烏司他丁對多臟器衰竭大鼠TLR4/NF-κB信號通路及肝損傷的影響

吳政庚 陳彥興 李志華 (南方科技大學(xué)醫(yī)院急診科,廣東 深圳 518055)

多器官衰竭綜合征(MODS)是指同時或接連出現(xiàn)2 個或以上的器官衰竭,常伴有全身性炎癥反應(yīng)、急性肝衰竭,還可引起腎功能障礙,臨床表現(xiàn)為肝腎綜合征,病死率高達60%～80%〔1,2〕。Toll樣受體(TLR)4 是一種模式識別受體,在基因水平上調(diào)控眾多炎癥因子的轉(zhuǎn)錄〔3〕。核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB 調(diào)控的細胞因子參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細胞凋亡等生物進程〔4〕。髓樣分化因子(MyD)88 分子是TLRs 通路中的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,可與眾多TLRs 家族受體結(jié)合,向下游NF-κB 等分子傳遞信號,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)〔5〕。烏司他丁是從人尿液中分離純化的蛋白酶抑制劑,被認為可以抑制多種炎癥介質(zhì)的釋放,阻斷細胞因子、炎癥介質(zhì)與白細胞之間的惡性循環(huán),在重度顱腦損傷或全身炎癥合并MODS 治療中均有較好的臨床治療效果〔6〕。鑒于MODS 引發(fā)全身性炎癥,勢必激活機體TLR4/NF-κB 炎癥通路,而烏司他丁則有抑炎作用,本研究觀察烏司他丁對MODS 大鼠TLT4/NKκB 信號通路及肝損傷的影響,探究其作為臨床治療MODS 潛在藥物的可能性。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF 清潔級SD 雄性大鼠50 只,體重150～180 g,由北京生命科學(xué)研究所動物實驗中心提供,合格證號為SYXK(京)2015-0002,所有動物均嚴格按照動物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng),溫度為25℃,濕度為60%。

1.2 藥品及試劑 烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司,批號:031601104),潑尼松片(湖北制藥有限公司,批號:160607),兔抗鼠TLR4、MyD88及NF-κB 一抗(Abcam 公司),羊抗兔IgG EnVison二抗(丹麥DAKO 公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 試劑及Taq DNA 聚合酶(Fermentas 公司),引物及探針、Trizol 試劑(美國Invitrogen 公司),熒光定量試劑盒(大連TaKaRa 公司),H&E 染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),BCA 試劑盒(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司),考馬斯亮藍試劑盒(南京建成生物工程研究所),大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖(LPS,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京生物鑒定所)。

1.3 實驗設(shè)備 GIS-500 凝膠成像儀(Miulab 公司),小動物呼吸機(型號Inspira 557058,美國Harvest Apparatus 公司),PowerLab 生理記錄儀(上海然哲儀器設(shè)備有限公司),AEROSET 全自動生化儀(美國雅培公司),低溫高速離心機(美國Thermo Scientific 公司),尼康SMZ745 光學(xué)顯微鏡(上海普赫生物科技有限公司),十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)儀、電轉(zhuǎn)化儀(美國Bio Rad 公司)。

1.4 動物模型制作 SPF 級大鼠50 只適應(yīng)性觀察喂養(yǎng)1 w,隨機抽取7 只作為對照(對照組),其余43只為造模組。手術(shù)前12 h 禁止飲食,飲水自由。稱重標記后,俯臥位固定于手術(shù)臺,從左中下腹將LPS注入腹腔(15 ml/kg)〔7〕,對照組大鼠注入等量滅菌生理鹽水。依據(jù)MODS 實驗室診斷標準及臨床定義,規(guī)定動物致傷24 h 后出現(xiàn)2 個或2 個以上功能障礙(或衰竭)方可診斷為MODS。受累器官待查項目中肝功能指標中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)等≥對照值3 倍,腎功能中血肌酐等≥對照值3 倍,凝血功能血小板等≤50×109/L,說明造模成功〔8〕。

1.5 動物模型的分組、計量設(shè)置及給藥方法 排除死亡或造模不成功的8 只大鼠,驗證成功的大鼠隨機分成5 組,包括模型組(n=7)、激素組10.5 mg/kg組(n=7)、烏司他丁低中高組(n=7)。24 h 后,采用體積分數(shù)10%水合氯醛3 ml/kg 腹腔內(nèi)注射,麻醉生效后,取仰臥位,經(jīng)斷尾采血測定ALT、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)等生化指標。采血后烏司他丁低中高劑量組大鼠分別經(jīng)腹腔注射給予烏司他丁注射液25 000、50 000、75 000 U/(kg·d), 激素組腹腔注射潑尼松6 mg/(kg·d),連續(xù)給藥7 d〔9〕,對照組和模型組給予等量的生理鹽水。

1.6 蘇木素-伊紅(HE)染色觀察大鼠肝組織病理學(xué)變化 造模7 d 后,將各組7 只大鼠處死,將肝組織放置4%多聚甲醛溶液固定,制備石蠟切片,在二甲苯中固定30 min,隨后在質(zhì)量分數(shù)為100%、95%、85%、75%的乙醇溶液中分別脫水5 min;蒸餾水沖洗后,加入蘇木素染色10 min,隨后置于1%鹽酸5 s 后,蒸餾水進行沖洗。滴加伊紅染液進行復(fù)染5 min,在不同濃度的乙醇溶液中脫水2 min,加入二甲苯進行透明處理,滴加中性樹脂封片,置于光學(xué)顯微鏡下進行觀察。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測肝組織中TLR4、MyD88 及NF-κB 信使核糖核酸(mRNA)水平 大鼠處死后取肝組織,按照Trizol法提取總RNA,分光光度計測總RNA 純度及濃度,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照SYBR Premix Ex Taq TM 試劑盒說明書進行qRT-PCR,反應(yīng)體系為20 μl:2×SYBR Mix 10 μl,H2O 8 μl,上下游引物各0.5 μl,模板1 μl。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性10 s、60℃退火30 s,72℃2 min,40 個循環(huán),72℃延伸10 min。以GAPDH 基因為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt方法計算肝組織中TLR4、MyD88 及NF-κB mRNA 相對表達量。TLR4正向引物5′-3′:GCATCATCTTCATTGTCCTTGAG,反向5′-3′:CTCCCACTCGAGGTAGGTGTTT;MyD88 正向引物5′-3′:GCCCAAAGAACCATTAGA,反向5′-3′:AGACAGTTTCCCAGCATC;NF-κB 正向引物5′-3′:TCAAGCCTAAGGCCTTAAGG,反向5′-3′:GAACCTGGCAATCCTGAAGA;GAPDH 正向引物5′-3′:GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT,反向5′-3′:GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。

1.8 Western 印跡檢測肝組織中TLR4、MyD88 及NF-κB 蛋白表達 將肝組織剪碎,添加蛋白裂解液置于冰上30 min,離心后收集上清液,參照二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定肝組織中蛋白總濃度,配制10%分離膠、5%濃縮膠,取50 μg蛋白上樣,待蛋白樣品剛進入濃縮膠時電壓設(shè)置為80 V,進入分離膠后,電壓升高至120 V,電泳結(jié)束后,將目的條帶凝膠切除,目的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,冰上進行轉(zhuǎn)膜反應(yīng),電壓為100 V,反應(yīng)時間1 h,結(jié)束后用TBST 溶液清洗,加入5%脫脂牛奶室溫下進行1 h 封閉,TBST 溶液清洗后,加入一抗(TLR4、MyD88 及NF-κB 抗體,稀釋倍數(shù)1 ∶500),4℃過夜,TBST 清洗后加入TLR4、MyD88 及NF-κB羊抗兔IgG 二抗(稀釋倍數(shù)1 ∶10 000),室溫下孵育2 h,TBST 清洗后電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色后置于凝膠成像儀中觀察各組蛋白表達情況。實驗采用ImageJ 軟件對Western 印跡條帶進行采集分析,并計算目的條帶與相應(yīng)內(nèi)參β-actin 的比值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析、LSD-t法進行檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 各組一般情況觀察 對照組飲食正常,精力充沛,皮毛光亮,體重呈生理性增加;模型組造模后第1 天即表現(xiàn)出病態(tài);3 d 內(nèi)LPS 成功誘導(dǎo)所有大鼠出現(xiàn)急性腹膜炎,表現(xiàn)為皺毛、腹瀉、活動減少、反應(yīng)遲鈍、體質(zhì)量減輕和體溫下降。激素組飲食正常,與對照組表現(xiàn)相似。低中高劑量烏司他丁組飲食、活動較模型組程度有所改善,高劑量烏司他丁組與激素組飲食、活動、反應(yīng)類似。

2.2 各組肝功能相關(guān)指標 與對照組相比,模型組肝功能指標中ALT、AST、TBIL 明顯升高(P＜0.05)。與模型組相比,激素組、低中高劑量烏司他丁組ALT、AST、TBIL 明顯降低(P＜0.05)。與激素組相比,低中劑量烏司他丁組ALT、AST、TBIL 明顯升高(P＜0.05),高劑量烏司他丁組ALT、AST、TBIL 水平無明顯差異。見表1。

表1 各組肝功指標和肝組織中TLR4、MyD88 及NF-κB mRNA 水平的檢測(±s,n=7)

表1 各組肝功指標和肝組織中TLR4、MyD88 及NF-κB mRNA 水平的檢測(±s,n=7)

與對照組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;與激素組比較:3)P＜0.05;表2 同

組別ALT(U/L)AST(U/L)TBIL(μmmol/L)TLR4 mRNAMyD88 mRNANF-κ B mRNA對照組46.32±7.6565.85±9.261.48±0.361.12±0.131.00±0.121.23±0.14模型組215.52±32.281)142.51±20.151)21.26±4.651)2.85±0.311)4.38±0.451)3.81±0.641)激素組105.24±10.511)2)86.36±11.521)2)3.56±0.851)2)1.15±0.141)2)1.21±0.161)2)1.45±0.241)2)低劑量烏司他丁組 181.59±29.521)2)3) 136.53±24.611)2)3) 18.63±3.211)2)3)1.74±0.221)2)3) 3.25±0.311)2)3) 2.85±0.421)2)3)中劑量烏司他丁組 156.59±21.381)2)3) 112.68±18.361)2)3) 11.42±1.351)2)3)1.52±0.161)2)3) 2.41±0.281)2)3) 2.02±0.381)2)3)高劑量烏司他丁組 113.43±12.861)2)89.36±14.861)2)4.57±1.141)2)1.26±0.151)2)1.32±0.211)2)1.52±0.311)2)

2.3 各組肝臟組織病理學(xué) 對照組肝臟細胞排列整齊、致密、形態(tài)完整,未出現(xiàn)病理學(xué)損害。模型組肝細胞廣泛變性并有局灶性壞死,空泡細胞質(zhì),炎性細胞浸潤和中心靜脈受損;激素組肝細胞基本未受到損害;烏司他丁組隨藥物濃度的升高,肝細胞損害有所降低,細胞變形減輕,壞死細胞數(shù)量逐漸減少。見圖1。

圖1 各組肝臟組織病理學(xué)(HE 染色,×400)

2.4 各組肝組織中TLR4、MyD88 及NF-κB mRNA和蛋白水平的檢測 與對照組相比,模型組TLR4、MyD88 及NF-κB mRNA 和蛋白水平均顯著升高(P＜0.05)。與模型組相比,激素組TLR4、MyD88 及NF-κB mRNA 和蛋白水平均顯著降低(P＜0.05),低中高劑量烏司他丁組TLR4、MyD88 及NF-κB mRNA和蛋白水平顯著減低(P＜0.05)。與激素組相比,低中劑量烏司他丁組TLR4、MyD88 及NF-κB mRNA和蛋白水平均顯著升高(P＜0.05);高劑量烏司他丁組無顯著差異(P＞0.05)。見表1、表2、圖2。

表2 各組肝組織TLR4、MyD88 及NF-κB 蛋白表達水平(±s,n=7)

表2 各組肝組織TLR4、MyD88 及NF-κB 蛋白表達水平(±s,n=7)

組別TLR4MyD88NF-κB 0.29±0.050.85±0.091.05±0.07模型組0.95±0.141)1.45±0.181) 1.68±0.181)激素組0.43±0.091)2) 0.91±0.111)2) 1.13±0.091)2)低劑量烏司他丁組0.75±0.221)2)3) 1.35±0.161)2)3)1.52±0.151)2)3)中劑量烏司他丁組0.61±0.131)2)3) 1.12±0.131)2)3)1.31±0.131)2)3)高劑量烏司他丁組 0.51±0.121)2) 0.96±0.121)2) 1.16±0.111)2)對照組

圖2 各組肝組織TLR4、MyD88 及NF-κB 蛋白表達水平

3 討 論

MODS 致病原因較多,包含了早期的內(nèi)環(huán)境紊亂到多器官衰竭的連續(xù)性的生理病理過程,發(fā)病機制還不十分明確〔10〕。雖然MODS 在病理上具有可逆性,但是預(yù)后一般較差,多有永久性器官損傷〔11〕。目前研究認為,MODS 發(fā)病主要有炎癥失控、缺血-再灌注損傷、基因誘導(dǎo)等原因造成〔12〕。其中炎癥失控假說已經(jīng)成為MODS 發(fā)病機制的重要基石,也為MODS 的臨床治療(阻斷炎癥瀑布)提供了新的途徑〔13〕。烏司他丁可有效、廣譜地抑制多種蛋白酶,清除炎癥因子等炎癥介質(zhì)的釋放,阻斷細胞因子、炎癥介質(zhì)與白細胞的級聯(lián)反應(yīng),保護機體重要臟器功能〔14〕。研究發(fā)現(xiàn),烏司他丁可治療MODS 患者,抑制炎癥相關(guān)因子的釋放,縮短患者恢復(fù)時間,改善患者腎臟功能〔15〕。

腹腔注射LPS 可激活全身炎癥反應(yīng),作用于肝臟、腎臟、腸等器官,導(dǎo)致腸源性MODS〔16〕。李兵等〔17〕發(fā)現(xiàn),烏司他丁在重度顱腦損傷早期應(yīng)用能夠有效降低部分炎癥介質(zhì)水平,降低重度顱腦損傷后MODS 的發(fā)生率及30 d 病死率。本研究發(fā)現(xiàn),造模大鼠腹腔注射LPS 后,肝腎功能及凝血變化符合實驗室MODS 診斷標準〔8〕,提示造模成功。本研究提示烏司他丁可改善MODS 大鼠肝損傷情況。研究發(fā)現(xiàn),烏司他丁對大鼠肝損傷具有保護作用,可以降低肝損傷過程中促炎因子的產(chǎn)生和釋放,抑制TLR4/NF-κB 炎癥通路〔18〕。病理學(xué)結(jié)果也提示烏司他丁可改善大鼠肝損傷狀況。

LPS 是革蘭陰性菌細胞壁的組成成分和主要致病成分,可以造成全身性感染,TLR4 作為LPS 的受體,負責對細菌內(nèi)毒素的識別〔19〕。目前認為LPS 致病途徑為:LPS 與細胞膜上TLR4-CD14-MD-2 復(fù)合物結(jié)合后,活化的TLR4 胞內(nèi)尾狀結(jié)構(gòu)與MyD88 結(jié)合,激活MyD88-白細胞介素1 受體相關(guān)激酶-腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6-NF-κB 誘導(dǎo)激酶信號通路,使NF-κB 誘導(dǎo)激酶磷酸化而降解,NF-κB 被大量釋放,并遷移至胞核內(nèi)啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)細胞因子及趨化因子、急性期反應(yīng)蛋白表達,啟動炎癥級聯(lián)瀑布反應(yīng)最終導(dǎo)致全身性炎癥〔20〕。烏司他丁可減緩TLR4 等炎癥因子的產(chǎn)生及釋放,減少與MyD88 結(jié)合,進而減少了NF-κB 的釋放及轉(zhuǎn)錄作用,因而細胞因子及趨化因子、急性期反應(yīng)蛋白表達減少,全身的炎癥反應(yīng)減輕,最終防止或逆轉(zhuǎn)MODS的發(fā)病。

綜上,烏司他丁可能通過抑制TLR4 mRNA 和蛋白表達,阻斷TLR4/NF-κB 信號通路,使NF-κB水平降低,進而減輕大鼠全身性炎癥反應(yīng),逆轉(zhuǎn)大鼠MODS 病情。這可能是烏司他丁作用機制之一,為臨床MODS 治療提供一定參考。但本研究也存在一定的不足,并未在研究中設(shè)計通路抑制劑進行驗證,有待后續(xù)深入研究。