小激活RNA在胃腸道腫瘤研究中的應用

王森泰，昝新全，萬岱維，支巧明

（蘇州大學附屬第一醫(yī)院普外科，江蘇 蘇州 215006）

小激活RNA（small activating RNA, saRNA）是21世紀新近發(fā)現(xiàn)的，與小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）具有相似結(jié)構(gòu)，卻能靶向誘導基因表達的短核苷酸雙鏈RNA。與已廣泛應用于細胞體外試驗及動物試驗研究的siRNA相比，saRNA在細胞內(nèi)更穩(wěn)定，saRNA誘導的基因激活（RNA activation, RNAa）作用也更持久。抑癌基因的失活被證明與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[1]，而引人注目的是，自saRNA被發(fā)現(xiàn)以來，許多相關(guān)研究已經(jīng)證明，saRNA能在多種惡性腫瘤中靶向激活抑癌基因的抗腫瘤功效，這說明未來saRNA有希望成為一種具有相當價值的靶向抗腫瘤藥物。胃腸道是與外界直接接觸的器官，是暴露于病原體的主要部位之一，細菌、病毒等病原體對胃腸道黏膜造成的反復損傷，可能誘發(fā)胃腸道組織細胞癌基因或抑癌基因突變，進而發(fā)展為癌癥。由于早期無明顯特異性癥狀，診斷率低，病程進展快，許多胃腸道腫瘤被發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)失去最佳手術(shù)治療時機，甚至已經(jīng)發(fā)生全身廣泛轉(zhuǎn)移，如何在這些病人的治療中選擇合適的藥物及療法，延長生存時間和提高生存質(zhì)量，是胃腸科醫(yī)生面臨的重要挑戰(zhàn)。在本綜述中，我們重點介紹saRNA介導的RNA激活在胃腸道腫瘤研究中的應用進展，旨在為探索胃腸道腫瘤的新治療方式提供新思路。

1 saRNA概述

1.1 saRNA的發(fā)現(xiàn) 早在20世紀60年代，Britten等[2]就提出了激活RNA（activator RNA）的概念，他們認為存在一類只分布于細胞核的RNA，這類RNA能與受體基因（receptor gene）結(jié)合形成序列特異性復合物并誘導生產(chǎn)基因（producer gene）轉(zhuǎn)錄相關(guān)RNA。這一想法與50余年后提出的saRNA激活模型[3]高度契合，然而在當時因為太過超前而沒有引起重視。直到2006年，Li等[4]在E-cadherin，p21和VEGF等多個基因的距離轉(zhuǎn)錄起始點-200～-700 bp的啟動子區(qū)域設(shè)計短雙鏈RNA（double-stranded RNA, dsRNA），意外地發(fā)現(xiàn)這些dsRNA上調(diào)了相應靶基因的表達，他們將這種具有靶向激活靶基因的短核苷酸雙鏈命名為saRNA。幾乎在同一時間，Bethany等[5]也報道了一類能上調(diào)乳腺癌細胞PR基因表達的小分子RNA，他們將其命名為agRNA，同Li等合成的saRNA一樣，他們設(shè)計的RNA結(jié)構(gòu)上也是由兩條長度為21 個堿基，且3'端為2個懸垂的脫氧胸苷的RNA單鏈互補配對而成。與Li等有所區(qū)別的是，這些agRNA的靶序列位于起始位點上或附近。有趣的是，靶向PR基因-11/+8的agRNA在MCF7乳腺癌細胞系中誘導PR基因的表達，在另一種乳腺癌細胞系T47D中PR基因卻被抑制。他們通過染色質(zhì)免疫共沉淀試驗還發(fā)現(xiàn)，PR基因的活化伴隨著組蛋白H3K9和H3K14的乙?；瘻p少以及組蛋白H3K4處的二甲基化和三甲基化增加，這說明agRNA可能是通過改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)來激活基因表達。

1.2 saRNA作用的原理 saRNA是一類非編碼RNA，具有與siRNA相同的結(jié)構(gòu)，但是它們的生物學功能卻完全相反。siRNA可以分別與AGO1、AGO2、AGO3和AGO4四種蛋白結(jié)合以獲得活性，與siRNA不同的是，saRNA只能被特異性地加載到AGO2蛋白上，敲低AGO1，AGO3和AGO4都不會影響saRNA介導的基因激活，而單獨沉默AGO2則消除了saRNA的基因調(diào)節(jié)作用[6]。目前，比較受認可的RNAa基因調(diào)控模型是Li等[7]提出的啟動子靶向的saRNA誘導模型。在該模型中，外源性引入的saRNA被加載到細胞質(zhì)中的AGO2蛋白上。AGO2蛋白通過切割和丟棄其中一條RNA鏈，形成一個活性的AGO2-RNA復合體，這一復合物通過主動轉(zhuǎn)運或被動擴散進入細胞核。如果入核RNA單鏈的互補靶標存在于基因組DNA序列中或仍與DNA相連的反義轉(zhuǎn)錄本序列中，則AGO2-RNA復合物將結(jié)合到該區(qū)域，并進一步招募RNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)酶RHA和CTR9，形成RNA誘導的轉(zhuǎn)錄激活（RITA）復合物[3]。CTR9是PAF1C的一個亞基，PAF1C可通過招募組蛋白修飾酶到RNA聚合酶Ⅱ（RNAP Ⅱ）上引起組蛋白修飾變化，調(diào)控轉(zhuǎn)錄的起始和延伸[8]，而RHA是一種DNA/RNA解旋酶，它可通過招募染色質(zhì)重塑因子和轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)因子來促進轉(zhuǎn)錄[9-10]，同時它具有招募RNAP Ⅱ的作用[11]。RITA復合物與hnRNPs、RNAP Ⅱ和各種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，誘導靶基因表達[3,12]。盡管研究者們?yōu)橥晟芌NAa機制模型做了不懈的努力，但為了更好更有效地將saRNA運用到臨床疾病治療中，更多的RNAa激活機制的細節(jié)仍需要闡明。

1.3 saRNA序列的設(shè)計 盡管saRNA已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)十余年，但該技術(shù)在生物學研究中的應用遠不如siRNA廣泛，一方面是由于對其機制的了解不足，另一方面是學界對其設(shè)計原則尚未統(tǒng)一。不同于siRNA具備完善的商業(yè)化訂購系統(tǒng)甚至是多個操作簡單快捷的序列設(shè)計網(wǎng)站可供選擇，目前仍未有網(wǎng)站支持在線設(shè)計序列，研究者只能借鑒前人的經(jīng)驗不斷地在靶基因啟動子區(qū)碰運氣。Li等[13]提出了12條原則：(1)目標序列從靶基因的正義鏈序列上篩選；(2)與基因正義鏈互補的RNA單鏈命名為引導鏈，靶基因正義鏈的3'端對應于RNA引導鏈的5'端；(3)saRNA靶點選擇在正義鏈轉(zhuǎn)錄起始位點上游-1 200～-200 bp的區(qū)域；(4)每個靶點長度為19 個堿基。由此產(chǎn)生的saRNA雙鏈在每條鏈的3'端具有懸垂的dTdT或UU；(5)靶點堿基的GC含量在40%～65%范圍內(nèi)；(6)不能夠出現(xiàn)連續(xù)4個以上相同的核苷酸；(7)靶點的5'端熱力學穩(wěn)定性高于3'端；(8)第19個堿基是A；(9)第18個堿基是A或T，最好是A；(10)第七個堿基最好是T；(11)第20-23個堿基（靶點的3'側(cè)翼，和saRNA的序列無關(guān)）最好是A或T；(12)選擇目標序列時避開易受DNA甲基化影響的位點，如CpG島、CpG位點和GC富集區(qū)。這些條件里，有些必須滿足，如第12條，有足夠證據(jù)證明DNA甲基化會影響RNAa活性[4]，有些則為非必須條件，在一個基因的啟動子區(qū)里，能同時符合12個條件的靶點很難找到，Li等通過統(tǒng)計加權(quán)得分，對符合較多條件的序列進行進一步的生物學篩選以獲得合適saRNA，篩選時經(jīng)常會出現(xiàn)4、5條序列僅有1條有活性的情況。作為最早發(fā)現(xiàn)saRNA的科研團隊，Li等所提出的規(guī)則看上去簡單而易于執(zhí)行，又較完善而具有一定說服力，后來的研究者多遵循這些規(guī)則去篩選得到他們所需要的saRNA，但也有人嘗試其他的辦法。Voutila等[14]希望設(shè)計出能有效結(jié)合并降解反義轉(zhuǎn)錄本的saRNA，為了識別潛在反義轉(zhuǎn)錄本，他們通過生物信息學方法尋找剪接表達序列標簽（EST），在EST區(qū)域以及另一個經(jīng)常產(chǎn)生反義轉(zhuǎn)錄本的區(qū)域：轉(zhuǎn)錄起始位點周圍（+/-500 bp），運用篩選siRNA的方法去選擇分數(shù)較高的序列。Voutila等同時也給出了篩選反義轉(zhuǎn)錄本層次過濾方法以及saRNA篩選的具體程序，他們的方法較之Li的方法更復雜，具有一定的操作門檻，而且從有效激活比例和基因激活效率上來看，也并沒有比前者更好。同siRNA一樣，saRNA可能引發(fā)脫靶效應，即以序列特異性或非序列特異性的方式誘發(fā)非預期的基因活性。為了避免序列特異性脫靶反應，所設(shè)計的序列還應該進行序列BLAST以避免與人類基因組其他核苷酸序列有顯著同源性。另外，saRNA結(jié)構(gòu)的修飾被證明可以阻斷脫靶效應[15]。

2 saRNA在胃腸道腫瘤研究中的應用進展

2.1 胃癌 胃癌是全球發(fā)病率第五位的惡性腫瘤[16]，同時也是導致癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[17]。許多患者被診斷胃癌時已處于晚期，往往失去了手術(shù)根治的機會，同時又缺乏其他有效的治療手段。隨著靶向治療時代的到來，基因靶向治療胃癌成了近年研究的一大熱點。

腫瘤高甲基化基因1（HIC1）是一種腫瘤抑制基因，編碼一種轉(zhuǎn)錄抑制因子[18]。HIC1在多種上皮來源惡性腫瘤中因為啟動子高甲基化而表達下調(diào)，Rood等[19]認為HIC1的表觀遺傳沉默是這些惡性腫瘤中的關(guān)鍵事件。Pan等[20]在胃癌組織芯片分析中發(fā)現(xiàn)胃癌組織中HIC1的表達較正常胃黏膜組織更低，HIC1下調(diào)同樣也出現(xiàn)在胃癌細胞系中。他們在SGC-7901和NCI-N87兩種胃癌細胞系中轉(zhuǎn)染saRNA dsHIC1-2998，發(fā)現(xiàn)saRNA介導的HIC1表達上調(diào)可抑制胃癌細胞的增殖，誘導細胞周期阻滯及凋亡。這表明，HIC1是胃癌基因治療的一個潛在靶點，而saRNA可以作為胃癌中激活抑癌基因表達的治療選擇。另外，他們篩選出來的具有活性的saRNA所作用的位置距轉(zhuǎn)錄起始點將近3 000 bp，這超出了Li等報道的-1 200～-200 bp范圍，說明了RNAa的確切分子機制還需進行更深入的研究，目前saRNA設(shè)計的原則還有待進一步完善。

VEZT被認為是一種胃癌的抑癌基因，其表達與胃癌的預后相關(guān)[21]，VEZT編碼一種質(zhì)膜蛋白，與E鈣粘蛋白復合物相互作用，在粘附連接中發(fā)揮重要作用[22]。Xie等[23]篩選得到一條可特異性上調(diào)VEZT的saRNA，體外試驗結(jié)果證明了這種saRNA抑制了胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力。為了排除saRNA的脫靶效應，Xie等同時轉(zhuǎn)染能下調(diào)VEZT的shRNA，共轉(zhuǎn)染的saRNA喪失了對胃癌細胞的抑制能力，證明該saRNA是通過上調(diào)VEZT來發(fā)揮抑癌功效。

脯氨酸-谷氨酸-亮氨酸富集蛋白1（PELP1）是雌激素受體α的協(xié)同激活因子，已被證實與多種癌癥，尤其是激素依賴性癌癥的致癌過程直接相關(guān)[24-25]。一些研究人員還確定了PELP1在激素無反應的腫瘤中的致癌功能，Yan等[26]發(fā)現(xiàn)PELP1在胃癌細胞系和臨床胃癌組織中表達升高，他們使用了saRNA嘗試上調(diào)胃黏膜正常上皮細胞系GES-1并且取得成功，saRNA增強了細胞的增殖能力。

2.2 結(jié)直腸癌 結(jié)直腸癌是我國癌癥發(fā)病和死亡的主要原因之一。近年來，隨著物質(zhì)生活水平的逐漸提升和我國居民飲食結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢，發(fā)病年齡越來越年輕[16,27]。盡管近年來對結(jié)直腸癌的治療已取得顯著進步，在一些國家五年總生存率可達65%[28]，晚期結(jié)直腸癌患者的預后仍很差，因此，開發(fā)新型有效的療法是未來結(jié)直腸癌研究的主要方向。

p21基因位于染色體6p21.2上，編碼一種多功能CDK激酶抑制劑，這是一種p53的下游蛋白，可以通過p53依賴途徑和非依賴途徑調(diào)節(jié)細胞周期[29-31]。p21被證明是一種抑癌基因，在肝癌和結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中，p21表達的上調(diào)被證明與抑制腫瘤細胞增殖有關(guān)[32-34]，因此，采用新技術(shù)方法上調(diào)p21對治療多種惡性腫瘤有重要意義。p21-saRNA-322是Li[4]等發(fā)現(xiàn)的一種能有效上調(diào)p21的saNRA，已被證明能有效抑制膀胱癌[35]、前列腺癌[36]、肺癌[37]、肝癌[34]等多種癌細胞的增殖。Wang等[38]研究發(fā)現(xiàn)，在人結(jié)直腸癌細胞系HCT116、HCT116(p53-/-)和HT29中轉(zhuǎn)染p21-saRNA-322后，p21的mRNA和蛋白表達水平明顯上調(diào)，同時癌細胞的增殖受到抑制、凋亡率增加、細胞周期停滯在G0/G1期。進一步的體內(nèi)試驗也證實了p21-saRNA-322抑制結(jié)直腸癌細胞增殖的能力。同一研究團隊的Feng等[39]進一步在體內(nèi)應用p21-saRNA-322，考慮到靜脈注射以及其他給藥方式對核酸藥物的過程損耗，他們開發(fā)了一種含p21-saRNA-322的三元脂質(zhì)體復合物。這種藥物通過陽離子聚合物聚乙烯亞胺（PEI）一方面凝聚saRNA，保護其不被降解，另一方面可促使被攝入細胞內(nèi)的saRNA脫離溶酶體。藥物的另一種成分透明質(zhì)酸可被結(jié)直腸癌細胞膜表面過表達的CD44識別從而提高腫瘤細胞的攝取率，同時降低PEI的細胞毒性。該藥物在CD44表達豐富的Lovo細胞中轉(zhuǎn)染效率較僅含核酸與PEI的二元復合物高。體外實驗表明，它能有效激活p21 mRNA和蛋白的表達，阻斷細胞G0/G1期的細胞周期，抑制癌細胞增殖和集落形成。體內(nèi)分布實驗表明，它能優(yōu)先在直腸壁積累，有效積累長達10 h。進一步的小鼠體內(nèi)試驗[40]將HT29細胞注射到小鼠結(jié)腸黏膜下，熒光結(jié)果顯示藥物成功遞送到腫瘤部位，并且，這種通過直腸給藥的核酸藥物顯著刺激了腫瘤組織中p21的表達，并抑制原位結(jié)直腸腫瘤的生長。

肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1（MALAT1）基因轉(zhuǎn)錄一種長8.1的非編碼RNA（lncRNA），這種lncRNA可以調(diào)節(jié)絲氨酸/精氨酸剪接因子的活性，與多種惡性腫瘤增殖能力的增強有關(guān)[41-43]。由于MALAT1基因長度較長，傳統(tǒng)的表達克隆載體很難高效地轉(zhuǎn)染到細胞中。Yang等[44]首次以RNAa技術(shù)上調(diào)MALAT1表達，并證明了過表達MALAT1顯著促進結(jié)直腸癌細胞體外增殖、侵襲和遷移，以及體內(nèi)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。這表明，作為一種新型的基因調(diào)控技術(shù)，在激活一些較大基因時，saRNA比傳統(tǒng)技術(shù)更具有優(yōu)越性。在另一項結(jié)腸癌抑癌基因VMP1的相關(guān)研究中，Wang等[45]分別用saRNA和VMP1的激活因子GLI3處理HCT116細胞系，發(fā)現(xiàn)無論是對癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響，還是提高細胞對5-FU藥物的敏感性，saRNA都不遜色于GLI3。

目前，最成功的saRNA相關(guān)藥物是MTLCEBPA，這是一種用于治療肝臟腫瘤的藥物，目前已進入1期臨床試驗[46]。轉(zhuǎn)錄因子CEBPA是一種調(diào)節(jié)肝臟穩(wěn)態(tài)的蛋白，CEBPA表達下調(diào)與多種致癌過程有關(guān)，包括細胞周期控制，增殖和血管生成等。Huang等[47]將小鼠結(jié)腸癌細胞系CT26注射到對抗PD-1治療敏感的小鼠中用以構(gòu)建小鼠結(jié)直腸癌模型，然后注射MTL-CEBPA和PD-1抑制劑。MTLCEBPA或PD-1抑制劑單獨處理的動物腫瘤體積差異并無統(tǒng)計學意義，而同時注射PD-1抑制劑和MTLCEBPA組的腫瘤體積明顯小于對照組，說明MTLCEBPA和PD-1抑制劑具有協(xié)同作用。這種關(guān)系在進一步的PCR試驗得到證實：同時注射PD-1抑制劑和MTL-CEBPA的腫瘤組織CEBPA mRNA表達量更高（8.69倍，P＜0.0001）。在聯(lián)合治療組還檢測到免疫基因激活、MDSC抑制基因（IRF4和IRF8）表達增加、MDSC促進基因（COX2）表達減少和血管生成基因減少，說明PD-1抑制劑和MTL-CEBPA協(xié)同治療更好地激活了免疫細胞的活性。

Krüppel樣因子4（KLF4）是一種進化上保守的含鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子[48]，調(diào)節(jié)細胞生長、增殖和分化等多種生物學過程[49]。Zhou等[50]將兩條已經(jīng)在前列腺癌中證實有上調(diào)KLF4活性的saRNA轉(zhuǎn)染到多種結(jié)直腸癌細胞系中，發(fā)現(xiàn)只有其中一種saRNA發(fā)揮了作用，且僅有Caco-2、HCT116和NCM460三種細胞系對該saRNA敏感，這表明了對于不同的細胞系，saRNA具有序列特異性以及細胞特異性，這可能是因為不同細胞系的基因啟動子區(qū)表觀遺傳指紋不同?？梢酝普摰氖?，未來saRNA作為靶向藥物應用于臨床，患者個體間的藥物敏感性可能也大相徑庭，單從另一方面考慮，不同的個體可能對不同序列的saRNA分子敏感，在基因測序更精準以及人類對基因組解讀更精確的大前提下，saRNA有望實現(xiàn)腫瘤個體化精準治療。

3 展望

自saRNA被發(fā)現(xiàn)以來，將這種基因調(diào)控技術(shù)運用到臨床的嘗試就沒有中斷過，在癌癥這類涉及多種抑癌基因下調(diào)的復雜疾病治療方面更是顯示出巨大的希望。相比已被應用到臨床的一些腫瘤輔助治療方法，RNAa是目前少有的能夠有效恢復抑癌基因表達的療法，作用長效的同時又不改變基因組。目前第一種saRNA藥物MTL-CEBPA的臨床試驗已經(jīng)在國外啟動，MTL-CEBPA在肝癌患者的療效已初步獲得肯定，筆者認為，在新的saRNA還未問世之前，還可以嘗試在其他涉及CEBPA下調(diào)的惡性腫瘤研究里開展MTL-CEBPA的應用研究。在未來，隨著人類對RNAa生物學本質(zhì)的理解不斷加深和核酸遞送技術(shù)的進步，我們期待更多治療性saRNA被發(fā)現(xiàn)并應用于人類疾病的治療中，為患者提供更精確的治療。