基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討金鈴子散改善痛經(jīng)的作用機(jī)制*

李夢(mèng)華，田麗穎，2△

1安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230038；2安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院

原發(fā)性痛經(jīng)（primary dysmenorrhea，PD）是一種無盆腔器質(zhì)性病變的痛經(jīng)，也被稱為功能性痛經(jīng)，其表現(xiàn)為月經(jīng)前后或者每個(gè)月經(jīng)期出現(xiàn)下腹肌肉痙攣性痛經(jīng)，嚴(yán)重者還會(huì)伴有頭痛、惡心、嘔吐、腰腿肌肉酸痛。臨床醫(yī)學(xué)研究［1］表明，PD的發(fā)病機(jī)制主要與前列腺素、加壓素、催產(chǎn)素、雌二醇和內(nèi)皮素等有關(guān)，此外，內(nèi)分泌功能失調(diào)也會(huì)導(dǎo)致子宮平滑肌/血管痙攣性收縮，或產(chǎn)生、釋放致痛物質(zhì)引發(fā)痛經(jīng)。目前臨床上西醫(yī)學(xué)主要以口服非甾體抗炎藥和避孕藥治療為主。中醫(yī)藥治療PD方法多樣，療效可靠，且副作用少，外治以針刺治療為主，內(nèi)治以中藥內(nèi)服治療為主，處方用藥多以經(jīng)方為主，主要方劑有四物湯、歸脾湯、溫經(jīng)湯、金鈴子散、四逆散、少腹逐瘀湯加減方等。

金鈴子散出自《素問病機(jī)氣宜保命集》，此書作者為“金元四大家”之一——?jiǎng)⑼晁?。全方組方簡(jiǎn)練，僅由延胡索、川楝子成方，具有疏肝行氣、活血散瘀、瀉熱止痛的功效。常用于肝氣郁結(jié)化火、脾胃氣滯不暢、肝胃不和引起的胸脘及脅腹部位疼痛，還可用于疝氣、月經(jīng)期腹部疼痛等。川楝子苦寒，有小毒，長(zhǎng)于泄氣分之實(shí)熱，以行理氣止痛之功效；延胡索味辛、苦，性溫，長(zhǎng)于行血?dú)庵疁?。二藥配伍，寒溫結(jié)合，理氣行血，具備止痛之功效。金鈴子散的使用歷史悠久，成方精簡(jiǎn)，療效確切，在臨床上應(yīng)用廣泛。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門新興的研究技術(shù)，它將傳統(tǒng)藥理學(xué)中優(yōu)秀的思維模式與現(xiàn)代先進(jìn)技術(shù)及內(nèi)容相結(jié)合，如生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、計(jì)算生物學(xué)及網(wǎng)絡(luò)分析學(xué)等不同學(xué)科，通過構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病-靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)體系，展示藥物復(fù)方的作用機(jī)制［2］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以整體的角度探討藥物與疾病之間的關(guān)聯(lián)及“多成分-多靶點(diǎn)”的作用關(guān)系，與祖國(guó)醫(yī)學(xué)的辨證論治理念和整體觀念殊途同歸［3］。因此，基于上述理論研究，筆者采用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析傳統(tǒng)中藥復(fù)方金鈴子散治療PD的作用靶點(diǎn)，并分析其可能的作用機(jī)制，為金鈴子散治療PD的臨床應(yīng)用及研究提供可靠的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 金鈴子散相關(guān)靶點(diǎn)篩選運(yùn)用中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)［4］（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）尋找金鈴子散的2味中藥化學(xué)組成成分，檢索詞為“延胡索”“川楝子”，設(shè)置ADME屬性為口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug likeness，DL）≥0.18［5］，篩選出2味中藥潛在的有效活性成分，刪除未找到靶點(diǎn)的部分，檢索出與金鈴子散活性成分有關(guān)的潛在靶點(diǎn)。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫［6］（https：//www.uniprot.org/），將物種選定為“human”，查詢各個(gè)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因名稱，并獲得規(guī)范的官方標(biāo)準(zhǔn)名稱。

1.2 PD相關(guān)靶點(diǎn)篩選利用人類基因（Gene-Cards）［7］、在線人類孟德爾遺傳（online mendelian inheritance in man，OMIM）［8］數(shù)據(jù)庫、藥物靶點(diǎn)（therapeutic target database，TTD）數(shù) 據(jù)庫［9］，在數(shù)據(jù)庫中分別輸入關(guān)鍵詞“primary dysmenorrhea”“dysmenorrhea”，檢索與PD相關(guān)的基因靶點(diǎn)，合并獲取的靶點(diǎn)后，去除重復(fù)值得到PD靶點(diǎn)，經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫校正基因名稱。

1.3 構(gòu)建金鈴子散對(duì)PD靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)以及“藥物-疾病”蛋白互作網(wǎng)絡(luò)在R語言中將金鈴子散的藥物相關(guān)靶點(diǎn)與PD疾病靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比分析，取得交集靶點(diǎn)并以韋恩圖展示。進(jìn)而將所獲取的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）獲得PPI網(wǎng) 絡(luò) 模 型［10］，選 定生 物種 類為“Homo sapiens”，設(shè)定為“highest confidence”（0.9），隱藏游離節(jié)點(diǎn)，默認(rèn)其余設(shè)置，提交后得到PPI網(wǎng)絡(luò)。導(dǎo)出包含作用節(jié)點(diǎn)關(guān)系信息的tsv文件，并輸入Cytoscape 3.7.0軟件［11］，構(gòu)建“藥物-疾病”蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO富集和KEGG通路分析將金鈴子散與PD的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入David 6.8數(shù)據(jù)庫［12-13］（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO富集分析，物種選擇為“Homo sapiens”，設(shè)定P值小于0.01，通過David 6.8數(shù)據(jù)庫的功能注釋（functional Annotation）工具對(duì)GO富集分析下的細(xì)胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）進(jìn)行分析。運(yùn)用David 6.8進(jìn)行KEGG通路富集分析，獲得金鈴子散治療PD的相關(guān)生物學(xué)過程和各條關(guān)鍵的作用通路。

1.5 構(gòu)建金鈴子散“活性成分-靶點(diǎn)-通路”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖運(yùn)用Cytoscape 3.7.0軟件對(duì)金鈴子散活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建金鈴子散“活性成分-靶點(diǎn)-通路”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)而分析得出金鈴子散治療PD的關(guān)鍵活性成分、靶點(diǎn)、通路。

2 結(jié)果

2.1 金鈴子散有效活性成分初步篩選出延胡索化學(xué)成分77個(gè)，川楝子化學(xué)成分33個(gè)，經(jīng)吸收、分布、代謝、排泄（absorption，distribution，metabolism，and excretion，ADME）篩選后，獲得延胡索化學(xué)成分49個(gè)，川楝子化學(xué)成分6個(gè)；刪除無對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的部分，最終獲得有效化學(xué)成分54個(gè)見表1。延胡索成分作用靶點(diǎn)1036個(gè)，川楝子成分作用靶點(diǎn)176個(gè)，合并后去除重復(fù)值，得到207個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。

表1 金鈴子散活性成分

2.2 PD相關(guān)靶點(diǎn)通過Genecards數(shù)據(jù)庫獲得痛經(jīng)靶點(diǎn)301個(gè)，PD靶點(diǎn)299個(gè)。設(shè)定Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為痛經(jīng)的潛在靶點(diǎn)，如通過GeneCards所收集PD靶點(diǎn)Score最大值為40.49，因?yàn)樗米钚≈凳?.9，所得中位數(shù)是8.77，所以將Score值設(shè)定為大于8.77，所得靶點(diǎn)即為PD的潛在疾病靶點(diǎn)。聯(lián)系結(jié)合TTD、OMIM、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充完整痛經(jīng)的疾病靶點(diǎn)，合并所有結(jié)果，刪除重復(fù)值，得到683個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 金鈴子散活性成分-PD靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將篩選的金鈴子散活性成分靶點(diǎn)和痛經(jīng)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比，獲得交集靶點(diǎn)，繪制韋恩圖見圖1，得到金鈴子散成分-痛經(jīng)交集靶點(diǎn)59個(gè)。將交集靶點(diǎn)提交至STRING 11.0平臺(tái)，得到金鈴子散靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，下載tsv文件并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件中進(jìn)行拓?fù)浞治龅玫絇PI網(wǎng)絡(luò)圖，圖2。圖中節(jié)點(diǎn)的degree值越大，則面積越大、越接近黃色，表示該節(jié)點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中作用越重要。金鈴子散治療PD的靶點(diǎn)中degree值排名前10的是TP53、VEGFA、AKT1、EGFR、IL6、TNF、FOS、MYC、CCND1、ESR1，表明它們可能是調(diào)治痛經(jīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。見表2。

圖1 金鈴子散藥物成分-痛經(jīng)靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 金鈴子散靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 金鈴子散調(diào)治PD的主要靶點(diǎn)

2.4 GO富集分析將59個(gè)藥物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫David 6.8數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO富集分析，設(shè)定物種為Homo sapiens，P值小于0.01，進(jìn)行GO功能富集分析，其中涉及的生物學(xué)過程（biological process，BP）156個(gè)，主要包括蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)節(jié)、藥物反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)、基因表達(dá)的正調(diào)控、正調(diào)控轉(zhuǎn)錄，DNA模板化、炎癥反應(yīng)、正向調(diào)節(jié)、對(duì)制動(dòng)應(yīng)激的反應(yīng)、胞增殖的負(fù)調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等。涉及分子功能（molecular function，MF）40個(gè)，主要包括酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活序列特異性DNA結(jié)合、類固醇激素受體活性、類固醇結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、氧化還原酶活性、蛋白質(zhì)異二聚活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合等。涉及細(xì)胞組成（cellular component，CC）15個(gè)，主要包括細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞器膜、蛋白質(zhì)復(fù)合體、軸突末端、膜筏、血小板α顆粒管腔、質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)等。根據(jù)P值大小，將顯著性前10的條目進(jìn)行可視化，見圖3。

圖3 GO富集分析

2.5 KEGG富集分析KEGG是包含了細(xì)胞和生物高級(jí)功能的注釋的數(shù)據(jù)庫，包括KEGG路徑圖，BRITE層次結(jié)構(gòu)和KEGG模塊［14］。對(duì)金鈴子散59個(gè)潛在靶點(diǎn)KEGG通路進(jìn)行富集分析共得到85條信號(hào)通路，根據(jù)P值小于0.01，篩選得到53條信號(hào)通路，主要涉及癌癥通路、蛋白多糖與癌癥、癌癥中的MicroRNA、PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等，提示金鈴子散通過多通路、多靶點(diǎn)起到調(diào)治PD的作用。排名前20的信號(hào)通路見圖4。

圖4 KEGG信號(hào)通路富集分析

2.6 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件，構(gòu)建金鈴子散“活性成分-靶點(diǎn)-通路”可視化網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），其中黃色菱形表示的是延胡索的48個(gè)活性成分，綠色橢圓形表示的是川楝子的5個(gè)活性成分，藍(lán)色三角形表示2味中藥共有的1個(gè)相同活性成分，藍(lán)色矩形表示靶點(diǎn)，紅色倒三角形表示信號(hào)通路。通過Cytoscape軟件的NetworkAnalyzer插件分析金鈴子散治療PD網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，得到金鈴子散治療PD的核心成分及核心靶點(diǎn)，按degree值排列。經(jīng)Cytoscape分析顯示，槲皮素quercetin節(jié)點(diǎn)度值（Degree）為302，預(yù)測(cè)槲皮素為金鈴子散治療PD的最主要活性成分，隨后依次為金黃紫堇堿（S）-Scoulerine（Degree值36）、四氫非洲方己堿Isocorypalmine（Degree值35）、羅通定Hyndarin（Degree值32）、獅足草堿leonticine（Degree值32），見圖5。

圖5 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

3 討論

根據(jù)是否有盆腔臟器的器質(zhì)性病理改變可將痛經(jīng)分為兩類，分別為PD和繼發(fā)性痛經(jīng)。PD無盆腔臟器的器質(zhì)性病變，以青少年期多見，多發(fā)生于月經(jīng)初潮后半年到1年內(nèi)，影響女性的正常生活。國(guó)內(nèi)研究顯示，中國(guó)女性痛經(jīng)發(fā)生率為33.1%，其中PD占53.2%，痛經(jīng)嚴(yán)重影響工作者占13.53%［15］。研究中藥對(duì)PD的調(diào)治方法具有重要臨床價(jià)值和意義。我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，痛經(jīng)被稱為“經(jīng)行腹痛”，最早見于《金匱要略·婦人雜病脈證并治》：“帶下，經(jīng)水不利，少腹?jié)M痛，經(jīng)一月再見?！保?6］中醫(yī)藥調(diào)治PD的效果不亞于現(xiàn)代臨床藥物，在緩解疼痛和調(diào)理月經(jīng)方面療效明顯。

本課題利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法初步篩選，得出金鈴子散調(diào)治PD的主要活性成分有槲皮素、金黃紫堇堿、四氫非洲方己堿、羅通定、獅足草堿等。槲皮素是金鈴子散中兩味中藥的共有成分，也是此方劑中對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)最多的活性成分，是一種具有強(qiáng)抗炎能力的長(zhǎng)效抗炎物質(zhì)［17］。有學(xué)者［18］認(rèn)為，槲皮素及其衍生物是炎癥和疼痛管理的有用工具，并提出槲皮素的鎮(zhèn)痛活性是源于其抗炎特性的觀點(diǎn)。

金鈴子散調(diào)治PD主要通過TP53、VEGFA、AKT1、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）發(fā)揮作用。PD的病理生理學(xué)主要與前列腺素（prostaglandin，PG）水平升高有關(guān)［19-20］。TP53編碼的蛋白對(duì)多種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)表達(dá)靶基因，從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期的改變［21］。T細(xì)胞分泌的炎性因子IL-6通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)引起子宮平滑肌缺血缺氧，造成局部炎性反應(yīng)，使宮腔內(nèi)組織壞死導(dǎo)致痛經(jīng)［22］。蛋白激酶B1與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可參與調(diào)節(jié)血管重塑及血管再生的重要過程，在月經(jīng)期AKT1可能有利于修復(fù)子宮內(nèi)膜，或許與AKT1可以促進(jìn)新生血管內(nèi)皮生長(zhǎng)有關(guān)。

根據(jù)GO和KEGG通路富集分析顯示，金鈴子散治療PD主要涉及癌癥通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、P53信號(hào)通路等。KEGG富集結(jié)果表明金鈴子散能通過多通路對(duì)PD起到治療作用。

綜上所述，金鈴子散是通過多靶點(diǎn)多通路起到調(diào)治PD作用的。它主要通過對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)TP53、VEGFA、AKT1、EGFR以及IL6的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)來達(dá)到目的。此外，它還作用于細(xì)胞生物過程，最終作用于炎癥相關(guān)通路（P53、TNF信號(hào)通路），從而抑制前列腺素的合成及相關(guān)的炎性反應(yīng)，減少子宮異常收縮帶來的缺血缺氧、緩解疼痛，達(dá)到對(duì)PD的治療目的。但本研究限于網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫和數(shù)據(jù)軟件分析層面上，后續(xù)需在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上加以驗(yàn)證，以求完善。