USP9X基因表達(dá)下調(diào)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞株增殖和細(xì)胞周期的影響

張彩鳳 張超群 杜學(xué)芳 夏永華 張利利(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科,河南 新鄉(xiāng) 45300; 皮膚科)

泛素化通過(guò)調(diào)控泛素與去泛素化酶(DUBs)而參與多種蛋白功能的調(diào)控〔1,2〕,其中以泛素特異性肽酶(USPs)作用最為顯著〔3〕。X 染色體連鎖的泛素特異性肽酶-9(USP9X)作為USPs 家族成員之一,在不同的腫瘤中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用〔4～8〕。USP9X 在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá),其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和腫瘤分期等密切相關(guān),且USP9X 高表達(dá)能降低胃癌患者總生存率,是胃癌患者獨(dú)立的不良預(yù)后因子〔9〕。然而,USP9X 如何調(diào)控胃癌發(fā)生發(fā)展的病理生理過(guò)程尚不明確。因此,本研究探討USP9X 在人胃癌組織中的表達(dá)水平,同時(shí)采用USP9X siRNA 轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株AGS,分析其表達(dá)下調(diào)后對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖和周期的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 隨機(jī)選擇新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科5 例胃癌患者癌組織,5 例非胃癌患者行胃鏡檢查時(shí)獲取的正常胃黏膜組織,組織標(biāo)本均保存于液氮中備用,且組織標(biāo)本均經(jīng)過(guò)組織病理學(xué)證實(shí)。本研究所用組織標(biāo)本均得到患者及家屬同意,且簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640 購(gòu)自美國(guó)Life Technologies 公司;胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司;鏈霉素和青霉素及CCK-8 試劑盒均購(gòu)自中國(guó)碧云天生物科技有限公司;USP9X siRNA 及其對(duì)照siRNA 購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司;脂質(zhì)體2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;USP9X 和β-actin 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司;碘化丙啶購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株AGS、SGC-7901 和BGC-823 及人胃正常上皮細(xì)胞株GES-1 均從中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買。細(xì)胞培養(yǎng)液為:RPMI1640(Life Technologies,Grand Island,New York,USA)、10% 胎牛血清(Hyclone Laboratories,Logan,UT,USA)、100 μg/ml 的鏈霉素和100 U/ml 的青霉素,置于含有5%CO2并恒溫37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 USP9X siRNA 轉(zhuǎn)染及分組 當(dāng)AGS 細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右,將USP9X siRNA 及其對(duì)照siRNA(美國(guó)Santa Cruz 公司)按照脂質(zhì)體2000 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作,并于轉(zhuǎn)染后的48 h 進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3 組:AGS 組(AGS 細(xì)胞未經(jīng)過(guò)特殊處理)、對(duì)照siRNA 組(對(duì)照siRNA 轉(zhuǎn)染的AGS 細(xì)胞)和USP9X siRNA 組(USP9X siRNA 轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞)。

1.5 RT-qPCR 從胃癌組織、正常胃黏膜組織及各個(gè)不同轉(zhuǎn)染的胃癌AGS 細(xì)胞中提取總RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA 為模板,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 特定的試劑盒(北京天根生化科技有限公司)將各個(gè)不同的組分加入至反應(yīng)體系中,擴(kuò)增USP9X特定的引物正義鏈: 5′-CATGGACCTGGCTCTCAGTG-3′,反義鏈:5′-AAACACATGGGGACTTCGCT-3′,產(chǎn)物大小為220 bp,擴(kuò)增內(nèi)參β-actin 引物正義鏈:AACTGGGACGACATGGAGAAAA-3′,反義鏈:GGATAGCACAGCCTGGATAGCA-3′, 產(chǎn)物大小為192 bp。USP9X 基因的相對(duì)表達(dá)水平應(yīng)用2-ΔΔCt來(lái)計(jì)算。

1.6 Western 印跡 提取胃癌細(xì)胞和組織中的總蛋白,轉(zhuǎn)膜、封閉后加入一抗(USP9X 和β-actin)、二抗,隨即采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)液曝光使其顯示出特定的蛋白條帶,目的蛋白相對(duì)表達(dá)的水平=目的蛋白的灰度值/β-actin 的灰度值。

1.7 細(xì)胞增殖 把不同組經(jīng)過(guò)處理的胃癌AGS 細(xì)胞接種入96 孔板中,每孔2 000 個(gè)細(xì)胞左右。根據(jù)CCK-8 試劑(中國(guó)碧云天生物工程有限公司)說(shuō)明書(shū),檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)胃癌AGS 細(xì)胞的增殖水平。最后應(yīng)用GraphPad Prism6.0 軟件生成AGS 細(xì)胞的增殖曲線。

1.8 細(xì)胞周期 收集不同組經(jīng)過(guò)處理的胃癌AGS細(xì)胞(1×106個(gè)左右/組)。經(jīng)離心后把預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)加入細(xì)胞中漂洗,漂洗3 次,應(yīng)用70%冰乙醇4℃溫度下固定細(xì)胞30 min,接著采用預(yù)冷的PBS 漂洗細(xì)胞3 次,然后將細(xì)胞重懸于含40 μg碘化丙啶和100 μg 核糖核酸酶(RNase)A 的PBS緩沖液里,在37℃條件下孵育30 min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同組經(jīng)過(guò)處理的AGS 細(xì)胞中的DNA含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、One-way ANOVA 分析。

2 結(jié) 果

2.1 USP9X mRNA 在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達(dá)水平 5 例胃癌組織中USP9X mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平分別為(2.679±0.139,4.100±0.396,1.743±0.156,3.67±0.338 和5.403±0.510)高于正常胃黏膜組織分別為(1.008±0.021,1.017±0.044,1.007±0.034,1.002±0.020 和1.012±0.025),且表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.600、13.400、8.004、13.660、14.890;P＜0.001,P＜0.01)。

2.2 USP9X 蛋白在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達(dá) 5 例胃癌組織中USP9X 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平分別為(2.347±0.166,1.689±0.187,1.032±0.160,0.462±0.065 和2.485±0.178)高于正常胃黏膜組織(0.225 ±0.035,0.328 ±0.025,0.327 ±0.012,0.022±0.011 和0.055±0.014),差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= 21.69、12.49、7.60、11.52、23.56;P＜0.001,P＜0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 Western 印跡檢測(cè)隨機(jī)選擇5 例胃癌組織(T)和對(duì)應(yīng)的正常胃黏膜組織(N)中USP9X 蛋白的表達(dá)

2.3 USP9X mRNA 和蛋白在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)

胃癌細(xì)胞株 AGS、SGC-7901 和 BGC-823 中USP9X mRNA 表達(dá)水平(6.380 ±0.730,4.153 ±1.011 和2.70±0.357)均明顯高于正常胃黏膜細(xì)胞GES-1(1.006±0.032,t=12.740、5.391、8.189;P＜0.001,P＜0.01)。胃癌細(xì)胞株AGS、SGC-7901 和BGC-823 中USP9X 蛋白表達(dá)水平(3.176±0.189,2.304±0.203 和1.446±0.093)均明顯高于正常胃黏膜細(xì)胞GES-1(0.232±0.046;t=26.22、17.27、20.28;均P＜0.000 1)。見(jiàn)圖2。

圖2 USP9X 蛋白在不同的胃癌細(xì)胞株和正常胃黏膜細(xì)胞株的表達(dá)

2.4 USP9X siRNA 顯著下調(diào)胃癌AGS 細(xì)胞株中USP9X 蛋白的表達(dá) 與AGS 組(1.002±0.073)及對(duì)照siRNA 組(1.036±0.085)相比較,USP9X siRNA 組USP9X 蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯下調(diào)(0.040±0.014;F=225.671,P＜0.000 1),AGS 組和對(duì)照siRNA 組USP9X 蛋白的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(t=0.458,P=0.671)。見(jiàn)圖3。

圖3 USP9X siRNA 明顯下調(diào)胃癌AGS 細(xì)胞中USP9X蛋白的相對(duì)表達(dá)量

2.5 USP9X 表達(dá)下調(diào)顯著抑制胃癌AGS 細(xì)胞的增殖 CCK-8 結(jié)果顯示,與AGS 組和對(duì)照siRNA 組相比,USP9X siRNA 組24、48、72、96 h 細(xì)胞增殖顯著被抑制(P＜0.05),AGS 組與對(duì)照siRNA 組相比較,增殖能力無(wú)明顯差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)間細(xì)胞增殖情況比較(±s,n=3)

表1 各組不同時(shí)間細(xì)胞增殖情況比較(±s,n=3)

與USP9X siRNA 組比較:1)P＜0.05

組別0 h24 h48 h72 h96 h AGS 組0.216±0.0050.553±0.0651)0.824±0.0911)1.204±0.1221)1.583±0.1781)對(duì)照siRNA 組0.215±0.0060.603±0.0971)0.876±0.1631)1.203±0.1891)1.683±0.1881)USP9X siRNA 組0.216±0.0050.248±0.0060.452±0.0830.638±0.0930.904±0.066

2.6 USP9X 表達(dá)下調(diào)顯著改變胃癌AGS 細(xì)胞周期分布 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,USP9X siRNA 組〔(63.39±0.85)%〕中胃癌AGS 細(xì)胞在G0/G1 期細(xì)胞數(shù)的比率高于未處理組〔(54.61±0.70)%〕及對(duì)照siRNA 組〔(53.87±1.59)%〕,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=67.739,P＜0.000 1)。USP9X siRNA 組AGS細(xì)胞S 期〔(23.68±0.56)%〕及G2/M 期〔(12.93±1.03)%〕細(xì)胞數(shù)的比率低于未處理組〔S 期為(29.44±1.98)%,G2/M 期為(15.95±1.38)%〕及對(duì)照siRNA 組〔S 期為(28.43±1.63)%,G2/M 期為(17.70±0.24)%〕,其差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(S 期:F=12.399,P= 0.007,G2/M 期:F= 17.261,P=0.003)。

3 討 論

泛素化屬于蛋白修飾中最為常見(jiàn)的一種形式,能調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、DNA 損傷修復(fù)和跨膜運(yùn)輸?shù)榷喾N不同的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程〔10〕。USP9X 作為一個(gè)去泛素化酶,能有效調(diào)控細(xì)胞的增殖及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),在多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制中扮演了重要作用〔11,12〕。Wang 等〔13〕實(shí)驗(yàn)證實(shí),USP9X 基因在非小細(xì)胞肺癌的癌組織中表達(dá)量明顯上調(diào),且USP9X 基因的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和總生存率下降關(guān)系密切。Zhou 等〔14〕證實(shí)USP9X 在急性B 細(xì)胞型淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞系和患者中均出現(xiàn)過(guò)表達(dá)現(xiàn)象。此外,轉(zhuǎn)錄因子E26 相關(guān)基因(ERG)陽(yáng)性的前列腺癌中USP9X 表達(dá)水平顯著高于ERG 陰性和良性病變〔15〕。因此,上述結(jié)果均證實(shí)USP9X 基因在多種腫瘤中發(fā)揮癌基因的作用。本文結(jié)果與Fu等〔9〕研究結(jié)果基本一致,提示USP9X 基因可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要作用。

研究發(fā)現(xiàn),USP9X 基因在多種腫瘤的細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的調(diào)控中作用顯著,Yang 等〔16〕通過(guò)應(yīng)用RNA 干擾技術(shù)下調(diào)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞USP9X 表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP9X 表達(dá)下調(diào)能明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251 和A172 細(xì)胞的增殖,并阻止其G1 期向S 期的轉(zhuǎn)化,同時(shí)阻斷原發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的腫瘤形成過(guò)程。Hu 等〔17〕也證實(shí)USP9X 基因表達(dá)下調(diào)顯著抑制肝癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移,并促進(jìn)其凋亡過(guò)程。此外,在急性B 細(xì)胞型淋巴細(xì)胞性白血病的研究中,Zhou 等〔14〕發(fā)現(xiàn)USP9X 的敲除顯著抑制細(xì)胞的增殖,增加細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果提示USP9X 在胃癌細(xì)胞的增殖和周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用,但是確切的分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。

綜上,胃癌組織中USP9X 呈現(xiàn)高表達(dá),USP9X特異的siRNA 能顯著下調(diào)胃癌細(xì)胞中USP9X 蛋白的表達(dá),顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖,并靜止細(xì)胞周期在G0/G1 期。這些結(jié)果表明,USP9X 可能在胃癌中發(fā)揮癌基因的作用,并且對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖和周期具有十分重要的調(diào)控作用,因而未來(lái)從分子水平進(jìn)一步闡明USP9X 在胃癌增殖和周期中的調(diào)控作用有望為以USP9X 為靶點(diǎn)的胃癌病人的分子靶向治療奠定基礎(chǔ)。