干擾素-γ通過調(diào)節(jié)分子伴侶干預(yù)人淋巴細(xì)胞抗原Ⅱ類表達(dá)的機(jī)制

馮星源 王熾華 陳謙 彭萬軍 王素利( 三亞市中醫(yī)院檢驗(yàn)科,海南 三亞 57000; 海南省第三人民醫(yī)院病理科)

人類淋巴細(xì)胞抗原(HLA)基因復(fù)合物是人類基因組中最多變的基因區(qū)域,它控制機(jī)體防護(hù)系統(tǒng)對(duì)病原體產(chǎn)生免疫抵抗作用,該基因復(fù)合物的功能意義主要表現(xiàn)為HLA Ⅰ類和Ⅱ類基因的功能〔1～3〕。HLA 編碼形成Ⅰ類和Ⅱ類肽受體,通過向HLA 異型標(biāo)記的T 細(xì)胞受體提供抗原肽來形成適應(yīng)性免疫應(yīng)答,HLA Ⅱ類糖蛋白和HLA Ⅱ類信號(hào)通路的其他多肽如:不變鏈和HLA-DM,可以在抗原呈遞細(xì)胞(APCs)中發(fā)揮協(xié)同調(diào)控功能〔4〕。HLA Ⅱ類分子與一種Ⅱ型膜蛋白不變鏈相關(guān),Ⅱ型膜蛋白不變鏈具有三種主要的伴侶蛋白功能,首先不變鏈作為同型三聚體與HLA Ⅱ類的3 個(gè)Aβ 異質(zhì)二聚體結(jié)合形成非矩陣結(jié)構(gòu);通過與主要組織相容性抗原(MHC)Ⅱ類溝槽的緊密相互作用,抑制多肽的裝載;不變鏈在其細(xì)胞質(zhì)尾部含有靶向信號(hào),使得非矩陣結(jié)構(gòu)復(fù)合物能夠在溶酶體間隔中傳遞〔5,6〕。通過炎癥細(xì)胞因子干擾素(IFN)-γ 與APCs 上的受體結(jié)合,可以刺激Ⅱ類轉(zhuǎn)錄活化因子基因的活化進(jìn)一步激活HLA Ⅱ類的表達(dá),Ⅱ類轉(zhuǎn)錄活化因子通過與HLA Ⅱ類、不變鏈和HLA-DM 啟動(dòng)子的結(jié)合驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控〔7〕。Ⅱ類轉(zhuǎn)錄活化因子的調(diào)控對(duì)于啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答至關(guān)重要,IFN-γ 對(duì)Ⅱ類轉(zhuǎn)錄活化因子的激活與T 細(xì)胞對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌和病毒感染的應(yīng)答啟動(dòng)一致,Ⅱ類轉(zhuǎn)錄活化因子對(duì)HLA Ⅱ類基因的活化和表達(dá)有重要的影響,被喻為HLA Ⅱ類基因的主控制器。若Ⅱ類轉(zhuǎn)錄活化因子缺乏激活HLA Ⅱ類啟動(dòng)子即裸淋巴細(xì)胞綜合征,導(dǎo)致APCs 細(xì)胞表面無法表達(dá)HLA Ⅱ類啟動(dòng)子,HLA Ⅱ類缺失會(huì)導(dǎo)致機(jī)體對(duì)細(xì)菌感染的反應(yīng)能力受損〔8〕。在不同的APCs 組中,HLA Ⅱ類基因的激活和對(duì)Ⅱ類信號(hào)通路的調(diào)控是可變的,HLA Ⅱ類基因的組織特異性調(diào)控是通過Ⅱ類轉(zhuǎn)錄活化因子基因的細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的,其中大部分位于HLA Ⅱ類地區(qū)〔9〕。與HLA-B 位點(diǎn)相鄰的一組基因的產(chǎn)物被定義為B 相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(BATs),研究發(fā)現(xiàn)〔10〕BAT3 編碼的多肽可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能,并且發(fā)現(xiàn)BAT3 可以調(diào)控HLA Ⅱ類表達(dá),IFN-γ 可以調(diào)控BAT3 轉(zhuǎn)錄,通過促進(jìn)BAT3 和CⅡTA 的核導(dǎo)入,隨后通過轉(zhuǎn)錄共激活因子激活HLA Ⅱ類基因。本研究探討干擾素(IFN)-γ 通過調(diào)節(jié)分子伴侶干預(yù)人淋巴細(xì)胞抗原(HLA)Ⅱ類表達(dá)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 原代細(xì)胞培養(yǎng) 使用含有10% 胎牛血清(FCS)、1%的抗生素、丙酮酸鈉和HEPES 的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)獲取的人黑色素瘤細(xì)胞系MelJuSo 和IMRS 人肺成纖維細(xì)胞;采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞;使用單核細(xì)胞分離試劑盒陰性選擇分離出單核細(xì)胞。使用24 孔板用巨噬細(xì)胞集落刺激因子(1 000 U/ml)分化單核細(xì)胞(1×106個(gè)/ml)。

1.2 觀測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.1 轉(zhuǎn)染和CAT 報(bào)告試驗(yàn) 對(duì)MelJuSo 和IMRS細(xì)胞分別使用X-01 和A-02 程序,通過核分裂器Ⅰ電穿孔細(xì)胞,在用于轉(zhuǎn)染的DNA 混合物中加入4 μg BAT3-敲除載體,轉(zhuǎn)染48 h 后收集,收集得到的細(xì)胞用8 μg DNA jetPEI 轉(zhuǎn)染試劑在培養(yǎng)皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染,生成穩(wěn)定的MJ-BAT3-V5 和MJ-CⅡTA-V5 克隆體。采用G418 儀器選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆體,并用流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)V5 基因的表達(dá);采用一種功能報(bào)告基因檢測(cè)方法,使用Ii-啟動(dòng)子-CAT 結(jié)構(gòu)作為報(bào)告質(zhì)粒,MelJuSo 和MJ-BAT3-V5 細(xì)胞加入5 μg 報(bào)告質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染48 h 后酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)CAT 基因的表達(dá)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù) 室溫下將細(xì)胞在乙二胺四乙酸(EDTA)中培養(yǎng)15 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,多聚甲醛(PFA)固定,使用Triton-X-100 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透化處理5 min,使用含有2% FCS 和0.05%的疊氮化鈉的PBS 清洗細(xì)胞,接下來細(xì)胞在4℃下培養(yǎng)20 min,隨后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行3 次洗滌,使用FACSD 高速細(xì)胞分選儀(貝迪醫(yī)療公司,德國(guó))從未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中分離綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞。

1.2.3 Western 印跡、代謝標(biāo)記和質(zhì)譜檢測(cè) Western 印跡檢測(cè):細(xì)胞在0.5% NP-40 緩沖液中培養(yǎng),加入細(xì)胞裂解液處理后裂解產(chǎn)物經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上,用抗原特異性一級(jí)抗體進(jìn)行檢測(cè)。采用辣根過氧化物酶(HRP)-耦聯(lián)抗體和ECL Western 印跡試劑檢測(cè)原發(fā)性抗體結(jié)合,隨后進(jìn)行X 射線顯影。代謝標(biāo)記:將細(xì)胞在不含蛋氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h,隨后在1×106個(gè)細(xì)胞懸浮在200 μl 無蛋氨酸的培養(yǎng)基中,加入2 mmol/L 谷氨酰胺、10 mmol/L HEPES 和35S-蛋氨酸,在37℃溫度下?lián)u晃細(xì)胞30 min。然后將細(xì)胞造粒、清洗后,懸浮在1 ml含有非放射性蛋氨酸的培養(yǎng)基中,繼續(xù)標(biāo)記培養(yǎng)4 h。對(duì)得到的細(xì)胞進(jìn)行Western 印跡檢測(cè)方法如上所述,用2,5-二苯氧唑增強(qiáng)SDS 凝膠,干燥并進(jìn)行X 射線顯影。使用EasyWin32 軟件對(duì)薄膜進(jìn)行密度掃描,為了獲得線性關(guān)系的條帶強(qiáng)度,將IFN-γ 刺激和未受刺激的細(xì)胞免疫沉淀凝膠暴露7或36 h。質(zhì)譜分析檢測(cè):采用MJ-CⅡTA-V5 細(xì)胞中的V5 單克隆抗體免疫沉淀CⅡTA-V5,使用12%SDS-PAGE 進(jìn)行分離,考馬斯亮藍(lán)G-250 染色后,選擇具有CⅡTA/BAT3 流動(dòng)性的蛋白條帶,用胰蛋白酶譜免疫球蛋白(IG)D 試劑盒進(jìn)行凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化,在質(zhì)譜分析中從丙烯酰胺凝膠中洗脫出來的多肽通過3000 RSLC 系統(tǒng)分離,質(zhì)譜分析采用配備納米電噴霧離子源的LTQ-Orbitrap Velos 質(zhì)譜儀進(jìn)行ESI-MS/MS 質(zhì)譜分析。

1.2.4 實(shí)時(shí)PCR 分析 為了量化BAT3 轉(zhuǎn)錄的相對(duì)數(shù)量,使用Oligotex mRNA Mini 試劑盒從1×106個(gè)細(xì)胞中分離出poly-A-mRNA,并根據(jù)試劑盒中說明書的指導(dǎo),使用定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,隨后以cDNA 為模版進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR,PCR 儀設(shè)置條件為37℃保持15 min、85℃保持5 s、4℃至最終。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 軟件行Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)、單因素方差分析、Fisher 精確檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 BAT3 的缺失對(duì)HLA Ⅱ表達(dá)的影響 Western印跡檢測(cè)了BAT3 耗盡后Ii 的表達(dá)情況如圖1 所示,在實(shí)驗(yàn)中,對(duì)含有GFP 的細(xì)胞進(jìn)行分類,隨后進(jìn)行裂解,并對(duì)BAT3、Ii 和β-actin 進(jìn)行Western 印跡檢測(cè),在富含GFP 的裂解細(xì)胞樣品中,可以看到BAT3 殘帶,Ii 明顯消失。

圖1 Western 印跡檢測(cè)結(jié)果

研究BAT3 缺失對(duì)HLA Ⅱ表達(dá)的影響,采用流式細(xì)胞術(shù)將HLA Ⅱ類糖蛋白和HLA-DM 與Ii 進(jìn)行比較結(jié)果如表1 所示,為了確認(rèn)BAT3 敲除的特異性,將miRBAT3-GFP (miR4BAT3) 與另外一個(gè)BAT3 靶載體(miR10BAT3)、一個(gè)不相關(guān)的miRNA對(duì)照及編碼GFP 的模擬載體進(jìn)行了比較,將這兩種miRBAT3 載體導(dǎo)入MelJuSo 細(xì)胞后,miR4BAT3 組、miR10BAT3 組Ii、HLAⅡ、HLA-DM 水平均明顯低于模擬載體組(均P＜0.05),miRNA 對(duì)照組與模擬載體組Ii、HLAⅡ、HLA-DM 水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 BAT3 缺失對(duì)HLA Ⅱ表達(dá)的影響(±s,n=20)

表1 BAT3 缺失對(duì)HLA Ⅱ表達(dá)的影響(±s,n=20)

與模擬載體組比較:1)P＜0.05

組別IiHLA ⅡHLA-DM miR4BAT3 組61±1.211)55±1.271)41±1.231)miR10BAT3 組68±1.301)75±1.261)77±1.211)miRNA 對(duì)照組110±0.10110±0.11110±0.11模擬載體組100±0.10100±0.10100±0.11

2.2 過表達(dá)BAT3 對(duì)HLA Ⅱ成分水平的改變BAT3-V5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞組BAT3 水平(7 000±117)高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組(1 000±110),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。BAT3-V5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞組HLAⅡ和Ii 蛋白水平均明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組(均P＜0.05);HLAⅠ蛋白水平明顯低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組(P＜0.05)。見表2。

表2 兩組HLA Ⅱ、Ii 和HLA Ⅰ蛋白水平表達(dá)(±s,n=20)

表2 兩組HLA Ⅱ、Ii 和HLA Ⅰ蛋白水平表達(dá)(±s,n=20)

組別HLA ⅡIiHLAⅠ100±10100±10100±10 BAT3-V5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞組340±45270±5090±35 t 值14.07618.61721.043 P 值未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組0.0210.0360.047

2.3 IFN-γ 對(duì)BAT3 表達(dá)的影響 IFN-γ 刺激MelJuSo 細(xì)胞后通過Western 印跡檢測(cè)細(xì)胞提取物中BAT3 的表達(dá)結(jié)果如圖2 所示,IFN-γ 刺激48 h后BAT3 蛋白水平明顯升高(P＜0.05)。作為MelJuSo 細(xì)胞對(duì)IFN 反應(yīng)的對(duì)照,隨著時(shí)間的增加檢測(cè)出Ii 的表達(dá)也增強(qiáng)。通過實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)MelJuSo、IMRS 細(xì)胞中BAT3 對(duì)IFN-γ 介導(dǎo)的BAT3調(diào)控作用。將BAT3 的相對(duì)數(shù)量歸一化為β-actin水平,IFN-γ 處理使MelJuSo 細(xì)胞BAT3 增加6～7倍。IFN-γ 處理使IMRS 細(xì)胞增加4～5 倍。見表3。

圖2 Western 印跡檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)IFN-γ 對(duì)BAT3表達(dá)的影響

表3 MelJuSo、IMRS 細(xì)胞中IFN-γ 介導(dǎo)對(duì)BAT3調(diào)控(±s,n=20)

表3 MelJuSo、IMRS 細(xì)胞中IFN-γ 介導(dǎo)對(duì)BAT3調(diào)控(±s,n=20)

組別MelJuSo BAT3β-actin未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組-actin IMRS BAT3β 800±110 5 000±100 1 000±110 5 000±100 IFN-γ 轉(zhuǎn)染細(xì)胞組5 400±270 5 000±100 4 000±230 5 000±100 t 值16.40321.05319.05713.771 P 值0.0240.5000.0390.500

2.4 ELISA 檢測(cè)CAT 蛋白 IFN-γ 處理誘導(dǎo)細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)CⅡTA 表達(dá),進(jìn)而刺激HLA Ⅱ類基因轉(zhuǎn)錄,通過ELISA 檢測(cè)CAT 蛋白的表達(dá),證明過表達(dá)的BAT3 影響IFN-γ 誘導(dǎo)的Ii 轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)果,IFN-γ 誘引內(nèi)源性CⅡTA 和BAT3 在MelJuSo 和BAT3-V5細(xì)胞中表達(dá),刺激Ii 啟動(dòng)子活性,CAT 蛋白表達(dá)比較:IFN-γ+BAT3-V5 細(xì)胞(1 000±180)＞IFγ+MJ 細(xì)胞(810±150)＞BAT3-V5 細(xì)胞(700±110)＞MJ 細(xì)胞(200±70),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。

3 討 論

HLA 復(fù)合體控制著免疫系統(tǒng)對(duì)感染的各種反應(yīng),HLA Ⅱ類表達(dá)異?；蛉笔鶗?huì)引起嚴(yán)重自身免疫疾病或引起免疫缺陷的發(fā)生。Nakashima 等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)HLA Ⅱ類基因的基因表達(dá)完全受主調(diào)控因子CⅡTA 的調(diào)控,這種轉(zhuǎn)活化因子對(duì)HLA Ⅱ類基因和少數(shù)參與抗原處理的其他基因有顯著的特異性。BAT3 在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和控制細(xì)胞增殖的穩(wěn)定因子中發(fā)揮著重要作用〔12〕,BAT3 作為熱休克蛋白HSP70 的參與蛋白可調(diào)控蛋白的再折疊和其合成的質(zhì)量控制。研究表明BAT3/BAG6 支持一些抗原蛋白的降解和錯(cuò)誤定位蛋白的消除,在BAT3 的生命周期中,會(huì)發(fā)生與其他蛋白質(zhì)許多的相互作用〔13,14〕。BAG 家族的蛋白(BAT3 被指定為BAG6,因?yàn)樗蠦AG 基序)已被證明與蛋白酶體亞基、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子相互作用〔15〕,通過高通量雜化篩選,可檢測(cè)到與BAT3 N 端相互作用的新蛋白,這些蛋白含有調(diào)控蛋白降解的結(jié)構(gòu)域基序。BAT3 的作用可能是穩(wěn)定新合成的蛋白,并通過與其他因素的相互作用將其傳遞到細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞間隔中。Takeuchi〔16〕研究表明在胞質(zhì)中BAT3 與Ubl4a和TRL35 形成穩(wěn)定的復(fù)合物,BAT3 復(fù)合物靶向核糖體上的一種尾錨定蛋白底物亞型,具有高度特異性,并將蛋白轉(zhuǎn)移到TRC40,ATPase TRC40 伴侶蛋白是新近合成的尾錨定蛋白。類似于BAT3 穩(wěn)定尾部錨定蛋白并將其靶向TRC40 的機(jī)制,BAT3 伴侶蛋白CⅡTA 在核糖體上合成并隨后介導(dǎo)與核轉(zhuǎn)運(yùn)因子的相互作用,新合成的CⅡTA 通過BAT3 的陪伴可解釋CⅡTA 在BAT3 介導(dǎo)下增加的現(xiàn)象,BAT3從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核內(nèi)部的是由在C 端發(fā)現(xiàn)的核定位序列介導(dǎo)。Luo 等〔17〕發(fā)現(xiàn)BAT3/BAG6 在細(xì)胞溶膠中的作用在受到免疫刺激細(xì)胞因子IFN-γ 的調(diào)控后可以轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞核內(nèi)多肽的作用,HLA Ⅱ類定位的BAT3 和CⅡTA 基因均受IFN-γ 調(diào)控,通過IFNγ 處理后BAT3 蛋白表達(dá)增加,同時(shí)IFN-γ 誘導(dǎo)的CⅡTA 升高,但是CⅡTA 水平升高并不增強(qiáng)BAT3 的表達(dá)。BAT3 被證明是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,它與CTCFL 形成復(fù)合物,調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因的表達(dá),此外BAT3 與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300 結(jié)合,促進(jìn)p53 的后續(xù)乙?；?。p300 被CⅡTA 招募到Ⅱ類啟動(dòng)子中,參與CⅡTA 基因的轉(zhuǎn)錄。BAT3 在物理上與CⅡTA 相互作用,在IFN-γ 刺激作用后兩種蛋白都轉(zhuǎn)移到核內(nèi),Guillaume 等〔18〕發(fā)現(xiàn)IFN-γ 處理MelJuSo 細(xì)胞2 h 內(nèi)CⅡTA 和BAT3 均轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,這一短時(shí)間間隔表明IFN-γ 影響細(xì)胞質(zhì)CⅡTA和BAT3 蛋白的穩(wěn)態(tài)水平。BAT3 與CⅡTA 結(jié)合隨后啟動(dòng)HLA Ⅱ類基因轉(zhuǎn)錄,但BAT3 對(duì)HLA Ⅱ類轉(zhuǎn)錄的直接作用尚未被證實(shí)。HLA Ⅱ類的表達(dá)在APCs 的異質(zhì)性組中受到差異調(diào)控,BAT3 的伴侶作用可以在APCs 中調(diào)控HLA Ⅱ類基因的表達(dá)。未成熟的樹突細(xì)胞可高度合成HLA Ⅱ類處理通路的成分,一旦病原體激活這種合成就會(huì)停止,在B 淋巴細(xì)胞中HLA Ⅱ類的本構(gòu)表達(dá)在向漿細(xì)胞的終末分化過程中丟失〔19〕。Kosuke 等〔20〕發(fā)現(xiàn)IFN-γ 誘導(dǎo)HLA Ⅱ類,通過IFN-γ 刺激巨噬細(xì)胞中的BAT3 基因轉(zhuǎn)錄,BAT3 對(duì)CⅡTA 的關(guān)鍵影響可能為調(diào)控轉(zhuǎn)錄子提供了一個(gè)缺失的環(huán)節(jié)。本研究表明BAT3 通過陪伴CⅡTA 來調(diào)控HLA Ⅱ類表達(dá),CⅡTA 蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控為HLA Ⅱ類通路的調(diào)控提供了一種新的機(jī)制。