miR-34a靶向調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)牙髓炎炎癥作用的影響

符國(guó)富 韓小東 趙永興 盧敏 陳國(guó)盛( 儋州市人民醫(yī)院,海南 儋州 57700; 解放軍總醫(yī)院海南分院)

牙髓組織是人牙齒內(nèi)唯一的疏松結(jié)締組織,屬于高度分化的充質(zhì)組織,包裹于牙本質(zhì)硬組織之中〔1〕。牙髓的構(gòu)成主要是大量神經(jīng)纖維及血管,牙髓對(duì)于牙齒抵御外界的刺激和傷害過(guò)程中充當(dāng)重要角色〔2〕。牙髓炎發(fā)病機(jī)制及病情發(fā)展復(fù)雜,臨床癥狀主要表現(xiàn)為牙齒及牙齦的劇痛,物理因素、化學(xué)因素、空腔創(chuàng)傷導(dǎo)致的細(xì)菌感染等都有可能成為牙髓炎的致病因素〔3〕。此外,牙髓炎還會(huì)導(dǎo)致機(jī)體對(duì)牙齒的營(yíng)養(yǎng)供給不足并且極大地阻礙了血液循環(huán),以至于嚴(yán)重的牙髓炎能夠?qū)е卵浪鑹乃?近而發(fā)生急性根尖周炎,這些都是導(dǎo)致患者喪失牙齒或者引發(fā)其他并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素〔4〕。miRNA 是機(jī)體內(nèi)長(zhǎng)度大約22 個(gè)核苷酸的微小RNA,是近來(lái)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研究的熱點(diǎn)〔5～7〕。其是一種不同層次上的表達(dá)調(diào)控方式,有相關(guān)研究表示,miRNA 可能參與調(diào)控痛覺神經(jīng):背根神經(jīng)、脊髓背角神經(jīng)等與疼痛相關(guān)基因的表達(dá)〔8〕。2001年,miR-34 首次被發(fā)現(xiàn)于線蟲體內(nèi),相關(guān)研究證實(shí)miR-34 是由miRNA-34a、miRNA-34b、miRNA-34c 組成,其中miR-34a 位于染色體1p36上,有學(xué)者指出,miR-34a 不但能夠?qū)膊√弁窗l(fā)揮作用,并且可以調(diào)控蛋白水平改變機(jī)體微環(huán)境〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號(hào)通路對(duì)于人牙髓細(xì)胞的增殖和牙本質(zhì)的分化有一定的影響〔10〕。本研究旨在探討miR-34a靶向調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路對(duì)牙髓炎的炎癥作用的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 4～7 周齡健康雄性大鼠(天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院提供)、水合氯醛、miR-34a 抑制劑(遼寧成大生物股份有限公司)、蘇木素-伊紅(HE)染液(上海萊士血液制品股份有限公司)、Trizol 試劑盒、miR-34a 定量PCR 試劑盒、蛋白濃度測(cè)定試劑盒(陸恒生物有限公司)、無(wú)水渦輪機(jī)、PCR儀、電泳儀(上海豐實(shí)試驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 一般資料 選取50 只4～7 周齡健康雄性大鼠,體重150～200 g,平均體重(198.35±6.36)g。對(duì)大鼠各自分籠常規(guī)飼養(yǎng)7 d 后開始進(jìn)行試驗(yàn),維持室溫在25～27℃,空氣相對(duì)濕度控制在50%～70%,每天保證不少于12 h 的光照,由實(shí)驗(yàn)室專業(yè)人員對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃、喂養(yǎng)、換水等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)建模 將大鼠分成3 組,健康組10 只,模型組30 只,miR-34a 抑制組10 只。模型組、miR-34a 抑制組行牙髓暴露法制備牙髓炎模型,腹腔注射0.7 ml/100 g 的濃度為3.0% 的水合氯醛麻醉,對(duì)大鼠兩側(cè)上頜第一磨牙與第二磨牙進(jìn)行酒精消毒,1/2 球鉆配合無(wú)水渦輪機(jī)開髓,穿髓點(diǎn)暴露,建立牙髓炎模型。建模完成后miR-34a 抑制組行頸靜脈miR-34a 抑制劑注射,劑量8 mg/kg,連續(xù)注射14 d。健康組行同劑量麻醉后不進(jìn)行手術(shù)處理。

1.3.2 觀察牙髓組織病理情況 建模14 d 選取miR-34a 抑制組和健康組及造模3、7、14 d 模型組分別取10 只大鼠腹腔注射3.0% 水合氯醛麻醉,劑量為0.7 ml/100 g 的,斷頸處死(符合動(dòng)物倫理學(xué)要求),取牙髓組織于緩沖液中沖洗,經(jīng)甲醛固定、脫水、透明、包埋后石蠟切片,HE 染色后光鏡下觀察各組牙髓組織病理情況。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量法觀察miR-34a、PI3K mRNA和AKT mRNA 表達(dá)水平 建模14 d 抽取miR-34a抑制組和健康組及造模第3、7、14 d 模型組空腹靜脈血,Trizol 法提取血清總RNA,紫光光度儀測(cè)定OD 值,檢測(cè)RNA 純度。在35℃條件下反應(yīng)25 min后75℃條件下反應(yīng)15 min,RNA 逆轉(zhuǎn)錄為DNA,在上下游引物、模板、聚合酶條件下按照miR-34a 定量PCR 試劑盒的指示說(shuō)明經(jīng)過(guò)PCR 擴(kuò)增(設(shè)定特異性內(nèi)參基因和目的基因),通過(guò)熒光定量記錄反映出的miR-34a、PI3K mRNA 和AKT mRNA 的表達(dá)水平。U6 正向引物ATGTAGTCTCATCGAT-CTC、反向ATGTAGTCATCGATCGTAAT, 序列長(zhǎng)度202 bp;miR-34a 正向引物TCCGTAGTACCTGATCAGTCT、反向GCCTCTCGAGTACGTAGTCCAG,序列長(zhǎng)度235 bp;PI3K mRNA 正向引物CGTCTACGTGATACTGTGTGG、反向GCCAATCGTAGTCAGTCTGTACC,序列長(zhǎng)度240 bp;AKT mRNA 正向引物 GGTACTGGTACGCCTCAATCC、反向GAATATCTACGTACGTACTAAGAA,序列長(zhǎng)度253 bp。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)炎癥因子水平 將各組牙髓組織,充分研磨后加入緩沖液靜止后離心取上清液,超低溫保存。ELISA 檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α 及IL-10 水平的過(guò)程中,首先稀釋標(biāo)準(zhǔn)品液至不同的濃度梯度,分管開始測(cè)定各自吸光度值(OD),以標(biāo)準(zhǔn)品的不同濃度作為橫坐標(biāo),OD 值為縱坐標(biāo),使用軟件作圖,畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)OD 值顯示出相應(yīng)蛋白的含量。

1.3.5 Western 印跡檢測(cè)PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平 建模14 d 用Western 印跡法檢測(cè)大鼠牙髓組織內(nèi)p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT 蛋白表達(dá),對(duì)牙髓組織研磨后經(jīng)組織裂解后電壓80 V 上樣,溴酚藍(lán)泳出分離膠。聚偏氟乙烯(PVDF)膜內(nèi)行蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移,連續(xù)90 min 的恒定電流30 mA。PVDF 膜取出后于脫脂奶粉中封閉并震蕩1 h。結(jié)束后TNST 洗膜10 min,3 次,PVDF 經(jīng)雜交、稀釋、封口后,低溫孵育過(guò)夜;TBST 洗膜10 min,3 次,加入標(biāo)記二抗,震蕩溫育10 min,暗室下曝光、顯影、定影。清水沖洗后,晾干掃描,使用IPP 軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組牙髓組織病理情況 健康組牙髓組織無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。建模3 d 大鼠牙髓組織開始發(fā)生輕度炎癥現(xiàn)象,大鼠穿髓點(diǎn)處開始出現(xiàn)中性粒細(xì)胞,牙髓纖維開始變性,出現(xiàn)漿液型炎癥反應(yīng),牙本質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)錯(cuò)亂,牙根髓變化不明顯,紅細(xì)胞少許散布。建模7 d 牙髓組織壞死,纖維組織少許,炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn),牙本質(zhì)紊亂,牙根髓組織明顯充血,大量紅細(xì)胞分布。建模14 d 牙冠髓已被炎性細(xì)胞完全侵染,牙本質(zhì)及成纖維細(xì)胞發(fā)生凝固性壞死及形態(tài)變異,瘀血開始堵塞血管,牙根髓空泡變形完全錯(cuò)亂。而miR-34a 抑制組大鼠牙髓組織僅發(fā)生輕度炎癥反應(yīng),牙根髓較健康組無(wú)明顯變化。見圖1。

圖1 各組牙髓組織病理(HE 染色,×100)

2.2 各組牙髓狀況比較 建模3、7、14 d 的牙髓根尖破損長(zhǎng)度、根尖周膜寬及牙髓壞死率較健康組顯著上升(P＜0.05);而miR-34a 抑制組牙髓根尖破損長(zhǎng)度、根尖周膜寬及牙髓壞死率較建模14 d 水平顯著減小(P＜0.05),其與健康組各指標(biāo)狀況無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組牙髓狀況及PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)比較(±s,n=10)

表1 各組牙髓狀況及PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)比較(±s,n=10)

與健康組比較:1)P＜0.05;與miR-34a 抑制組比較:2)P＜0.05;下表同

組別根尖破損長(zhǎng)度(μm)根尖周膜寬度(μm)牙髓壞死率(%)PI3K mRNAAKT mRNA健康組840.33±178.65233.56±38.790.00±0.002.81±0.823.41±1.07建模3 d915.67±166.581)289.64±45.221)32.15±3.281)7.10±2.251)6.89±1.861)建模7 d1 105.00±196.351)324.56±41.231)54.75±3.111)14.52±3.191)2)13.61±2.741)2)建模14 d1 472.33±177.641)2)519.57±40.821)2)89.67±3.041)2)28.23±5.381)2)32.55±6.131)2)miR-34a 抑制組870.45±188.42253.88±41.3618.87±3.014.87±1.135.04±1.29 F/P 值13.702/0.00015.889/0.00017.955/0.000116.047/0.000139.445/0.000

2.3 各組miR-34a、PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)基因及炎癥因子相對(duì)表達(dá) 建模7、14 d 血清miR-34a相對(duì)水平較健康組顯著上升(P＜0.05);建模3、7、14 d,牙髓組織中IL-6、IL-1β、TNF-α 及IL-10 相對(duì)水平較健康組顯著上升(P＜0.05);miR-34a 抑制組血清miR-34a 相對(duì)水平較14 d 顯著下降(P＜0.05);牙髓組織中IL-6、IL-1β、TNF-α 及IL-10 的相對(duì)水平較建模3、7、14 d 組顯著下降(P＜0.05),與健康組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。模型組PI3K 及AKT mRNA 表達(dá)較健康組顯著上升,且隨著建模天數(shù)的增加,差異越明顯(P＜0.05);miR-34a 抑制組PI3K 及AKT mRNA 表達(dá)較建模7、14 d 組下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1、表2。

表2 各組炎癥因子、miR-34a 相對(duì)水平比較(±s,n=10)

表2 各組炎癥因子、miR-34a 相對(duì)水平比較(±s,n=10)

組別miR-34aTNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)IL-10(pg/ml)28.86±5.72建模3 d 組1.11±0.7858.25±14.771)2)63.45±13.851)2)60.44±15.321)2)51.33±12.361)2)建模7 d 組3.55±1.671)114.78±36.851)2)127.86±40.751)2)133.40±35.551)2)111.45±37.801)2)建模14 d 組6.88±2.351)2)199.32±55.841)2)187.66±47.331)2)201.13±48.871)2)185.34±44.321)2)miR-34a 抑制組0.99±0.4535.76±5.6637.44±7.6131.20±4.3832.56±3.97 F/P 值11.785/0.00124.351/0.00118.880/0.00115.健康組0.88±0.3220.62±2.3816.79±3.5518.37±2.46 536/0.00117.772/0.001

2.4 各組PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)與健康組相比,模型組p-PI3K 及p-AKT 蛋白表達(dá)顯著上升(P＜0.05);而模型組相比,miR-34a 抑制組p-PI3K 和p-AKT 水平顯著降低,且p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達(dá)較健康組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。見表3、圖2。

圖2 Western 印跡檢測(cè)各組PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

表3 各組PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)(±s)

表3 各組PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)(±s)

組別n PI3 K.03 p-PI3KAKTp-AKT健康組100.67±02.38±1.110.77±0.026.48±0.98模型組301.78±0.3224.65±10.521)2)0.98±0.0432.85±14.841)2)miR-34a 抑制組101.32±0.343.77±3.750.79±0.0110.24±4.11 F/P 值0.639/0.33412.586/0.0120.557/0.4429.770/0.004

3 討 論

牙髓炎的病情進(jìn)展中,對(duì)于輕度炎癥牙髓組織能夠自我修復(fù)與再生,而重癥牙髓炎會(huì)造成牙髓壞死〔11〕。牙髓組織對(duì)于外部細(xì)菌及其產(chǎn)物刺激、機(jī)械刺激的應(yīng)激反應(yīng)多依賴于感染位置聚集的白細(xì)胞〔12〕。相關(guān)試驗(yàn)指出,炎性細(xì)胞因子能夠在分子水平上對(duì)牙髓細(xì)胞的炎癥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié),參與牙髓炎炎癥進(jìn)展的全過(guò)程,機(jī)體伴有牙髓炎病癥時(shí),機(jī)體內(nèi)IL-6、IL-8、IL-10 等細(xì)胞因子含量較健康牙髓內(nèi)顯著升高〔13〕。IL-8 一般在炎癥前期產(chǎn)生影響,IL-8 在炎癥發(fā)生的位置募集中性粒細(xì)胞對(duì)炎癥反應(yīng)起介導(dǎo)作用,是炎癥前期第二大細(xì)胞因子〔14〕。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞中有重要作用,其能夠參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、分化及自我更新等多個(gè)生理過(guò)程〔15〕。研究〔16〕表明,PI3K/AKT 信號(hào)通路是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的關(guān)鍵調(diào)控信號(hào)通路,且其能夠有效增強(qiáng)牙髓細(xì)胞的增殖分化能力。PI3K/AKT信號(hào)通路中的PI3K 在一定條件下能夠被激活并活化下游關(guān)鍵蛋白AKT,進(jìn)而調(diào)控相關(guān)靶蛋白,發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)〔17〕。與此同時(shí),近年來(lái)miRNA 在疼痛相關(guān)疾病中的作用引起學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。Brandenburger 等〔18〕在坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎模型中觀察到部分miRNA 在脊髓背角和背根神經(jīng)節(jié)中均有表達(dá),且不同疼痛指數(shù)下的表達(dá)有所不同。關(guān)祥艷等〔19〕發(fā)現(xiàn)敲除小鼠miR-103 可引起痛覺敏感,鞘內(nèi)注射miR-105 緩解痛感有明顯作用。miR-34a 可通過(guò)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子來(lái)影響腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期改變和腫瘤侵襲等。Weeraratne 等〔20〕研究指出miR-34a 可以通過(guò)靶向調(diào)控下游腫瘤抑制因子表達(dá),改變腫瘤對(duì)化療的敏感性。而目前miR-34a 靶向調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路對(duì)牙髓炎炎癥產(chǎn)生作用這一課題值得進(jìn)行試驗(yàn)探究。

本試驗(yàn)結(jié)果表明,建模后的大鼠牙髓產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。提示根尖周炎一般發(fā)生于牙髓壞死之前,是牙髓壞死的逐步演化過(guò)程。猜測(cè)其作用機(jī)制應(yīng)該與細(xì)菌感染后細(xì)菌毒性產(chǎn)物進(jìn)入到牙髓暴露的牙根管中形成持續(xù)性抗原,導(dǎo)致根尖周病。提示miR-34a對(duì)牙髓炎炎癥作用的調(diào)控與PI3K/AKT 信號(hào)通路存在關(guān)聯(lián)。在牙髓炎的炎癥進(jìn)程中miR-34a 靶向調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路產(chǎn)生的作用至關(guān)重要。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)牙髓炎發(fā)生過(guò)程中與miR-34a 和PI3K/AKT 信號(hào)通路基因蛋白相關(guān)的細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)及基因水平的信號(hào)調(diào)控過(guò)程。miR-34a 在牙髓炎模型中上調(diào)自身表達(dá)靶向調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路,上調(diào)PI3K/AKT 信號(hào)通路中PI3KmRNA、AKTm-RNA 和p-PI3K 和p-AKT 蛋白的表達(dá),促進(jìn)炎癥因子的釋放加重牙髓炎的炎癥作用。而另一方面,其他相關(guān)基因和蛋白是否也參與了這一調(diào)控過(guò)程,或者如何調(diào)控及本課題在人體中是否能夠得到統(tǒng)一結(jié)果,本試驗(yàn)未進(jìn)行探究和闡釋,需待重復(fù)性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步討論。

綜上所述,miR-34a 靶向調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路的激活增大了牙髓炎炎癥反應(yīng)程度,促進(jìn)病情發(fā)展,提示或可通過(guò)對(duì)miR-34a 和PI3K/AKT 信號(hào)通路的抑制降低炎癥因子表達(dá),從而控制牙髓炎的炎癥作用。