Th17細(xì)胞及IL-17A在老年腰椎間盤退變中的表達(dá)及臨床意義

周鳳玲 王盈盈 周曉婭 (濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)與化學(xué)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)寧 272000)

腰椎間盤退變(IVD)是人類常見慢性疾病,以下腰痛和急性下肢神經(jīng)根性疼痛為癥狀〔1〕,在以往的認(rèn)識(shí)中,IVD 病因主要是由于與物理負(fù)荷有關(guān)的機(jī)械壓迫與損傷及人體組織的衰退及老化。研究證實(shí)IVD 是一種免疫介導(dǎo)的炎癥過(guò)程。Naylar 等〔2〕首先提出的椎間盤突出癥建立在特定解剖結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上的自身免疫理論,髓核是體內(nèi)最大的無(wú)血管組織,它處于免疫特權(quán)狀態(tài),一旦髓核暴露于免疫系統(tǒng)之中,引起局部自身免疫炎癥反應(yīng),隨后導(dǎo)致慢性炎癥和持續(xù)性腰腿痛。Th17 細(xì)胞的特點(diǎn)是產(chǎn)生白細(xì)胞介素(IL)-17A,但它們也分泌許多其他炎癥細(xì)胞因子,如IL-22、腫瘤壞死因子(TNF)-α 和IL-26〔3～6〕。最近,對(duì)人類和小鼠的大量研究表明,Th17 細(xì)胞在許多不同免疫介導(dǎo)疾病的發(fā)病機(jī)制中起主導(dǎo)作用,包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎〔7〕、銀屑病〔8〕、哮喘〔9〕和炎癥性腸病〔10〕。但是Th17 細(xì)胞及IL-17A 在IVD 發(fā)病機(jī)制中的作用尚不明確,本研究分析IVD 患者外周血中Th17 細(xì)胞和IL-17A 的變化并探究Th17 細(xì)胞在其發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2020年6月濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院住院部住院的30 例IVD 患者,年齡63.2(61～65)歲,均接受了椎間盤切除術(shù),根據(jù)手術(shù)觀察和影像學(xué)表現(xiàn),分為兩組:突出組(纖維環(huán)完整組,n=15)和擠壓組(纖維環(huán)破裂組,n=15)。采集術(shù)前IVD 組及對(duì)照組〔健康對(duì)照人群13 例,年齡62.6(60～66)〕歲,空腹外周靜脈血。IVD 患者納入標(biāo)準(zhǔn):典型的骨痛或坐骨神經(jīng)痛;Lasegue 征或Bragard 試驗(yàn)陽(yáng)性;脊柱X光片退變椎間盤厚度減小,脊柱生理曲度減小或消失,T2 加權(quán)磁共振成像(MRI)分析顯示,累及髓核的信號(hào)減弱,CT 上無(wú)鈣化跡象;無(wú)肺結(jié)核、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或其他免疫紊亂,近期無(wú)糖皮質(zhì)激素使用史。根據(jù)Pfirrmann 分級(jí)系統(tǒng)確定IVD 程度,該系統(tǒng)基于MR 信號(hào)強(qiáng)度、椎間盤結(jié)構(gòu)、核與環(huán)的區(qū)別及椎間盤高度。實(shí)驗(yàn)方案得到了濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院人類受試者制度倫理審查委員會(huì)的前瞻性批準(zhǔn),所有研究對(duì)象簽署了關(guān)于使用體外組織和血液樣本的知情同意書。

1.2 分離外周血單核細(xì)胞(PBMC) 10 ml 外周靜脈血在實(shí)驗(yàn)對(duì)象空腹的條件下抽取,采用密度梯度離心法從外周靜脈血樣本中分離出PBMCs,PBMCs在含有10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640 培養(yǎng)基(Hyclone,Waltham,MA,USA)和24 個(gè)U 形底部組織培養(yǎng)板(Costar, Corning Corning Corning, NY,USA) 中培養(yǎng)。培養(yǎng)皿中加入佛波酯(PMA)50 ng/ml和離子霉素2 g/ml 刺激1 h,然后加入布雷菲德菌素A 中并培養(yǎng)5 h,并進(jìn)行胞內(nèi)染色和流式細(xì)胞儀分析。

1.3 運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th 細(xì)胞 在分離后的PBMCs 用APC/H7-CD3 抗體、FITC-CD4 抗體、PE/Cy7-CD8 抗體和BV510-CD45RO 抗體(BD-PharMingen,San-Diego,CA,USA)在室溫黑暗中染色30 min,對(duì)照染色用APC/H7-IgG1、FITC-IgG1、PE/Cy7-IgG1和BV510-IgG1(BD-PharMingen)染色。CD4+細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞門控進(jìn)行分離。FlowJo 軟件7.6.2〔11〕用于分析每個(gè)樣本的CD4+和CD45RO+CD4+T 細(xì)胞的數(shù)量。在刺激后的PBMCs 中加入Alexa Fluor 647-CXCR5 抗體,PE/CY7-CD4 抗體在室溫下避光的條件下染色30 min,然后固定、滲透、Alexa/Fluor 647-IL-17A 染色。流式細(xì)胞儀檢測(cè)IL-17A+CD4+CD8-細(xì)胞的頻率。樣本均采用相同的抗體和方案,并對(duì)樣本進(jìn)行盲法分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Mann-Whitney-U非參數(shù)檢驗(yàn),獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)及Pearson 秩相關(guān)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 IVD 患者外周血中T 細(xì)胞表達(dá) 兩組外周血CD4+T 細(xì)胞比率沒有顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示),IVD組CD4+CD45RO+T 細(xì)胞比率(74.52%±2.229%)相對(duì)于對(duì)照組(52.99% ±1.645%)明顯升高(P=0.011)。見圖1。

圖1 兩組Th 細(xì)胞亞群表達(dá)水平

2.2 IVD 組Th17 細(xì)胞亞群 Th17(IL-17A+CD4+T)細(xì)胞的百分比〔(0.808±0.049)%〕及血清中IL-17A 濃度〔(5.072±0.196)pg/ml〕顯著高于對(duì)照組〔(0.515 ±0.021)%、(3.928 ±0.146) pg/ml;P＜0.001〕。見圖2。IVD 組CD45RO+Th17/Th17 細(xì)胞比率〔(86.12±2.787)%〕顯著高于對(duì)照組〔(78.61±2.157)%;P＜0.001〕。纖維環(huán)破裂組外周血中Th17細(xì)胞表達(dá)水平〔(0.906±0.058)%〕和纖維環(huán)完整組Th17 細(xì)胞的表達(dá)水平〔(0.611±0.039)%〕較對(duì)照組顯著增高(P＜0.001,P=0.02)。

圖2 兩組外周血Th17 細(xì)胞亞群及IL-17A 表達(dá)

3 討 論

IVD 發(fā)病機(jī)制及病程中免疫的失衡狀態(tài)被發(fā)現(xiàn),椎間盤由髓核及包繞髓核的纖維環(huán)和軟骨終板組成,椎間盤中的髓核常被認(rèn)為人體的免疫赦免部位〔12〕。一旦椎間盤發(fā)生退變及損傷之后,髓核便暴露于機(jī)體的免疫系統(tǒng)之中,因此機(jī)體會(huì)產(chǎn)生抗原-抗體相關(guān)的免疫反應(yīng)。Weiler 等〔13〕發(fā)現(xiàn)退變椎間盤組織中高表達(dá)IL-1β、IL-6、TNF-α 和IFN-γ 等多種炎癥細(xì)胞因子。CD4 淋巴細(xì)胞標(biāo)志物和各種淋巴細(xì)胞產(chǎn)物的高表達(dá)狀態(tài)也在退變椎間盤組織中被發(fā)現(xiàn)。

活化的CD4+T 細(xì)胞分化為Th1 和Th2 兩個(gè)亞群。每個(gè)亞群都具有相互作用和細(xì)胞因子分泌的形式〔14〕。這種分類方法一直沿用到2005年,直到對(duì)產(chǎn)生IL-17A 的Th17 進(jìn)行了描述〔15〕。Th17 細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量的促炎細(xì)胞因子,包括IL-17A、TNF-α、IL-22 和IL-26。近年的科學(xué)研究證明Th17 淋巴細(xì)胞在炎癥性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用,包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、克羅恩病和多發(fā)性硬化癥〔3～6〕。IL-17 是一種促炎性細(xì)胞因子,主要由Th17 淋巴細(xì)胞在產(chǎn)生IL-23 后被激活而產(chǎn)生。IL-17 可以通過(guò)不同的信號(hào)通路促進(jìn)炎癥反應(yīng),其中一些信號(hào)通路被干擾素(IFN)γ〔16〕等其他淋巴細(xì)胞產(chǎn)物調(diào)節(jié),從而促進(jìn)其他細(xì)胞因子、蛋白酶、一氧化氮(NO)和前列腺素(PG)E2 的合成。鑒于突出的椎間盤組織激活免疫反應(yīng)的理論基礎(chǔ)及在突出的椎間盤碎片中浸潤(rùn)和活化的淋巴細(xì)胞的發(fā)現(xiàn),進(jìn)一步探究Th17 淋巴細(xì)胞在IVD 發(fā)病機(jī)制中的潛在作用具有重要意義。

受到抗原激活后初始T 淋巴細(xì)胞(CD45RO-或CD45RA+)向活化和記憶T 淋巴細(xì)胞(CD45RO+)轉(zhuǎn)化〔17〕,本研究結(jié)果提示,升高的Th17 細(xì)胞可能參與IVD 發(fā)病機(jī)制。髓核組織與循環(huán)系統(tǒng)接觸導(dǎo)致淋巴細(xì)胞活化進(jìn)而導(dǎo)致免疫反應(yīng)及細(xì)胞因子的募集,Th17 細(xì)胞可以作為檢測(cè)腰椎退行性變疾病進(jìn)展的一種生物學(xué)指標(biāo),或許成為治療腰椎退行性變疾病的新靶點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn),IL-17A 在退變和疝出的IVD 手術(shù)組織中都有高水平的表達(dá),IL-17A 促進(jìn)NO 合酶和環(huán)氧化物酶(COX)-2 上調(diào)、NO 和PGE2 產(chǎn)生及IL-6釋放〔18〕。增多的CD4+IL-17A+、CD4+CCR6+細(xì)胞在IVD 中被發(fā)現(xiàn),同時(shí)Pene 等〔19〕研究也表明CD4+CCR6+可能是分泌IL-17 細(xì)胞因子的一個(gè)特征性細(xì)胞標(biāo)志物。此外,Shamji 等〔20〕和Gabr 等〔21〕的研究支持了這一發(fā)現(xiàn),認(rèn)為IL-17A 通過(guò)影響許多炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,在IVD 炎癥反應(yīng)中起著重要作用。老年性腰椎退變一旦纖維環(huán)破裂,大量的CCL20 釋放出來(lái),吸引外周血表達(dá)CCR6 的Th17 細(xì)胞。Th17 細(xì)胞經(jīng)趨化性轉(zhuǎn)移至病變部位后,在細(xì)胞通路誘導(dǎo)下分泌多種炎性細(xì)胞因子并與巨噬細(xì)胞及其他炎性細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子形成炎癥環(huán)境。從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的募集進(jìn)而導(dǎo)致髓核組織吸收和以坐骨神經(jīng)痛為表現(xiàn)的不良炎癥性周圍神經(jīng)病變。