結(jié)合相應(yīng)受體依次活化細(xì)胞內(nèi) MAPKKK，MAPKK和 MAPK。不同的MAPK蛋白激活不同的轉(zhuǎn)錄因子完成各自的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，P38 蛋白有 4 個亞型 P38α，P38β，P38γ和P38δ；JNK蛋白有3個亞型JNK1，JNK2和JNK3；ERK蛋白有3個亞型ERK1，ERK2和ERK5。MAPK信號通路的各亞型通路間不僅能夠獨(dú)立完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，還可以通過復(fù)雜的機(jī)制聯(lián)系發(fā)揮協(xié)同或拮抗作用。

MAPK信號通路與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來研究者從藥理學(xué)、免疫學(xué)和遺傳學(xué)等角度開展了大量研究，探索以MAPK信號通路為靶點(diǎn)治療RA的可能性[8]。Liu等[9]總結(jié)了MAPK，NF-κB和磷脂酰肌醇3激酶/Akt激酶等信號通路分別在RA發(fā)病機(jī)制中的作用。Dudics等[10]綜述了當(dāng)前臨床治療藥物和天然產(chǎn)物治療RA不同的作用機(jī)制，并總結(jié)了不同藥物在治療過程中的特點(diǎn)。本文綜述MAPK信號通路在RA發(fā)病中的作用研究進(jìn)展，對RA靶向治療具有重要意義。

1 MAPK信號通路活化促進(jìn)FLS增殖和遷移

持續(xù)性的滑膜炎癥是RA發(fā)病過程中的主要特征，異常激活的MAPK蛋白導(dǎo)致滑膜細(xì)胞產(chǎn)生異常增殖和侵襲是造成滑膜炎的重要原因之一?；ぜ?xì)胞主要有滑膜巨噬細(xì)胞和FLS 2種。正常狀態(tài)下，F(xiàn)LS可分泌滑液為組織提供營養(yǎng)；RA發(fā)病狀態(tài)下，MAPK信號通路被細(xì)胞因子激活，造成FLS增殖并刺激FLS分泌促炎因子，其后FLS向關(guān)節(jié)軟骨侵襲，從而形成滑膜炎癥，加重滑膜組織增生和軟骨組織損傷[11]。

1.1 促進(jìn)FLS增殖

RA滑膜內(nèi)巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-1等炎癥因子可激活MAPK通路中一條或多條亞型通路，導(dǎo)致FLS增殖。羅素等[12]采用TNF-α 10 μg·L-1誘導(dǎo)P38和ERK蛋白磷酸化進(jìn)而活化FLS，大黃素（emodin）可濃度依賴性地抑制ERK1，ERK2和P38的核移位及蛋白表達(dá)，從而抑制ERK1/2和P38信號通路活化，抑制FLS增殖，有效控制RA滑膜炎進(jìn)程。Li等[13]研究MAPK信號通路間的“cross talk”，采用JNK抑制劑SP600125抑制JNK蛋白時，P38和ERK蛋白表達(dá)同時被抑制；且當(dāng)P38，JNK和ERK蛋白被抑制后，抑炎因子IL-4和轉(zhuǎn)化生長因子β1表達(dá)升高及促炎因子干擾素γ和IL-17表達(dá)降低，F(xiàn)LS增殖水平下調(diào)，滑膜增生和炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕。

音猬因子（sonic hedgehog，SHH）信號通路與MAPK信號通路在共同促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖中存在密切聯(lián)系。研究表明，SHH信號通路依賴G蛋白偶聯(lián)受體 smoothened（SMO）參與 FLS 增殖[14]。MAPK信號通路作為細(xì)胞信號下游傳遞者接受SHH通路信號傳遞，共同促進(jìn)FLS增殖。Zhu等[15]報道，SMO激動劑（SMO agonist，SAG）處理FLS后，JNK蛋白表達(dá)顯著升高；SMO抑制劑環(huán)巴胺（cyclopamine）處理后，JNK蛋白表達(dá)顯著降低；而JNK抑制劑SP600125對SAG刺激的FLS中JNK蛋白高表達(dá)具有抑制作用。提示SHH信號通路與JNK信號通路間存在信號傳遞。FLS經(jīng)SAG處理后增殖、遷移和侵襲加重，而經(jīng)SP600125處理后FLS增殖、遷移和侵襲減弱，表明JNK蛋白是SHH信號通路介導(dǎo)FLS增殖和遷移的下游分子。上述研究結(jié)果表明，SHH信號通路中的SMO蛋白在FLS活化中發(fā)揮重要作用，可能是防治RA的潛在靶點(diǎn)。

RA發(fā)展過程中脂質(zhì)代謝紊亂持續(xù)存在，脂質(zhì)分子與受體蛋白結(jié)合后可直接激活Ras同源基因家族（Ras homolog gene family，Rho）成員，進(jìn)而激活MAPK信號通路造成FLS過度增殖，加速RA發(fā)展并增加心血管疾病的風(fēng)險。溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）是一種常見的小分子脂質(zhì)，LPA與LPA受體1（LPA receptor 1，LPAR1）結(jié)合可依次激活Ras蛋白和Raf蛋白，進(jìn)而激活MAPK信號通路，促進(jìn)FLS增殖[16]。Wang等[17]報道，與健康者相比，RA患者血漿中LPA和LPAR1均顯著增高，且滑膜組織中FLS過度增殖。RA患者FLS經(jīng)小檗堿（berberine）干預(yù)后，K-Ras和C-Raf表達(dá)下調(diào)，P38和ERK蛋白磷酸化水平下降，表明小檗堿可阻斷LPA介導(dǎo)的P38和ERK信號通路，抑制FLS增殖。

近年來越來越多的研究表明，異常表達(dá)的長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）能夠激活MAPK等多條信號通路調(diào)控炎癥反應(yīng)，參與自身免疫性疾病的發(fā)展[18]。Chen等[19]報道，IncRNA核旁斑點(diǎn)組裝轉(zhuǎn)錄本1（lncRNA nuclear paraspeckle assembly transcript 1，lncRNA NEAT1）在 RA 滑膜中較正?；け磉_(dá)顯著升高，而miR-129和miR-204表達(dá)顯著下降，且RA滑膜中ERK蛋白磷酸化程度明顯升高，F(xiàn)LS增殖水平升高。當(dāng)沉默lncRNA NEAT1后，ERK蛋白活化受到抑制，miR-129和miR-204表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)LS增殖水平降低。上述結(jié)果表明，lncRNA NEAT1可激活ERK信號通路并抑制miR-129和miR-204表達(dá)，進(jìn)而加劇FLS增殖。

1.2 促進(jìn)FLS遷移

FLS不僅具有腫瘤細(xì)胞的過度增殖性，還具有侵襲性，其分泌的整合素作為細(xì)胞表面黏附受體介導(dǎo)其與軟骨ECM黏附。FLS附著在軟骨表面，對軟骨基質(zhì)進(jìn)行侵襲并降解[20]。

FLS與整合素結(jié)合后通過加速其細(xì)胞骨架的F肌動蛋白重組向軟骨組織發(fā)生遷移，其中肌動蛋白應(yīng)激纖維是F肌動蛋白的重要組成部分，RA中FLS的增殖能夠造成肌動蛋白應(yīng)激纖維形成并加速細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Yang等[21]采用雷公藤甲素（triptolide）對FLS進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可特異性抑制JNK蛋白活化，繼而下調(diào)肌動蛋白應(yīng)激纖維的表達(dá)，抑制F肌動蛋白聚合而降低FLS的侵襲能力，同時抑制FLS中MMP-9的分泌，從而減輕軟骨基質(zhì)破壞。

研究表明，MAPK信號通路和Akt信號通路在FLS遷移過程中共同發(fā)揮作用。Du等[22]采用3，3′-二吲哚基甲烷（3，3′-diindolylmethane，DIM）干預(yù)TNF-α誘導(dǎo)的FLS，發(fā)現(xiàn)P38和JNK蛋白磷酸化水平明顯降低，F(xiàn)LS的遷移和侵襲減輕。雖然在TNF-α誘導(dǎo)的FLS中Akt和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of Rapamycin，mTOR）磷酸化水平未明顯增加，但DIM干預(yù)后明顯被抑制，表明DIM可通過抑制Akt/mTOR通路抑制FLS遷移。綜上所述，DIM能夠抑制MAPK和Akt/mTOR信號通路以抑制FLS侵襲和遷移。

2 MAPK信號通路活化促進(jìn)軟骨組織破壞

關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)破壞主要由MAPK信號通路介導(dǎo)的MMP過度分泌所致ECM過度水解以及軟骨細(xì)胞凋亡引起。MMP是一類依賴離子的含鋅內(nèi)肽酶家族，能夠水解ECM中膠原蛋白、彈性蛋白及蛋白聚糖等主要成分[23]。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一細(xì)胞成分且增殖能力有限，其大量凋亡后關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)無單核細(xì)胞對殘留物進(jìn)行分解，殘留物堆積對基質(zhì)中其他成分造成損傷[24]。

2.1 促進(jìn)FLS和軟骨細(xì)胞MMP合成

MMP通常以酶原的形式存在于ECM中，可在表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子以及IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10和巨噬細(xì)胞集落刺激因子等作用下由FLS和軟骨細(xì)胞等合成分泌[25-26]。

MMP-1屬于膠原降解酶，可水解ECM中Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ型膠原，是參與RA軟骨降解中的重要蛋白酶[27]。劉國鈺等[28]報道，TNF-α誘導(dǎo)的FLS中MMP-1表達(dá)水平和JNK蛋白磷酸化水平顯著升高；采用抗風(fēng)濕藥羥氯喹干預(yù)后，MMP-1和JNK蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明羥氯喹可通過抑制JNK信號通路的活化抑制FLS合成MMP-1，減輕關(guān)節(jié)內(nèi)ECM損傷。

活化轉(zhuǎn)錄因子2（activating transcription factor 2，ATF2）因其亞細(xì)胞定位不同，可發(fā)揮轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)或轉(zhuǎn)錄抑制的作用?；罨腜38蛋白可激活A(yù)TF2參與滑膜炎發(fā)展。脂多糖誘導(dǎo)的FLS中P38蛋白磷酸化水平顯著升高，活化的P38蛋白移位入核與下游轉(zhuǎn)錄因子ATF2結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄因子AP-1，AP-1顯著上調(diào)IL-1β和MMP-3表達(dá)。P38蛋白抑制劑SB203580特異性阻斷P38蛋白的表達(dá)后，IL-1β和MMP-3mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)，炎癥反應(yīng)明顯減輕[29]。

卵泡抑素樣蛋白1（follistatin-like protein 1，F(xiàn)STL1）是一種ECM糖蛋白，廣泛表達(dá)于各種器官，參與多種生物學(xué)過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)STL1可作為一種新型的炎癥因子參與炎癥反應(yīng)。Su等[30]報道，F(xiàn)STL1作用于Toll樣受體4，激活NF-κB，MAPK和JAK/STAT3信號通路，誘導(dǎo)MMP-1，MMP-3和MMP-13的表達(dá)，造成ECM的膠原纖維過度水解。因此，F(xiàn)STL1也可作為研究RA的相關(guān)靶點(diǎn)之一。

2.2 促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡

軟骨細(xì)胞凋亡是造成RA關(guān)節(jié)軟骨損傷的重要原因之一。一氧化氮（nitric oxide，NO）和活性氧（reactive oxygen species，ROS）等是引起軟骨細(xì)胞凋亡的主要炎性介質(zhì)[31]。TNF-α等促炎因子通過激活MAPK信號通路誘導(dǎo)上述炎性介質(zhì)產(chǎn)生，激活胱天蛋白酶（caspase）和Fas/Fas-L等凋亡蛋白，造成軟骨細(xì)胞凋亡。

2.2.1 促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成NO

內(nèi)源性NO一般由L-精氨酸經(jīng)誘導(dǎo)型NO合酶（inducible NO synthase，iNOS）催化生成。炎癥因子可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞高表達(dá)iNOS催化產(chǎn)生NO。NO誘導(dǎo)線粒體損傷和胱天蛋白酶活化，促進(jìn)凋亡小體形成，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。

纖連蛋白是正常軟骨基質(zhì)中重要成分，當(dāng)其被水解為具有活性的纖連蛋白片段時可參與誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡[32-33]。Yasuda 等[34]報道，纖連蛋白片段激活P38信號通路上調(diào)iNOS表達(dá)，導(dǎo)致NO含量升高。采用透明質(zhì)酸對其進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸通過與CD44和細(xì)胞間黏附分子1結(jié)合抑制P38信號通路活化，從而抑制iNOS合成，導(dǎo)致NO生成減少，抑制軟骨細(xì)胞凋亡。

2.2.2 促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成ROS

ROS是有氧代謝的副產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，主要包括超氧陰離子自由基、羥基自由基（OH·）、過氧化氫（H2O2）和單線態(tài)氧（1O2）非離子自由基等[35]。ROS在細(xì)胞中蓄積過多引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，繼而激活MAPK等信號通路介導(dǎo)胱天蛋白酶通路活化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[36]。

RA關(guān)節(jié)軟骨中的ROS水平升高是關(guān)節(jié)部位加重?fù)p傷的主要原因。ROS可通過激活MAPK信號通路加劇促炎因子分泌，導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷。Huang等[37]報道，軟骨細(xì)胞經(jīng)地塞米松處理后，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphatase oxidase 4，NOX4）、P38蛋白表達(dá)水平和ROS水平均明顯升高。采用NOX抑制劑乙酰香蘭酮（apocynin）和P38抑制劑SB203580進(jìn)行抑制，發(fā)現(xiàn)P38蛋白、胱天蛋白酶3和NOX4蛋白表達(dá)及ROS水平下降。由此表明，乙酰香蘭酮和SB203580可抑制P38信號通路的磷酸化，下調(diào)胱天蛋白酶表達(dá)，抑制由NOX4導(dǎo)致的ROS水平升高，抑制軟骨細(xì)胞凋亡。

2.2.3 促進(jìn)軟骨細(xì)胞表達(dá)酸敏離子通道

RA患者關(guān)節(jié)滑液在一定程度下呈現(xiàn)酸中毒現(xiàn)象，H+聚集可激活酸敏離子通道（acid-sensing ion channels，ASIC），參與RA發(fā)病過程中的軟骨細(xì)胞凋亡。ASIC又稱H+非電壓門控陽離子通道，是由3個相同或不同的亞基構(gòu)成三聚體形式的離子通道。目前已發(fā)現(xiàn)ASIC存在6個亞基，分別是ASIC1a，ASIC1b，ASIC2a，ASIC2b，ASIC3 和 ASIC4[38]。當(dāng)細(xì)胞外pH下降時，ASIC1a，ASIC2a和ASIC3蛋白異?；罨?。ASIC1a和ASIC3激活Ca2+產(chǎn)生內(nèi)流，激活MAPK等信號通路并進(jìn)一步激活胱天蛋白酶等凋亡基因，參與細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[39-40]。而ASIC2a可抑制Ca2+內(nèi)流從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用[41]。

Zhou等[42]報道，ASIC1a特異性抑制劑狼蛛毒素和ASIC3特異性抑制劑海葵毒素共同作用于ASIC2a過表達(dá)的軟骨細(xì)胞模型時，能夠最大程度地增加對軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。過表達(dá)的ASIC2a通道蛋白可抑制P38和ERK1/2蛋白的磷酸化，一方面上調(diào)Bcl-2和Bcl-xl蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，減少軟骨細(xì)胞凋亡；另一方面降低Ca2+水平亦抑制軟骨細(xì)胞凋亡。上述兩方面的作用可增強(qiáng)ASIC2a通道蛋白對軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。

3 結(jié)語

RA作為一種慢性且難以治愈的自身免疫性疾病一直受到廣泛關(guān)注。RA發(fā)病時會損害人體骨關(guān)節(jié)，嚴(yán)重時還會繼發(fā)肺、心臟等器官損傷。從目前相關(guān)的研究結(jié)果來看，防治RA的途徑主要包括抗FLS增殖、抗炎癥細(xì)胞浸潤、抗新血管和血管翳生成等。目前MAPK信號通路作為調(diào)節(jié)真核細(xì)胞增殖分化的重要途徑在防治RA方面已有深入研究，發(fā)現(xiàn)活化的MAPK蛋白通過激活下游轉(zhuǎn)錄因子，一方面促進(jìn)滑膜細(xì)胞增生和軟骨細(xì)胞凋亡，另一方面導(dǎo)致滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中多種MMP高表達(dá)而過度水解ECM，最終造成關(guān)節(jié)損傷。然而MAPK信號通路的調(diào)節(jié)機(jī)制十分復(fù)雜，還可與Akt和NF-κB等其他信號通路協(xié)同作用。因此，還需深入研究RA中多種信號通路間的交互調(diào)節(jié)機(jī)制，以利于特異高效防治RA新藥的開發(fā)。