基于AC/cAMP通路探討清竇靈合劑對鼻竇炎大鼠鼻黏膜水通道蛋白表達(dá)的影響

張?zhí)?喻國凍 顧平 唐強(qiáng) 金瑩 (貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科,貴州 貴陽 550004)

鼻竇炎是從鼻竇黏膜發(fā)展的炎性的耳鼻喉科常見疾病,臨床表現(xiàn)為鼻塞,流膿涕,頭痛,眩暈,嗅覺障礙,記憶力下降等,伴有急性上呼吸道感染,在兒童及青少年中發(fā)病率極高,經(jīng)常反復(fù)發(fā)作,甚至久治不愈〔1〕。目前關(guān)于該病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,因此尚無根治性治療手段。我國中醫(yī)藥治療手段在控制鼻竇炎癥狀方面效果顯著。許多中成藥如鼻竇炎口服液、鼻淵合劑、宣肺通竅顆粒等在臨床上顯示了良好的療效〔2〕。清竇靈合劑主要由細(xì)辛、辛夷、蒼耳子、黃芪、白術(shù)、白芷、防風(fēng)、黃芩、川芎、薄荷、金銀花等中藥組成。李良波等〔3〕臨床研究表明使用清竇靈合劑治療兒童鼻-鼻竇炎效果良好,并且復(fù)發(fā)率較低,沒有不良反應(yīng),但其中機(jī)制尚無報道。武楠等〔4〕研究報道甲基丁香酚(中藥細(xì)辛的主要活性成分)通過調(diào)控水通道蛋白(AQP)5 的表達(dá)改善過敏性鼻炎大鼠的癥狀。研究表明〔5〕AQP 表達(dá)參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外的水平衡,直接維系細(xì)胞膜的通透性。研究表明〔6〕腺苷酸環(huán)化酶(AC)/環(huán)磷酸腺苷(cAMP) 通路是機(jī)體內(nèi)介導(dǎo)水液代謝,細(xì)胞膜通透性的關(guān)鍵通路。但是未有AC/cAMP 通路對鼻黏膜上AQP 表達(dá)影響的報道。本研究通過建立鼻竇炎大鼠模型,從AC/cAMP 通路對鼻黏膜上AQP 蛋白表達(dá)的影響角度出發(fā),探討清竇靈合劑對鼻竇炎的治療作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 10～12 周齡,SPF 級,雄性,SD 大鼠,體重200～220 g,共計60 只,從貴州省中觀生物技術(shù)有限公司采購,許可證號:SCXK(黔)2018-0004。

1.2 主要試劑和儀器 清竇靈合劑(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn),批號為: H20160467);青霉素V 鉀片(0.236 g×30 片,西南藥業(yè)股份有限公司,批號為:國藥準(zhǔn)字H20067446)。免疫組化試劑盒購自上海生工生物工程有限公司,蛋白濃度測定試劑盒購自南京建成生物有限公司,磷酸化蛋白激酶(p-PK)A、磷酸化環(huán)磷酸腺苷及應(yīng)單元結(jié)合蛋白(p-CREB)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒采購自美國Cell Signaling 公司, Western 印跡試劑盒購自美國BIORAD 公司。倒置熒光顯微鏡(日本Olympus 公司);凝膠成像儀(美國Beckma 公司);小型臺式離心機(jī)(北京六一公司);小微動物全自動生化儀(美國BIO-RAD 公司);生物超凈工作臺(上海醫(yī)療器械制造廠)。

1.3 模型構(gòu)建和分組處理 實驗大鼠在醫(yī)院的飼養(yǎng)房標(biāo)準(zhǔn)條件下適應(yīng)性生活1 w 后開始實驗。將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、實驗組、對照組,每組15 只;參照文獻(xiàn)〔7〕建立急性鼻竇炎大鼠模型:將大鼠全身麻醉后,使用2.0 ml(20 mg/ml)利多卡因聯(lián)合0.012 5 mg 腎上腺素,在鼻背下浸潤麻醉,同時在大鼠面中線上中1/3 交界處以45°做切口,將含有0.1 ml(1×109U/L)金黃色葡萄球菌的明膠海綿塞入切口,消毒后縫合切口。造模成功標(biāo)準(zhǔn):以大鼠術(shù)后3 d 不喜運(yùn)動,飲食量日益減少,術(shù)后第4 天大鼠出現(xiàn)搔鼻動作,稍見噴嚏現(xiàn)象,5 d 后較正常大鼠運(yùn)動明顯減少,鼻腔內(nèi)出現(xiàn)清涕,鼻潛艇潮紅,出現(xiàn)搔鼻、噴嚏等癥狀,視為造模成功〔7〕。實驗組和對照組每日分別以10 ml(20 mg/ml)清竇靈合劑和青霉素V 鉀灌胃給藥,正常組和模型組每日以等劑量生理鹽水進(jìn)行灌胃處理,1 次/d,連續(xù)給藥7 d。

1.4 大鼠鼻部癥狀評分 連續(xù)給藥7 d 后,對大鼠鼻部癥狀進(jìn)行評分,評分標(biāo)準(zhǔn)如下〔8〕:30 min 內(nèi)搔鼻(1～4 次)或30 min 內(nèi)噴嚏(1～4 個)或鼻腔內(nèi)有少量流涕或鼻腔充血,輕度癥狀計為1 分;30 min內(nèi)搔鼻(5～9 次)或噴嚏(5～9 個)或鼻腔內(nèi)有較多流涕或鼻腔紅腫,中度癥狀計為2 分;30 min 內(nèi)搔鼻(≥10 次)或30 min 內(nèi)噴嚏(≥10 個)或鼻腔內(nèi)附著分泌物或鼻腔紅腫出血,重度癥狀計為3 分。

1.5 收集血清標(biāo)本及生化檢測其血清標(biāo)本中的白細(xì)胞計數(shù) 在連續(xù)給藥7 d 后,經(jīng)尾靜脈收集各組靜脈血,離心后獲得血清,生化檢測自動儀測定。

1.6 ELISA 檢測血清中AC、cAMP 水平 嚴(yán)格按試劑盒要求進(jìn)行操作,使用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行分析。

1.7 HE 染色觀察鼻黏膜組織的組織病理學(xué)改變留取血清后,處死大鼠,在顯微鏡下佩戴無菌手套,收集鼻黏膜組織,并進(jìn)行液氮封存;取出10%鼻黏膜組織,以多聚甲醛固定,常規(guī)切片后HE 染色,顯微鏡下觀察鼻黏膜病理改變。參照文獻(xiàn)〔9〕采用的評分方法,對大鼠鼻黏膜損傷程度進(jìn)行評價,評分標(biāo)準(zhǔn)為:0 分:無損傷,無病變;1 分:輕度損傷,鼻黏膜上皮輕度水腫,稍見缺損;2 分:中度損傷,黏膜充血水腫較重,部分纖毛彎曲,纖毛排列凌亂,較多的炎性細(xì)胞浸潤;3 分:重度損傷,黏膜上皮缺損嚴(yán)重,壞死嚴(yán)重,出血點(diǎn)較多,纖毛倒伏嚴(yán)重,炎性細(xì)胞大量浸潤。

1.8 電鏡觀察鼻黏膜組織的超微結(jié)構(gòu)改變 從冰箱中取出10%各組大鼠的鼻黏膜組織,分別制成0.3 cm×0.5 cm 大小的超薄組織切片:采用2.5%戊二醛固定8 h,生理鹽水清洗3 次,梯度濃度乙醇脫水,維持-20℃冷凍干燥過夜,掃描和透射電鏡下觀察鼻黏膜組織超微病理結(jié)構(gòu)改變

1.9 免疫組化檢測鼻黏膜組織AQP1 和AQP5 的水平 從冰箱中取出20%大鼠肝組織,常規(guī)固定,脫水,浸蠟,包埋,切片,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后,雞蛋清于37℃下封閉,加入一抗(1 ∶100),4℃孵育過夜,次日加入二抗(1 ∶200),PBS 沖洗后,蘇木素復(fù)染,封片。顯微鏡下觀察結(jié)果。Image Pro Plus8.0 軟件進(jìn)行圖像統(tǒng)計分析。

1.10 Western 印跡檢測鼻黏膜組織中p-PKA、p-CREB 的表達(dá) 從冰箱中取出10%大鼠肝組織,裂解,離心(13 000 r/min,4 ℃,10 min),留取上清,測定濃度后,電泳,轉(zhuǎn)膜,雞蛋清封閉,滴加一抗(1 ∶100),4℃孵育過夜,加入二抗(1 ∶100),PBS 沖洗,顯色,凝膠成像儀下讀取各條帶的灰度值。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 各組鼻部癥狀的評分及血清中白細(xì)胞計數(shù)比較 與正常組相比,模型組鼻部癥狀評分和白細(xì)胞計數(shù)明顯升高(P＜0.05);與模型組相比,實驗組、對照組鼻部癥狀評分和白細(xì)胞計數(shù)明顯降低(P＜0.05),實驗組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),見表1。

2.2 各組血清中AC、cAMP 的水平比較 與正常組相比,模型組血清中AC、cAMP 的水平明顯升高(P＜0.05);與模型組相比,實驗組、對照組血清中AC、cAMP 水平明顯降低(P＜0.05),實驗組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),見表1。

2.3 各組鼻黏膜組織病理改變 正常組鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)完整,纖毛上皮連續(xù),細(xì)胞排列整齊,未見水腫,充血,缺損,炎性浸潤;與正常組相比,模型組呈現(xiàn)典型的炎性改變,鼻黏膜上皮充血,腫脹明顯,細(xì)胞排列紊亂,大量炎性因子浸潤,鼻黏膜損傷病理評分明顯升高(P＜0.05);與模型組相比,實驗組和對照組鼻黏膜損傷明顯緩解,上皮細(xì)胞稍見腫脹,充血點(diǎn)明顯減少,稍見缺損,炎性細(xì)胞浸潤數(shù)量明顯減少,大部分黏膜趨于正常,鼻黏膜損傷病理評分明顯下降(P＜0.05)。實驗組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),見表1。

2.4 電鏡觀察各組鼻黏膜組織的超微結(jié)構(gòu)改變正常組鼻黏膜結(jié)構(gòu)正常,黏膜纖毛密集排列,且整齊均勻,擺動規(guī)律,數(shù)量豐富,纖毛直徑及纖毛長度均一,未見異常。模型組鼻黏膜纖毛或缺失,或排列散亂,纖毛頂端黏連成簇,擺動無規(guī)則,中央微管融合或缺失嚴(yán)重,纖毛膜缺損嚴(yán)重,較多纖毛出現(xiàn)脫落現(xiàn)象。實驗組和對照組鼻黏膜纖毛脫落明顯減輕,纖毛膜較為完整,中央微管結(jié)構(gòu)清晰,趨于完整,偶見粘連,見圖1。

圖1 透射電鏡觀察各組鼻黏膜超微結(jié)構(gòu)改變(× 12 000)

2.5 免疫組化檢測各組鼻黏膜組織中AQP1 和AQP5 的表達(dá) 與正常組相比,模型組鼻黏膜組織中AQP1 表達(dá)明顯增強(qiáng),AQP5 表達(dá)明顯下降(P＜0.05);與模型組相比,實驗組和對照組鼻黏膜組織中AQP1 表達(dá)明顯下降,AQP5 的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05),實驗組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),見表1、圖2。

表1 各組鼻部癥狀評分及血清中白細(xì)胞計數(shù)、AC、cAMP、鼻黏膜損傷評分及AQP1、AQP5 表達(dá)的免疫熒光強(qiáng)度相對值(±s,n=15)

表1 各組鼻部癥狀評分及血清中白細(xì)胞計數(shù)、AC、cAMP、鼻黏膜損傷評分及AQP1、AQP5 表達(dá)的免疫熒光強(qiáng)度相對值(±s,n=15)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;表2 同

組別鼻部癥狀評分(分)白細(xì)胞計數(shù)(×105 U/L)AC(μg/L)cAMP(μg/L)鼻黏膜損傷評分(分)AQP1AQP5正常組1.83±0.624.02±0.5530.51±1.243.64±0.830.22±0.17100.04±1.1199.36±1.25模型組7.85±2.961)8.69±1.071)53.57±2.681)22.67±2.071)2.53±0.341)623.65±25.361) 19.95±2.161)實驗組6.24±1.632)6.28±0.862)42.08±1.652)12.53±2.282)1.97±0.212)245.59±18.622) 64.38±5.642)對照組6.27±1.592)6.31±0.772)42.15±1.592)12.61±2.192)1.99±0.182)247.07±16.252) 63.53±5.722)

圖2 免疫組化檢測各組鼻黏膜組織中AQP1、AQP5 的表達(dá)(× 400)

2.6 Western 印跡檢測各組鼻黏膜組織中p-PKA、p-CREB 的表達(dá) 與正常組相比,模型組鼻黏膜組織p-PKA、p-CREB 表達(dá)明顯升高(P＜0.05);和模型組相比,實驗組和對照組鼻黏膜組織p-PKA、p-CREB 表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。實驗組和對照組蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),見圖3、表2。

表2 各組鼻黏膜組織p-PKA、p-CREB 的相對表達(dá)(±s,n=15)

表2 各組鼻黏膜組織p-PKA、p-CREB 的相對表達(dá)(±s,n=15)

組別AQP1AQP5正常組0.92±0.091.00±0.05模型組7.75±0.271)4.59±0.351)實驗組2.26±0.372)2.24±0.212)對照組2.32±0.282)2.28±0.162)

圖3 Western 印跡法檢測各組鼻黏膜組織中p-PKA、p-CREB 的表達(dá)

3 討 論

鼻竇炎是累及上頜竇、篩竇、額竇和蝶竇等部位炎性疾病,屬于常見耳鼻喉科疾病,易發(fā)于各種人群。臨床上以鼻塞,頭痛,流膿涕為主要癥狀。如果不能及時控制癥狀,易引發(fā)中耳炎、上頜骨髓炎、腦膜炎等重癥并發(fā)癥。

鼻竇炎在中醫(yī)上屬于“鼻淵”范疇,在針對鼻竇炎的治療方面,中醫(yī)藥從辯證角度出發(fā),針對患者進(jìn)行個體化治療,多種治療手段并行,并且其副作用小,療效穩(wěn)定,展示了獨(dú)特的優(yōu)勢〔10,11〕。潘慶春等〔12〕研究證實采用溫針灸聯(lián)合通竅鼻炎方治療慢性鼻竇炎后,能明顯改善患者生活質(zhì)量,降低鼻部炎性反應(yīng),提高臨床療效。姚期等〔13〕研究表明健脾化濁通竅湯針對難治性慢性-鼻-鼻竇炎具有良好的臨床治療效果。清竇靈合劑是在中醫(yī)思想指導(dǎo)下由細(xì)辛、辛夷等10 余味中藥組成的傳統(tǒng)方劑。李良波等〔14〕通過臨床研究報道清竇靈合劑在促進(jìn)鼻黏膜纖毛功能早期恢復(fù),緩解患者癥狀,減輕患者鼻腔上皮水腫,減少肉芽形成方面療效顯著。

研究表明〔15〕AQP 是一類細(xì)胞膜上負(fù)責(zé)水的分泌與吸收的進(jìn)化高度保守的蛋白分子,是水分子進(jìn)出細(xì)胞的主要通道,是維系細(xì)胞內(nèi)外水平衡的關(guān)鍵因子。研究顯示〔16〕AQP1,AQP5 等在鼻腔黏膜中的表達(dá)與鼻腔的分泌行為關(guān)系密切。黎橋等〔17〕研究證實下調(diào)AQP1,AQP5 的表達(dá)能明顯緩解變應(yīng)性大鼠的流膿涕,撓鼻及噴嚏等癥狀。AC/cAMP 通路是外界刺激因子與細(xì)胞內(nèi)信號分子在細(xì)胞膜表面進(jìn)行轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵通路〔18〕。研究表明〔19〕在應(yīng)激條件下,三磷酸腺苷在AC 的作用下生成第二信使cAMP,cAMP 促使PKA 磷酸化。PKA 活化后,一方面p-PKA 可直接作用于AQP 的氨基酸序列而調(diào)節(jié)AQP表達(dá),另一方面〔20〕p-PKA 進(jìn)入胞核,激活CREB,使CREB 發(fā)生磷酸化,將信號入核,影響相關(guān)基因以及轉(zhuǎn)錄子的表達(dá),調(diào)控AQP 的表達(dá)。Chen 等〔21〕研究證實抑制AC/cAMP 通路能明顯抑制AQP 表達(dá),改善膽固醇結(jié)石小鼠膽細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性。Chang等〔22〕研究表明抑制人鼻上皮細(xì)胞上的AC/cAMP 的表達(dá),能明顯上調(diào)AQP5 表達(dá),緩解人鼻上皮細(xì)胞的水腫狀況。清竇靈合劑的治療作用可能與抑制AC/cAMP 通路,調(diào)控AQP1,AQP5 表達(dá)有關(guān)。