活性氧介導(dǎo)椎間盤髓核細(xì)胞焦亡調(diào)控炎癥反應(yīng)

付豪永 王月田 孫浩林 (北京大學(xué)第一醫(yī)院骨科,北京 100034)

終板炎(Modic)改變是老年人下腰痛(LBP)最重要的原因之一。LBP 導(dǎo)致全球疾病勞力喪失,成為世界范圍內(nèi)主要健康負(fù)擔(dān)〔1,2〕。LBP 發(fā)病因素復(fù)雜多樣,但其主要為多因素共同作用的結(jié)果。既往研究發(fā)現(xiàn),腰椎間盤退行性變是LBP 發(fā)生的原因之一〔3,4〕。但是目前越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),Modic 也能夠引起LBP 改變,而且是中重度LBP 的主要原因之一。Modic 改變椎間盤中存在高水平的活性氧(ROS),它與許多年齡相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān),包括椎間盤疾病(IVDD)。髓核細(xì)胞中,氧化應(yīng)激抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)過(guò)早衰老,并促進(jìn)基質(zhì)分解代謝加重退變。所以,ROS 可能作為Modic 改變發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵刺激因素。焦亡是炎性細(xì)胞死亡的過(guò)程,能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng),使細(xì)胞腫脹,細(xì)胞破裂和促炎因子釋放,保護(hù)宿主免受病原微生物感染〔5〕。然而,焦亡過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致炎癥性疾病,如膿毒癥和自身免疫性疾病。在外界刺激存在時(shí),經(jīng)典途徑對(duì)病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(DAMP)作出反應(yīng)〔6,7〕。然后,外界刺激會(huì)促使模式識(shí)別受體(PRR)招募凋亡相關(guān)斑點(diǎn)蛋白,其含有CARD C 端招募域(ASC)的接頭蛋白并激活效應(yīng)器半胱氨酸天冬氨酸前體(pro-caspase)-1,形成炎癥小體復(fù)合物。隨著pro-caspase-1 成熟為Caspase-1,引起GSDMD-N 末端的暴露形成細(xì)胞膜孔,使細(xì)胞內(nèi)合成的白細(xì)胞介素(IL)-1β 和IL-18 炎癥因子通過(guò)細(xì)胞膜孔釋放至細(xì)胞外,引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生〔8,9〕。鑒于焦亡在下腰痛伴Modic 改變椎間盤中存在以下幾個(gè)問(wèn)題:尚無(wú)確切報(bào)道;Modic 改變中高ROS 水平是否會(huì)引起炎癥反應(yīng)和焦亡,三者之間的關(guān)系如何。因此,本文將驗(yàn)證髓核細(xì)胞內(nèi)ROS、焦亡、炎癥之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 髓核組織標(biāo)本收集及納入、排出標(biāo)準(zhǔn) 納入的髓核組織樣本來(lái)源于北京大學(xué)第一醫(yī)院住院患者,均來(lái)自本課題組經(jīng)椎間孔鏡(PELD)隊(duì)列。在研究開(kāi)展前,每名捐贈(zèng)髓核組織的患者均簽署知情同意書, 并且本研究已通過(guò)倫理委員會(huì)審批(No.2020417)。納入標(biāo)準(zhǔn):①根據(jù)術(shù)前影像學(xué)資料,診斷為腰椎間盤突出癥,腰椎管狹窄癥,退變性腰椎滑脫癥,腰椎退變性側(cè)彎且Pfirrmann 分級(jí)Ⅲ～Ⅴ級(jí),磁共振影像顯示伴有(Modic 組13 例)或不伴有Modic 改變的患者(對(duì)照組14 例);②年齡40～70 歲,性別不限。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并腫瘤疾病,傳染病,如脊柱結(jié)核感染等;②拒絕參加本研究;③既往有脊柱手術(shù)病史。對(duì)照組男8 例,女6 例,平均年齡(55.26±7.39)歲;Modic 組男8 例,女5 例,平均年齡(58.40±8.02)歲。兩組性別、年齡基線資料無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

1.2 髓核組織免疫組化染色 通過(guò)免疫組化染色法檢測(cè)Modic 組,對(duì)照組椎間盤內(nèi)ASC 蛋白表達(dá)差異,方法如下:分離髓核組織:手術(shù)室所取標(biāo)本在超凈臺(tái)中用磷酸緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗,洗盡血漬。加入4%多聚甲醛覆蓋整個(gè)髓核組織,4℃過(guò)夜。切片機(jī)將蠟塊切割為5 μm 的薄片,用溫水使其平整,覆蓋于玻璃片上,用烤箱烘干備用。系列處理后,封片后觀察結(jié)果。

1.3 Modic 髓核檢測(cè)ROS 將對(duì)數(shù)期髓核細(xì)胞1×105接種至共聚焦培養(yǎng)皿中,加入8% FBS/F12 培養(yǎng)基,放入孵箱中培養(yǎng)。待髓核細(xì)胞貼壁后,加入2 ml DCFH-DA 工作液,37℃孵箱孵育30 min。加入2 ml Hochest33258 染液,37℃孵箱繼續(xù)孵育30 min。上機(jī)進(jìn)行熒光檢測(cè)。

1.4 大鼠髓核細(xì)胞的提取 酒精噴布大鼠尾部消毒,獲取整根大鼠尾部。用手術(shù)刀在大鼠尾部皮膚縱向切開(kāi),借助紗布沿切口剝離大鼠尾部皮膚,兩手持椎間盤兩側(cè)椎體,用力向不同方向擠壓針刺的破口椎間盤,將白色凝膠狀髓核擠出。并加入2% Ⅱ型膠原酶1.5 h 后,完全培養(yǎng)基終止消化,得到單細(xì)胞懸液,進(jìn)行髓核細(xì)胞培養(yǎng)。

1.5 髓核細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)細(xì)胞活力在96 孔板內(nèi)接種1×104個(gè)/孔,共100 μl,在孵箱內(nèi)37℃,5% CO2培養(yǎng)24 h 貼壁。吸除培養(yǎng)基,加入不同濃度H2O2100 μl 在孵箱內(nèi)孵育3 h。每孔加入10 μl LDH 液。細(xì)胞孵箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h。取出96 孔板,用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光值。

1.6 掃描電鏡觀察髓核細(xì)胞膜結(jié)構(gòu) 利用不同濃度H2O2處理10 cm 皿P3 代髓核細(xì)胞,后將0.05%胰酶加入至培養(yǎng)皿中,將細(xì)胞消化為細(xì)胞懸液,1 000 r/min離心5 min,棄上清液。吸取1 ml 戊二醛固定液,沿離心管壁輕輕滴加覆蓋樣品,固定過(guò)夜。使用不同濃度的乙醇使樣品脫水,在CO2臨界點(diǎn)烘干機(jī)中干燥。用雙面導(dǎo)電膠帶把樣品黏附于上樣臺(tái)中,離子濺射后通過(guò)電子顯微鏡觀察拍照。

1.7 免疫熒光檢測(cè)髓核細(xì)胞氧化應(yīng)激模型Hochest33258/PI 雙染 加入2 ml Hochest33258,37℃,5% CO2孵箱培養(yǎng)30 min。用535 nm 激發(fā)波長(zhǎng),615 nm 發(fā)射波長(zhǎng)的濾光器的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

1.8 生物信息學(xué)分析胞外刺激對(duì)髓核細(xì)胞表觀遺傳學(xué)影響 在Pubmed 網(wǎng)站檢索GSE42611 數(shù)據(jù)集,將數(shù)據(jù)集內(nèi)兩組不同處理方式的細(xì)胞樣品進(jìn)行分組,進(jìn)入G2R 分析差異基因。將獲得的差異基因整理為Excel 形式,按照FDR-校正P＜0.01 并且差異倍數(shù)(FC)＜-1 或＞1 對(duì)差異基因進(jìn)一步篩選,進(jìn)行基因本體論數(shù)據(jù)庫(kù)(GO)與京都基因和基因組百科全書(KEGG)的分析。GO 富集分析,涵蓋生物學(xué)三大層次,如細(xì)胞組分(CC),分子功能(MF),生物過(guò)程(BP)。KEGG 分析,涵蓋細(xì)胞生化過(guò)程,如代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)傳遞、酶反應(yīng)等,將差異基因與生物在線基因組數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)基因集進(jìn)行比對(duì)。

1.9 Western 印跡 從4℃冰箱中取出預(yù)制膠,用電泳液清洗干凈,將玻璃板安裝至電泳槽內(nèi),加入預(yù)制膠電泳液,使其充滿于兩板之間。各泳道依次加入樣品蛋白及蛋白預(yù)染液。取相應(yīng)長(zhǎng)寬的聚偏氟乙烯(PVDF)膜,并將其放入甲醇中活化1 min,取出放入電轉(zhuǎn)液中30 min。

1.10 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)髓核細(xì)胞氧化應(yīng)激模型IL-18 合成與分泌 過(guò)氧化氫母液10 mmol/L 成不同濃度的 H2O2。每孔按照1×105個(gè)/ml接種至96 孔板,加入不同濃度H2O2處理3 h。檢測(cè)不同濃度過(guò)氧化氫刺激髓核細(xì)胞后合成和分泌IL-18 的情況,具體步驟同說(shuō)明書。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或單因素方差分析,GraphPad Prism9.0 繪制圖片。

2 結(jié) 果

2.1 兩組術(shù)前腰椎功能及疼痛程度視覺(jué)模擬評(píng)分(VAS) 術(shù)前磁共振影像學(xué)見(jiàn)圖1。Modic 組腰部VAS〔(5.60±2.66)分〕顯著高于對(duì)照組〔(3.50±2.25)分,P＜0.05〕。

圖1 Modic 組不同核磁加權(quán)象

2.2 Modic 改變椎間盤標(biāo)本HE 染色病理學(xué)觀察相比對(duì)照組,Modic 組切片組織完整性較差,髓核細(xì)胞核漲大,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物含量較多,有明顯的形態(tài)學(xué)改變,提示Modic 改變髓核細(xì)胞的通透性可能發(fā)生改變。見(jiàn)圖2。

圖2 Modic 改變椎間盤標(biāo)本(HE 染色,×10)

2.3 Modic 改變臨床組織標(biāo)本焦亡的Western 印跡和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測(cè) 依據(jù)經(jīng)典Modic 改變影像學(xué)診斷指標(biāo)和Pfirrmann 分類標(biāo)準(zhǔn),納入分級(jí)為Ⅳ級(jí)伴或不伴Modic 改變組織進(jìn)行髓核組織切片,行免疫組化ASC、CD3+、CD8+蛋白染色如圖3 所示,箭頭表示兩組各蛋白染色的陽(yáng)性細(xì)胞,Modic 組炎癥和焦亡相關(guān)蛋白均高于對(duì)照組。與對(duì)照組比較,Modic 組焦亡相關(guān)ASC 蛋白含量較高,炎癥相關(guān)蛋白CD3+,CD8+顯著升高。Modic 組髓核組織中NLRP3 表達(dá)量(0.72±0.14)較對(duì)照組(0.36±0.14)明顯增加(P＜0.05)。見(jiàn)圖4。用10 例患者行生物學(xué)重復(fù),qPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組(1.00±0.00、1.00±0.00)比較,ASC(7.52±3.21)、IL-1β mRNA 表達(dá)量(1.98±0.26)在Modic 組顯著增加(P＜0.05)。

圖3 兩組焦亡相關(guān)蛋白(免疫組化染色,×10)

圖4 Western 印跡檢測(cè)兩組NLRP3 蛋白表達(dá)

2.4 Modic 改變臨床標(biāo)本ROS 含量 與對(duì)照組相比,Modic 組免疫熒光顯示細(xì)胞內(nèi)ROS 水平更高。見(jiàn)圖5。因此,在Modic 改變中可能存在調(diào)節(jié)ROS水平并起到平衡作用機(jī)制的功能基因或通路。

圖5 免疫熒光比較不同組間ROS 水平(×100)

2.5 處理后細(xì)胞活力檢測(cè)和胞外LDH 釋放檢測(cè)3 次平行試驗(yàn)檢測(cè)胞外LDH 釋放發(fā)現(xiàn),當(dāng)H2O2濃度在400 μmol/L(吸光值0.16±0.27)和500 μmol/L(吸光值0.5 ± 0.15)時(shí),相較于0 μmol/L(吸光值-0.17±0.16),細(xì)胞膜完整性受到嚴(yán)重破壞,大量LDH 從細(xì)胞內(nèi)釋放,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。100、200、300 μmol/L H2O2處理后LDH 釋放吸光值分別為-0.10±0.12、0.11±0.08、-0.03±0.25。

2.6 髓核細(xì)胞焦亡形態(tài)學(xué)特征 0、400、500 μmol/L濃度H2O2處理髓核細(xì)胞3 h,掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),0 μmol/L處理的髓核細(xì)胞,細(xì)胞膜完整,而400、500 μmol/L 處理的細(xì)胞膜出現(xiàn)較多孔隙,同時(shí)細(xì)胞膜周圍出現(xiàn)大量空泡。見(jiàn)圖6。

圖6 倒置顯微鏡掃描電鏡觀察不同濃度H2O2 處理髓核細(xì)胞3 h 焦亡形態(tài)

2.7 氧化應(yīng)激模型髓核細(xì)胞PI 陽(yáng)性率檢測(cè) 當(dāng)400 μmol/L 及以上H2O2處理時(shí)髓核細(xì)胞PI 染色陽(yáng)性細(xì)胞增多。見(jiàn)圖7。

圖7 髓核氧化應(yīng)激模型免疫熒光檢測(cè)PI 陽(yáng)性細(xì)胞(×100)

2.8 生物信息學(xué)分析胞外刺激對(duì)髓核細(xì)胞表觀遺傳學(xué)影響 GO 條目明顯富集于“對(duì)氧水平反應(yīng)”,“細(xì)胞因子調(diào)節(jié)”“IL-1 反應(yīng)”“正向調(diào)控細(xì)胞死亡”,受到胞外刺激與髓核細(xì)胞活性氧水平顯著相關(guān)。同時(shí),髓核細(xì)胞與IL-1 及細(xì)胞內(nèi)其他炎癥因子產(chǎn)生也存在顯著功能富集。胞外刺激對(duì)髓核細(xì)胞本身發(fā)生凋亡、鐵死亡等細(xì)胞死亡顯著富集。KEGG 通路明顯富集于“PI3K-AKT 信號(hào)通路”“TNF 信號(hào)通路”“NOD 樣受體信號(hào)通路”“細(xì)胞因子受體相互作用”相關(guān)通路。其中PI3K-AKT 能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等細(xì)胞表型。TNF、NOD 樣受體通路與細(xì)胞的炎癥等表型相關(guān)。見(jiàn)圖8。

圖8 生物信息學(xué)GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)分析胞外刺激對(duì)髓核細(xì)胞表觀遺傳學(xué)影響

2.9 ELISA 檢測(cè)氧化應(yīng)激模型IL-18 水平改變 氧化應(yīng)激后髓核細(xì)胞釋放至胞外的IL-18 水平在300、500 μmol/L H2O2刺激時(shí)顯著升高(P＜0.05,P＜0.001);實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示氧化應(yīng)激后髓核細(xì)胞內(nèi)合成的IL-18 水平在300、400、500 μmol/L H2O2刺激時(shí)顯著升高(P＜0.05,P＜0.001)。見(jiàn)表1。

表1 ELISA 檢測(cè)不同濃度H2O2 刺激時(shí)髓核細(xì)胞氧化應(yīng)激炎癥因子改變(±s,pg/ml,n=3)

表1 ELISA 檢測(cè)不同濃度H2O2 刺激時(shí)髓核細(xì)胞氧化應(yīng)激炎癥因子改變(±s,pg/ml,n=3)

與0 μmol/L H2O2 比較:1)P＜0.05,2)P＜0.001

指標(biāo)0 μmol/L300 μmol/L400 μmol/L500 μ mol/L IL-18 合成23.96±1.7628.01±2.181)32.43±0.972)34.41±0.162)IL-18 釋放30.18±3.1333.87±1.281)32.97±0.5444.41±2.722)

3 討 論

下腰痛作為世界上最嚴(yán)重的致殘性疾病之一,會(huì)對(duì)老年人造成嚴(yán)重的不良后果,不僅增加醫(yī)療負(fù)擔(dān)也使患者損失工作能力〔10〕。有研究報(bào)道LBP 的發(fā)病因素復(fù)雜多樣,其中椎間盤發(fā)生Modic 改變是一個(gè)重要因素〔11,12〕。通過(guò)研究,發(fā)現(xiàn)Modic 改變中存在氧化應(yīng)激狀態(tài)。同時(shí),根據(jù)既往研究報(bào)道,亞細(xì)胞毒性濃度的H2O2可以增加細(xì)胞內(nèi)ROS 水平,激活應(yīng)激相關(guān)通路。同時(shí),退變椎間盤中羧甲基賴氨酸的存在表明氧化應(yīng)激也可能是導(dǎo)致椎間盤退變的一個(gè)因素。因此基于研究結(jié)果和現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道,做出假設(shè)ROS 可能是存在于Modic 改變椎間盤內(nèi)刺激因素之一?；贛odic 改變髓核細(xì)胞內(nèi)高ROS水平,炎癥相關(guān)蛋白高表達(dá),認(rèn)為Modic 改變患者下腰痛可能與炎癥相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ROS 水平升高與髓核細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)和焦亡的關(guān)系,本研究利用H2O2刺激椎間盤髓核細(xì)胞,以構(gòu)建高ROS水平的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型。通過(guò)免疫熒光檢測(cè)不同濃度H2O2處理后,髓核細(xì)胞內(nèi)ROS 水平,發(fā)現(xiàn)400 μmol/L,500 μmol/L 均能過(guò)有效提高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平,且細(xì)胞活力有保證。根據(jù)既往研究報(bào)道焦亡有三大特征〔13〕,如細(xì)胞膜孔形成、細(xì)胞脹大溶解和細(xì)胞內(nèi)容物釋放。本研究利用掃描電鏡對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)一步深入觀察,發(fā)現(xiàn)處理后的髓核細(xì)胞比對(duì)照組有更多的“膜孔”,膜孔的增加為椎間盤髓核細(xì)胞焦亡的發(fā)生提供有力證據(jù)。

為定量準(zhǔn)確的驗(yàn)證處理后的椎間盤髓核細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性發(fā)生損害,本研究檢測(cè)了LDH 的細(xì)胞外釋放量。細(xì)胞生物學(xué)中可知,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的酶釋放到培養(yǎng)液里,其中包括酶活性較為穩(wěn)定的LDH,通過(guò)檢測(cè)從質(zhì)膜破裂細(xì)胞中釋放到培養(yǎng)液中的LDH 的活性,就可以定性的反應(yīng)細(xì)胞膜完整性,是膜完整性的重要指標(biāo)〔14〕。

為了得到生物信息學(xué)方面的多層次認(rèn)證,本研究通過(guò)挖掘GEO 發(fā)現(xiàn),類似于胞外ROS 刺激的其他外界刺激如TNF-α 和IL-1β 對(duì)椎間盤髓核細(xì)胞干預(yù),顯著富集椎間盤髓核細(xì)胞內(nèi)活性氧水平條目和炎癥因子產(chǎn)生等條目,而炎癥因子的產(chǎn)生是焦亡的一大特征〔15〕。最重要的是,該基因集明顯富集于多種調(diào)控性細(xì)胞死亡如凋亡、焦亡、鐵死亡等,為本研究在生物信息學(xué)層面提供支持。綜上,椎間盤髓核細(xì)胞內(nèi)ROS 水平升高,會(huì)導(dǎo)致髓核細(xì)胞焦亡和炎癥狀態(tài)的發(fā)生。