利拉魯肽通過抑制核因子κB對(duì)糖尿病腎病小鼠的治療作用

張靜 樊文星 楊玥娜 蘇鳳 Mali Niroj( 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科,云南 昆明 65003; 昆明醫(yī)科大學(xué))

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)常見的、嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥,是世界范圍內(nèi)終末期腎臟病(ESRD)的最常見病因之一〔1〕。中國流行病學(xué)調(diào)查研究數(shù)據(jù)表明,DN 已成為我國住院慢性腎臟病(CKD)患者和成人終末期腎病的首要病因〔2〕。DN發(fā)病與炎癥反應(yīng)及細(xì)胞因子的分泌異常關(guān)系密切,核因子(NF)-κB 是一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)節(jié)多種基因表達(dá),參與炎癥免疫反應(yīng),在DN 發(fā)病中起重要作用〔3〕。胰島血糖素樣肽(GLP)-1 受體激動(dòng)劑是近年來新型的降糖藥物,其主要通過與細(xì)胞膜表面的GLP-1 受體結(jié)合,激活下游的信號(hào)通路,發(fā)揮生物學(xué)作用,其受體廣泛分布于腎臟、心臟、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腸道、中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)等〔3,4〕。利拉魯肽是臨床上較常用的一種長(zhǎng)效GLP-1 受體激動(dòng)劑,與天然的人GLP-1 具有97%的同源性〔4〕。利拉魯肽能夠減輕氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng),減少DM 大鼠尿蛋白的含量,延緩DN 的進(jìn)展,同時(shí)能抑制DM 大鼠心肌細(xì)胞凋亡,并對(duì)血壓、血脂產(chǎn)生有益影響,表明該受體的多向表達(dá)與GLP-1 受體激動(dòng)劑的多器官保護(hù)作用可能有關(guān)〔3,5〕,但其具體分子機(jī)制尚不明確。本研究旨在證實(shí)利拉魯肽對(duì)DN 小鼠的治療作用,并探討其可能的治療機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 藥品、試劑、主要儀器 利拉魯肽注射液(丹麥諾和諾德公司),鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司),SYBR Green Master(美國羅氏公司),RNA 提取試劑盒(美國Omega 公司)。抗體包括β-actin 鼠一抗、NF-κB 鼠一抗、山羊抗鼠二抗從北京Abmaking 生物技術(shù)有限公司獲得,Taq 酶和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara 公司)。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增儀(美國ABI 公司),微核酸檢測(cè)儀(中國北京原平昊生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼料 30 只雄性6 周齡C57BL/6小鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司),體重18～23 g。小鼠飼料(上?；蛏锟萍加邢薰?,標(biāo)準(zhǔn)飼料:蛋白質(zhì)18%,脂肪4%,碳水化合物49%。高脂飼料:蛋白質(zhì)18%,脂肪35%,碳水化合物18%。實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 DN 小鼠模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組 30 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w 后隨機(jī)分為正常對(duì)照組(對(duì)照組),DN 組和利拉魯肽(DN+利拉魯肽)組,每組10 只。DN 組和利拉魯肽組予以50 mg/kg 劑量隔天一次腹腔注射由檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制STZ 溶液3 次,并同時(shí)喂養(yǎng)高脂飲食以建立DN 模型。對(duì)照組予注射等量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液并標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。4 w 后連續(xù)3 d 測(cè)隨機(jī)血糖,小鼠的血糖水平≥2 g/L,腎功能和尿蛋白指標(biāo)顯著高于對(duì)照組,DN 模型建立成功。利拉魯肽組每日腹腔注射200 μg/kg利拉魯肽,DN 組及對(duì)照組腹腔注射等量的生理鹽水。3 組連續(xù)干預(yù)6 w,在此期間喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料。

1.4 標(biāo)本采集及生化指標(biāo)測(cè)定 小鼠禁食12 h,代謝籠中收集尿液標(biāo)本。自動(dòng)生化儀檢測(cè)尿中的微量白蛋白尿(MAU)、N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)。稱重小鼠,麻醉小鼠眼瞼取血后用自動(dòng)生化分析儀分析血糖(GLU)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)及腎功能指標(biāo)包括尿素(UR)、肌酐(CR)和尿酸(UA)。頸椎脫臼法處死小鼠留取腎臟標(biāo)本。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)腎組織中NF-κB 信使核糖核酸(mRNA)的表達(dá) RNA 提取試劑盒提取腎組織總RNA,提取2 μg RNA,以寡核苷酸(dT)作為通用引物:NF-κB 基因的上游引物:5′-ACCGCCGTGCAGGATGAGA-3′,下游:5′-ACGGCCAAGTGCAGAGGTGTC-3′,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。實(shí)時(shí)PCR 體系:1 μl cDNA,1 μl 引物,10 μl SYBR Green 熒光染料和7 μl 無菌蒸餾水。反應(yīng)過程:50℃加熱2 min,95℃預(yù)變性10 min,95℃變性15 s,60℃退火1 min,擴(kuò)增40 次,測(cè)定NF-κB mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 Western 印跡檢測(cè)腎組織中NF-κB 蛋白的表達(dá) 腎組織中加入磷酸鹽緩沖液(PBS)+蔗糖溶液研磨離心,提取總蛋白,微核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)蛋白質(zhì)濃度。取蛋白質(zhì)溶液于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,轉(zhuǎn)膜,5%牛血清白蛋白(BSA)緩沖液(TBST)封閉膜2 h。加入NF-κB 抗體4℃孵育過夜,加入二抗,室溫孵育2 h,加入辣根過氧化物酶顯色。β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參,成像系統(tǒng)檢測(cè)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果,應(yīng)用ImageJ 軟件計(jì)算光密度,進(jìn)行組間比較。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 3組血液生化指標(biāo)的比較 DN 組GLU、TC、TG、LDL 及體重均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01,P＜0.05),HDL 顯著低于對(duì)照組(P＜0.01);利拉魯肽組GLU、TC、TG、LDL 及體重顯著低于DN 組,而HDL 顯著高于DN 組(P＜0.05),見表1。

表1 3 組血液生化指標(biāo)的比較(±s,n=10)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.01,2)P＜0.05;與DN 組比較:3)P＜0.05

組別GLU(g/L)TC(mg/L)TG(mg/L)HDL(mg/L)LDL(mg/L)體重(g)27.28117.54±6.7331.12±1.71 DN 組3.65±0.482)1 558.25±7.191)1 031.67±78.152)445.17±52.232)159.12±8.932)35.11±1.942)利拉魯肽組3.03±0.253)786.44±9.233)862.21±80.163)658.05±64.743)112.14±5.073)33.73±1.803)對(duì)照組1.16±0.07825.34±6.41647.32±15.68563.32±

2.2 3組尿液中微蛋白含量比較 DN 組MAU 和NAG 顯著高于對(duì)照組(P＜0.01);利拉魯肽組MAU和NAG 顯著低于DN 組(P＜0.05),見表2。

2.3 3組血液中UR、CR 和UA 含量比較 DN 組UR、CR 和UA 顯著高于對(duì)照組(P＜0.01);利拉魯肽組UR、CR 和UA 顯著低于DN 組(P＜0.05),見表2。

2.4 3組腎組織NF-κB mRNA 和蛋白表達(dá)比較DN 組NF-κB mRNA 水平和蛋白顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。與DN 組相比,利拉魯肽組NF-κB mRNA 和蛋白水平顯著降低(P＜0.05),見表2。

表2 3 組尿液中微蛋白含量、血液中UR、CR 和UA 含量及腎組織NF-κB mRNA 蛋白相對(duì)表達(dá)的比較(±s,n=10)

表2 3 組尿液中微蛋白含量、血液中UR、CR 和UA 含量及腎組織NF-κB mRNA 蛋白相對(duì)表達(dá)的比較(±s,n=10)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.01;與DN 組比較:2)P＜0.05

組別MAU/CR(mg/μmol)NAG/CR(U/μmol)UR(mmol/L)CR(μmol/L)UA(μmol/L)NF-κB mRNANF-κB 蛋白對(duì)照組0.85±0.184.62±1.549.23±0.7131.67±1.2128 1.16±32.6720.42±2.713.04±1.21 DN 組3.37±1.011)9.66±3.011)17.45±1.781)39.85±0.931)376.35±8.711)52.94±6.321)7.71±1.941)利拉魯肽組1.66±0.772)8.01±1.992)11.92±1.132)34.46±1.622) 324.15±19.062) 36.71±4.132)5.19±1.422)

3 討 論

在1 型或2 型DM 患者中有25%～40%發(fā)生DN,DN 患者有發(fā)展為ESRD 的較高風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)有較高的心血管疾病發(fā)病率及死亡率〔6〕,強(qiáng)調(diào)了早期預(yù)防、識(shí)別和及時(shí)治療的重要性。

在T2DM 患者中觀察到,餐后高脂血癥是DM性血脂異常的重要特征〔7〕,這是乳糜微粒產(chǎn)量增加和乳糜微粒清除率降低的結(jié)果,乳糜微粒產(chǎn)生的增加與腸道載脂蛋白(Apo)B48 分泌速率的增加和腸內(nèi)微粒體TG 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MTP)表達(dá)的增加有關(guān)〔8〕。研究〔8〕發(fā)現(xiàn):利拉魯肽1.2 mg/d 治療T2DM 患者6 個(gè)月后,體重、空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、胰島素抵抗(HOMA-IR)、TG、TC 和ApoB顯著降低,LDL 略有下降;動(dòng)物實(shí)驗(yàn):利拉魯肽治療1 w 后,顯著降低小鼠血漿TG 負(fù)荷;其體外實(shí)驗(yàn)表明:利拉魯肽可顯著降低腸組織中乳糜微粒合成相關(guān)基因ApoB48,二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)1和MTP 的表達(dá)?？傊?利拉魯肽可顯著降低T2DM和典型DM 血脂異常,其機(jī)制可能是多方面的,腸組織中GLP-1 受體的存在強(qiáng)化了利拉魯肽可能對(duì)腸道的直接作用〔8,9〕。

一項(xiàng)納入9 340 例T2DM 伴心血管疾病(CVD)高風(fēng)險(xiǎn)患者的多中心、國際、隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的3B 期臨床試驗(yàn)LEADER〔10,11〕,其隨訪中位數(shù)時(shí)間3.8年,該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的二次分析研究結(jié)果顯示利拉魯肽致復(fù)合腎結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)低于安慰劑組,其中主要?dú)w因于新發(fā)持續(xù)大量白蛋白尿發(fā)生率減少,其風(fēng)險(xiǎn)減少達(dá)26%,表明利拉魯肽可延緩DN 的發(fā)生和發(fā)展。

T2DM 是一種慢性低度炎癥性疾病,T2DM 及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展涉及多種炎癥因子〔12〕。既往研究中已發(fā)現(xiàn)利拉魯肽可抑制炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)的表達(dá)〔3〕。NF-κB 有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。正常細(xì)胞中,NF-κB 與其抑制蛋白I-κB 家族的成員結(jié)合,當(dāng)細(xì)胞受到刺激,I-κB發(fā)生磷酸化,在蛋白水解酶作用下發(fā)生降解,從而使NF-κB 活化并進(jìn)入細(xì)胞核中,與相應(yīng)靶序列結(jié)合,調(diào)控多種基因的表達(dá),包括單核細(xì)胞趨化因子(MCP)-1、IL-6、TNF-α、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、IL-1β 等基因,從而在炎癥反應(yīng)中起重要作用〔3,13,14〕。本研究提示,利拉魯肽可通過抑制炎癥因子來治療DN 小鼠。研究表明,利拉魯肽對(duì)DM 大鼠的腎臟保護(hù)作用,并不依賴于血糖、體重的降低,它可通過與腎組織中GLP-1 受體結(jié)合,抑制腎組織局部炎性因子的分泌,抑制炎癥反應(yīng)過程〔3〕。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是NF-κB 較重要的上游激酶,在高糖狀態(tài)下可被上游信號(hào)、細(xì)胞因子及理化因素所激活,使NF-κB 活化進(jìn)入細(xì)胞核,促進(jìn)炎性基因的表達(dá)與炎性因子的分泌,從而加重DN, 與 DN 密切相關(guān)的 MAPK 有 p38MAPK、ERKl/2、JNK〔3〕,其具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)研究炎癥因子相對(duì)單一,與DN 相關(guān)的NF-κB 信號(hào)通路是下一個(gè)研究方向。