多黏菌素B對大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型損傷的影響及機制

龍似維 劉強 (錦州醫(yī)科大學 1 研究生院,遼寧 錦州 11000; 附屬第三醫(yī)院神經內科)

2019年10月29日是“世界卒中日”,而腦卒中也被權威期刊《柳葉刀》列為中國三大致死性疾病第二位,與此同時還具有頗高的致殘率〔1〕。根據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù),在國內每12 s 就有人面臨這種疾病的考驗〔2〕。以往大量研究顯示〔3〕,在機體各種應激狀態(tài)下,如腦缺血-再灌注(IR)損傷時,全身炎癥反應劇烈,同時可伴有腸道黏膜屏障功能障礙,腸道菌群移位,腸菌有害代謝產物入血,加重免疫反應及腦損傷。本研究通過制備大腦中動脈缺血-再灌注模型(MCAO/R),檢測大鼠腦IR 損傷后異硫氰酸熒光素-右旋糖酐(FD)4、脂多糖(LPS)濃度變化,證實該模型腸道黏膜屏障破壞,通透性增加,并以此為基點,使用對多種陰性菌有抑制作用的抗生素多糖菌素(PM)B 進行處理,通過觀察各種指標的變化,評價PMB 處理后大鼠腦IR 損傷的炎癥反應情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 選取由錦州醫(yī)科大學實驗動物中心提供,許可證號為SCXK(遼)2017-0004 的健康雄性10 周齡清潔級SD 大鼠共120 只,體重250～320 g;術前嚴格禁食12 h,不禁水。動物實驗獲得錦州醫(yī)科大學動物倫理委員會批準。死亡動物按上述要求、隨機原則進行補齊數(shù)量。按照隨機原則分為3 組:假手術組、MCAO/R 組、PMB 組,每組40 只。MCAO/R 組和 PMB 組大鼠制作右側MCAO/R 模型;假手術組分離頸部血管,并結扎前述相應血管,除線栓不插入血管外,其他步驟與另兩組相同。上述造模過程成功后立即按照2.5 μg/g濃度進行腹腔內注射,假手術組和MCAO/R 組注射生理鹽水,PMB 組注射PMB 溶液。

1.2 造模 參照辛世萌等〔4〕的方法制備線栓,采用改良的Longa 線栓法〔5〕,制備該模型。稱重后的大鼠使用10%水合氯醛(35 ml/kg)腹腔注射麻醉。仰臥位固定,分離右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)。在CCA 遠心端、近心端及ECA 掛線備用。用微動脈夾暫時夾閉ICA,然后近心端結扎CCA、ECA。在距CCA 分叉部4 mm 處剪一小口,將栓線插入到ICA,這時用繞在CCA 遠心端的細線輕輕系牢栓線,用眼科鑷輕推栓線,從血管分叉處開始算距離,當插入深度在18 mm 時(將血管放松至原來狀態(tài),且保證標記點在分叉處),緊緊系牢CCA 遠心端的細線。術后采用Longa 5 分法對模型大鼠神經行為學進行快速評價,評分＞1 分即可從神經缺損評分角度認為模型制備成功(0 分:正常;1 分:癱瘓側前爪不能完全伸展;2 分:行走時,大鼠向癱瘓側轉圈;3 分:行走時,大鼠身體向癱瘓側傾倒;4 分:不能自發(fā)性走,有意識喪失)。成功后暫時縫和皮膚。缺血2 h 后再次麻醉小鼠,從右側ECA 拔出線栓并將其近心端結扎,造成大腦中動脈(MCA)再灌注,縫合皮膚。

1.3 檢測時間節(jié)點及項目 各組大鼠在IR 后24 h后,分別使用Bederson 神經功能缺損評分表進行神經行為學評分,熒光分光光度法測量外周血FD4 濃度,鱟試劑終點顯色法測量外周血LPS 濃度,干濕比重測量腦組織含水量,蘇木素-伊紅(HE)染色觀察大鼠右側海馬CA1 區(qū)組織病理學表現(xiàn),反轉錄(RT)-聚合酶鏈反應(PCR)測量大鼠右側海馬CA1區(qū)白細胞介素(IL)-1β mRNA 的表達。

1.4 神經行為學Bederson 評分 0 分:無明顯神經功能缺損表現(xiàn);1 分:不能伸展患側前肢;2 分:患側對外力抵抗能力下降;3 分:提尾時向患側轉圈;4 分:自動轉圈;5 分:無自發(fā)性活動、意識障礙。

1.5 熒光分光光度法測量外周血FD4 濃度 每組取10 只大鼠;給予FD4(劑量為0.4 mg/g)灌胃;3 h后10%水合氯醛(35 ml/kg)腹腔注射麻醉;下頜靜脈叢取血入EP 管〔乙二胺四乙酸(EDTA)處理〕,標記,搖勻放入4℃冰箱備用(如立即使用可暫放冰上);熒光分光光度計波長為488 nm 檢測;使用標準曲線計算樣品FD4 濃度(ng/ml)。

1.6 鰲試劑終點顯色法測量外周血LPS 測定 廈門鰲試劑有限公司64T 顯色試劑盒(按照說明進行操作);準備樣品;配制LPS 標準溶液(注意需要在4 h內使用完,標準曲線的溶液濃度為0.100、0.050、0.025、0.010、0.000 EU/ml);BET 水作為陰性對照;光譜儀設定讀板波長405 nm(生物光模式);配制鱟試劑和顯色基質;檢測樣品檢測,讀取吸光度值;通過標準品及吸光度值擬合建議標準曲線,計算樣品LPS 濃度。

1.7 干濕比重法測量腦組織含水量 每組取5 只大鼠;10%水合氯醛(35 ml/kg)腹腔注射麻醉;斷頭取腦;分離右側大腦半球,測濕質量;組織于10℃烘烤24 h 后測干質量;按照公式計算: 腦含水量(%)=(濕質量-干質量)/濕質量×100%。

1.8 HE 染色法光鏡下觀察腦組織病理變化 每組取5 只大鼠;10%水合氯醛(35 ml/kg)腹腔注射麻醉;斷頭取腦;分離右側大腦半球;進行石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水洗;蘇木素染色后水洗;1% 鹽酸酒精分化后水洗至返藍;1% 伊紅酒精復染;常規(guī)梯度酒精脫水,透明,封片。

1.9 RT-PCR 檢測IL-1β mRNA 表達 每組取5 只大鼠;10%水合氯醛(35 ml/kg)腹腔注射麻醉;斷頭,無菌條件下,迅速分離右側大腦半球海馬組織,放于盛有液氮的研缽中研成粉末;將粉末以100 mg/管分裝于編號后的EP 管中,-70℃冰箱中保存?zhèn)溆?提取TOTAL RNA:按照Trizol Reagent(Invitrogen 公司)說明書操作(注意:使用無菌無酶的吸頭;使用一次性塑料手套和口罩進行所有試劑配制和實驗操作,以避免RNase 污染。)測定Total RNA 的OD260/280 值及樣品濃度:OD 260/280 值在1.8～2.0 之間為宜。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA:點樣-跑膠-紫外燈觀察-照相,條帶越淡越好。反轉錄過程:應用TaKaRa 的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(貨號RR047A)試劑盒,嚴格按說明書配制及相關操作(注:反應條件如下:50℃,30 min→99℃,5 min→5℃,5 min→4℃保存)。以β-actin 為內參照,雙重PCR 檢測IL-1β mRNA 的表達,RT-PCR 擴增產物的電泳檢測:點樣-電泳1 h-紫外燈觀察-掃描-照相;利用圖像分析軟件Gene Tools 分析灰度比。

1.10 統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0 軟件進行方差分析、LSD 法和Pearson 相關性分析。

2 結 果

2.1 PMB 處理后MCAO/R 大鼠神經功能評分改變

假手術組神經功能缺損評分為0 分;與假手術組比較,MCAO/R 組與PMB 組神經功能缺損評分均明顯增加,其中MCAO/R 組增加更明顯(P＜0.01);與MCAO/R 組相比,PMB 組神經功能缺損評分明顯減少(P＜0.01)。3 組間比較有統(tǒng)計學差異(F=197.71,P＜0.01)。見表1。

2.2 MCAO/R 后腸道通透性改變 與假手術組比較,MCAO/R 組與PMB 組血漿FD4 濃度明顯升高,且MCAO/R 組升高更明顯(P＜0.01);與MCAO/R組相比,PMB 組血漿FD4 濃度明顯下降(P＜0.01)。3 組間比較有統(tǒng)計學差異(F=20.37,P＜0.01)。見表1。

2.3 PMB 處理可降低MCAO/R 外周血LPS 濃度與假手術組相比,MCAO/R 組與PMB 組外周血LPS濃度均明顯升高,其中以MCAO/R 組升高更明顯(P＜0.01);與MCAO/R 組相比,PMB 組外周血LPS濃度明顯下降(P＜0.01)。3 組間比較有統(tǒng)計學差異(F=980.56,P＜0.01)。見表1。

2.4 PMB 處理可減輕MCAO/R 腦水腫情況 與假手術組相比,MCAO/R 組與PMB 組腦組織含水量均明顯升高,MCAO/R 組升高更明顯(P＜0.01);與MCAO/R 組相比,PMB 組腦組織含水量明顯降低(P＜0.01)。3 組間比較有統(tǒng)計學差異(F=96.93,P＜0.01)。見表1。

2.5 PMB 降低腦MCAO/R 組織海馬CA1 區(qū)IL-1β mRNA 表達 假手術組的梗死區(qū)IL-1β mRNA 呈低水平表達;與假手術組相比,MCAO/R 組與PMB 組IL-1β mRNA 的表達水平明顯升高,MCAO/R 組升高更明顯(P＜0.01);與MCAO/R 組相比,PMB 組的梗死區(qū)IL-1β mRNA 表達水平明顯下降(P＜0.01)。3 組間比較有統(tǒng)計學差異(F=136.69,P＜0.01)。見表1、圖1。

表1 各組MCAO/R 大鼠數(shù)據(jù)比較(±s,n=40)

表1 各組MCAO/R 大鼠數(shù)據(jù)比較(±s,n=40)

與假手術組比較:1)P＜0.01,與MCAO/R 組比較:2)P＜0.01

組別Bederson 評分(分)腦組織含水量(%)海馬CA1 區(qū)IL-1β mRNA 表達外周血FD4濃度(μg /ml)外周血LPS濃度(EU/ml)47±0.20 MCAO/R 組3.38±0.931)83.58±1.051)1.43±0.171)10.02±2.861)0.94±0.231)PMB 組2.55±1.011)2)79.70±1.131)2)0.89±0.041)2)4.86±1.321)2)0.55±0.301)2)假手術組0.00±0.0075.98±0.740.48±0.212.48±1.350.

圖1 各組腦組織海馬CA1 區(qū)IL-1β mRNA 表達

2.6 PMB 減輕MCAO/R 后梗死區(qū)域組織細胞損傷(光鏡結果) 假手術組:右側海馬CA1 區(qū)組織形態(tài)正常,細胞核大且呈圓形,胞質染色均勻;MCAO/R組:右側海馬CA1 區(qū)組織間質疏松、水腫,細胞體積縮小、排列紊亂,核固縮;PMB 組:右側海馬CA1 區(qū)神經細胞濃縮和間質腫脹程度明顯減輕,排列較規(guī)整。見圖2。

圖2 各組光鏡下腦組織變化(HE 染色,×400)

2.7 相關性分析 PMB 組的梗死區(qū)腦組織含水量與外周血LPS 濃度存在顯著相關性(r=0.945,P=0.01)。

3 討 論

缺血性腦卒中是中國現(xiàn)今致殘、致死率最高的疾患,其總量約占腦卒中的80%,盡管靜脈溶栓及血管內治療這些再通技術的應用明顯降低了其死亡率,但組織復流后出現(xiàn)的神經功能障礙加重,尤其是大動脈閉塞、功能區(qū)域的再灌注損傷,往往會使血管再通患者死亡,大大減低了臨床治療效〔6〕。

在腦I/R 損傷的所有反應機制中,炎性反應發(fā)揮著起始和損傷作用。其中,IL 是非常重要的一類細胞因子,又以在組織器官損傷中也是極為重要的炎癥因子IL-1β 研究最多。雖然在正常腦組織中IL-1β 含量較少,但是在CIRI 后,活化的單核細胞、巨噬細胞等合成和分泌IL-1β 量增加,進一步刺激血管內皮細胞產生細胞間黏附分子(ICAM),使中性粒細胞直接黏附于血管內皮,大量聚集的炎性細胞又可以再次誘發(fā)過度氧自由基釋放、細胞因子過表達,往復循環(huán)促發(fā)越來越多的中性粒細胞,使炎癥反應惡性加重,最終導致了動脈內徑變窄甚至閉塞。以上過程通過激活絲裂原活化蛋白酶(MAPK)、核轉錄因子(NF)-κB、蛋白激酶(PK)C 等信號通路完成。這些信號通路最終導致血腦屏障(BBB)破壞,神經細胞的凋亡,腦組織水腫加重情況〔7〕。

而在實際情況下,腸道菌群的種類及其功能受遺傳、年齡、生活習慣、疾病、藥物等多種因素影響。其組成具有多樣性,一般在出生后的3年內逐漸穩(wěn)定,并長期保持相對穩(wěn)態(tài)。在機體正常運行中,腸道菌群的這種動態(tài)平衡起著至關重要的作用,一旦由于某些原因打破平衡,菌群出現(xiàn)移位,其代謝后產生的有害物質可通過激活免疫系統(tǒng),促進炎性反應,加重血管壁炎癥,促進動脈硬化發(fā)生、發(fā)展〔8〕。而炎癥反應本身也是缺血再灌注損傷的一個重要發(fā)生機制,其病理基礎以炎性介質失控、釋放而形成“瀑布效應”,引起繼發(fā)神經細胞變性、壞死、凋亡等〔9〕。CIRI 后,產生了氧自由基的過度表達,其可轉變成毒性更強大的羥自由基,形成自由基的連鎖反應。自由基破壞了內皮細胞膜的結構,使其過氧化,線粒體呼吸鏈的直接受損,誘發(fā)了細胞凋亡的發(fā)生。在腸道通過腸腦軸與大腦交流的同時,大腦對腸道菌群也是有影響的。相關研究表明〔10〕,大腦對于腸道功能調節(jié)起著極為重要的調節(jié)作用,如腸道平滑肌橫向及縱向運動、胃腸消化液的產生及分泌、黏膜免疫應答等;特殊情況下,腸道通透性也是可以被大腦所影響的,進而改變了腸道菌群多樣性、分布的廣度和寬度。在進入老年后,腸道菌群多樣性和豐富性將有所下降,這也可能成為老年病、慢性病的病機,這種慢性炎癥在動脈粥樣硬化中普遍存在。目前有研究發(fā)現(xiàn),這些因素都使患者動脈硬化、血栓事件發(fā)生的風險明顯增加〔11〕。

臨床上PMB 是一種對綠膿桿菌、大腸桿菌、克雷伯桿菌及嗜血桿菌等多種陰性菌有抑制作用的抗生素,而對其他抗生素耐藥的菌株對PMB 也是敏感。而實際工作中由于其嚴重的腎毒性及神經阻滯作用,使應用被限制在燒傷合并敗血癥且為短期搶救用或外用。靜脈注射后極可能出現(xiàn)呼吸衰竭。國內外的多項關于PMB 的研究,多是關于敗血癥、重癥肺炎等的序貫體外療法〔12〕,國內有學者研究PMB與I/R 損傷,但多在腸道損傷、心肌損傷、急腹癥等方面〔13〕,極少數(shù)的研究者〔14〕涉及腦組織I/R 損傷,但所研究的為先造成模型腸道菌群失調,再研究I/R損傷后的炎癥反應,其機制考慮到腸道通透性改變,并未得到實驗證實。本研究通過制造大鼠腦I/R損傷模型,外周血FD4〔15〕濃度測量證明了腸道通透性的變化,又抑制腸道菌群代謝產物LSP 入血,驗證了在腦I/R 損傷時可減輕缺血區(qū)腦組織損傷,可降低神經功能缺損評分。

本研究結果表明,神經功能缺損評分直接反映了腦組織損傷帶來的不良后果,而后通過組織含水量測量、梗死區(qū)腦組織病理切片印證了腦損傷的嚴重程度,而在應用PMB 干預后,相關性分析顯示,隨著外周血LPS 比例升高,梗死區(qū)腦組織含水量有升高,二者呈正相關。所以降低外周血LPS 比例可能成為以后治療腦梗死、保護缺血半暗帶的新靶點。本研究還發(fā)現(xiàn),腦缺血再灌注損傷后,促炎因子IL-1β 在梗死區(qū)域異常過度表達,推測腸道菌移位、腸道菌群代謝產物入血,加重了其異常表達,也加重了腦梗死,但還有待于后期進一步深入實驗。但以上兩個新靶點是否適用于其他組織、器官缺血再灌注損傷還有待于進一步研究確定。

綜上,腦I/R 損傷后腸道通透性增加導致血液中內毒素升高,而PMB 可能對腸道黏膜屏障起到保護作用,進而抑制腸道菌群失調,減輕了局部缺血灶的炎性反應,進而減輕腦水腫,降低神經缺損行為學評分。糾正腸道菌群移位、減少其有害代謝產物,也可能成為減輕腦組織缺血再灌注損傷治療的新靶點。