食源性晚期糖基化終末產(chǎn)物上調(diào)TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路對(duì)小鼠非酒精性脂肪肝炎癥反應(yīng)的影響

劉丹鋒 蔡魏 邱劍 孫夏林 (九江市第三人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科,江西 九江 33000; 普外科)

脂肪肝是指肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積過(guò)多而影響肝臟的正常功能的病變,根據(jù)誘發(fā)成因可分為酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝(NAFL),其與肝纖維化、肝硬化、肝癌等肝臟損害疾病密切相關(guān)〔1〕。晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)是糖類(lèi)和蛋白質(zhì)結(jié)合的產(chǎn)物,AGEs 在糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病發(fā)生中發(fā)揮重要的作用,AGEs 能影響NAFL 發(fā)生發(fā)展〔2〕。Toll樣受體(TLR)4/髓樣分化因子(MyD88)、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB 的信號(hào)通路是機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的經(jīng)典通路,TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路活化可促進(jìn)炎癥反應(yīng),Ham 等〔3〕研究認(rèn)為丁香酸可下調(diào)炎癥基因(TLR4,MyD88,NF-κB)的表達(dá)而抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪變性和炎癥作用。本研究旨在觀察食源性AGEs 對(duì)TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路及肝臟炎癥反應(yīng)的影響,探討食源性AGEs 引起NAFL發(fā)生作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:C57BL/6J 小鼠60 只,雄性,體重(20±2)g,本研究通過(guò)了動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),符合道德倫理要求。實(shí)驗(yàn)試劑:4% 甲醛和10%甲醛購(gòu)自聊城芫澤化工產(chǎn)品有限公司,石蠟、伊紅染液、蘇木素染液均購(gòu)自甘肅隆鑫商貿(mào)有限公司,磷酸鹽緩沖液(PBS)和TUNEL 試劑盒均購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司?？俁NA 提取試試劑盒和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購(gòu)自Promega 公司,PCR 引物由上海達(dá)科為生物技術(shù)公司合成,GAPDH 購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。TLR4 一抗(批號(hào):sc-243052)購(gòu)自Santa 公司,MyD88 一抗(批號(hào):4127S)購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司,核因子(NF)-κB 一抗(批號(hào):XY-ABS194)購(gòu)自上海熹垣生物科技有限公司,甘油三磷酸脫氫酶(GAPDH)購(gòu)自Cell signaling 公司(批號(hào):5648T)。實(shí)驗(yàn)儀器:光學(xué)顯微鏡屬日本OLYMPUS 公司產(chǎn)品,實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀屬Applied Biosystems 產(chǎn)品,高速離心機(jī)屬德國(guó)Eppendorf 公司產(chǎn)品。

1.2 AGEs 制備 外源性AGEs 制備:將濃度為100 mmol/L的丙酮醛(MG)和0.1 mol/L 的牛血清白蛋白(BSA)溶于PBS 中(MG-BSA 溶液),37℃恒溫箱中錫紙外包避光孵育72 h,另取濃度為0.1 mol/L的BSA 溶于PBS 放入恒溫箱中孵育相同時(shí)間作為對(duì)照。72 h 后,取出兩種孵育溶液,發(fā)現(xiàn)作為對(duì)照的BSA 溶液仍是無(wú)色透明的,沒(méi)有變化,而MG-BSA 溶液由黃色變?yōu)樯钭厣?可行下一步實(shí)驗(yàn)操作。將MG-BSA 溶液移入透析袋中,排盡袋內(nèi)空氣后封閉袋口,置入碳酸氫銨緩沖液中除去未結(jié)合雜質(zhì)。取出MG-BSA 溶液移入培養(yǎng)皿中,-80℃冰箱中冷凍,48 h 后取出培養(yǎng)皿,獲得凍干MG-BSA粉末,稱取MG-BSA 粉末10 g,加入10 kg 粉狀飼料中均勻攪拌,然后通過(guò)制粒機(jī)壓制成顆粒(外源性AGEs 飼料)備用。食源性AGEs 制備:將普通飼料用電烤箱中加熱,設(shè)置溫度為120℃,加熱15 min,制成食源性AGEs 飼料,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與喂養(yǎng) 取60 只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、外源性AGEs 組、食源性AGEs 組和陽(yáng)性對(duì)照組,每組15 只?？瞻讓?duì)照組喂養(yǎng)普通飼料,外源性AGEs 組喂養(yǎng)外源性AGEs 飼料,食源性AGEs 組喂養(yǎng)食源性AGEs 飼料,陽(yáng)性對(duì)照組喂養(yǎng)高脂飼料,連續(xù)喂養(yǎng)12 w 后觀察相關(guān)指標(biāo)變化情況。

1.4 飼料AGEs 含量檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)飼料AGEs 含量。操作步驟如下:準(zhǔn)確稱取每組飼料1 g,并加入100 ml PBS 溶解,取標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,配制濃度為8 000、2 666、888、296 ng/ml、98 ng/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度稀釋液,空白孔加入PBS 作為對(duì)照,酶標(biāo)儀設(shè)定波長(zhǎng)為450 nm測(cè)定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組AGEs 含量,每組飼料重復(fù)3 次測(cè)定,結(jié)果取平均值。

1.5 血清學(xué)指標(biāo)測(cè)定 所有小鼠末次飼料喂養(yǎng)后,禁食12 h 后,采用乙醚麻醉,眼下靜脈叢取血,在3 000 r/min離心15 min,分離出血清,放置-4℃醫(yī)用冰箱中保存?zhèn)溆谩２捎萌詣?dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)含量,用ELISA 檢測(cè)小鼠血清炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-6 含量。

1.6 肝臟組織病理切片觀察 各組采集完眼下靜脈叢血后,立即處死小鼠,取出其肝臟組織,切取部分組織用10%甲醛固定48 h,脫水、包埋、切片、脫蠟后,采用蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察各組肝臟病理組織,用油紅染色觀察各組肝細(xì)胞脂肪變性程度。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)檢測(cè)肝臟組織TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白基因表達(dá) 取各組肝臟組織1 g 放入研磨器中,加入液氮粉碎研磨,利用組織裂解液進(jìn)行裂解,Trizol 法提取組織總蛋白,使用聚氰基丙烯酸正丁酯蛋白定量試劑盒對(duì)提取的總蛋白進(jìn)行定量測(cè)定,按比例加入4×蛋白上樣緩沖液,95℃變性5 min,置于-20℃保存?zhèn)溆?。設(shè)置濃縮膠電壓為80 V,分離膠電壓為120 V 進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)印。取氟乙烯膜用洗滌緩沖液洗膜5 min,共3 次,封閉、室溫?fù)u床孵育2 h。洗膜后先后加入一抗工作液(TLR4、MyD88、NF-κB 抗體)和二抗工作液,進(jìn)行一抗孵育和二抗孵育后。將新鮮配制的化學(xué)發(fā)光液滴加到氟乙烯膜表面,轉(zhuǎn)移至成像分析系統(tǒng)暗箱中曝光,采集圖像并分析。蛋白定量:以相對(duì)光密度值代表蛋白相對(duì)表達(dá)量,以GAPDH 為內(nèi)參進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)肝臟組織TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白基因表達(dá)取各組肝臟組織1 g 放入研磨器中,加入液氮粉碎研磨,利用組織裂解液進(jìn)行裂解,Trizol 法提取組織總RNA,按照PCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),PCR 引物序列5′-3′,TLR4 上游:ACCTCGAGTGGGAGGACAAT、下游: TGAGGTTAGAAGCCTCGTGC,150 bp。MyD88 上游:ATACGGAACCAGCAGAAACAG、下游: TATCAATGGGGCAGTAGCAGA,131 bp。NF-κB 上游:AACAGCAGATGGCCCATACCT、下游:ACGCTGAGGTCCATCTCCTTG,130 bp。GAPDH 上游: GAAGGTGAAGGTCGGAGT、下游:GAAGATGGTGATGGGATTTC,138 bp。設(shè)置好qRTPCR 體系,設(shè)置反應(yīng)條件:95℃5 min,95℃30 s,55℃30 s,72℃35 s,共40 個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt公式計(jì)算TLR4、MyD88、NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn);方差不齊采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn),兩兩比較行TamhaneT2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組飼料AGEs 含量 空白對(duì)照組、外源性AGES 組、食源性AGES 組、陽(yáng)性對(duì)照組飼料AGEs含量〔(513.29 ± 76.00)、(1 741.96 ± 113.00)、(1 122.98±84.99)、(844.99±82.00)ng/ml〕差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=429.943,P=0.000)。與空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組比較,外源性AGEs 組和食源性AGEs 組飼料AGEs 含量均升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05),且外源性AGEs 組顯著高于食源性AGEs 組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 各組肝臟病理切片觀察 空白對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞排列整齊,未見(jiàn)脂肪變性;食源性AGEs 組可見(jiàn)少量細(xì)小的脂肪滴空泡;外源性AGEs組和陽(yáng)性對(duì)照組可見(jiàn)脂肪滴空泡,陽(yáng)性對(duì)照組更明顯,見(jiàn)圖1。油紅染色顯示,與空白對(duì)照組比較,外源性AGEs 組、食源性AGEs 組和陽(yáng)性對(duì)照組脂滴增加,陽(yáng)性對(duì)照組更為明顯,見(jiàn)圖2。

圖2 各組肝臟油紅染色(×200)

2.3 食源性AGEs 對(duì)血脂及肝功能指標(biāo)的影響4 組血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、AST 及ALT 含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。血清TG、TC、LDL-C、AST 及ALT 表達(dá)水平在空白對(duì)照、食源性AGEs 組、外源性AGEs 組和陽(yáng)性對(duì)照組中均依次升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。與空白對(duì)照組比較,食源性AGEs 組、外源性AGEs 組和陽(yáng)性對(duì)照組血清HDL-C 表達(dá)水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05),且外源性AGEs 組和陽(yáng)性對(duì)照組低于食源性AGEs 組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1、表2。

表1 4 組血脂指標(biāo)表達(dá)水平比較(±s,n=15)

表1 4 組血脂指標(biāo)表達(dá)水平比較(±s,n=15)

與空白對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與食源性AGEs 組比較:2)P＜0.05;與外源性AGEs 組比較:3)P＜0.05;4)Kruskal-wallis H 檢驗(yàn);下表同

組別TG(mmol/L)TC(mmol/L)LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)0.86±0.236.14±0.613.52±0.391.51±0.33食源性AGEs 組1.43±0.221)10.81±0.881)7.73±0.471)0.94±0.341)外源性AGEs 組1.84±0.291)2)14.25±1.201)2)9.32±0.531)2)0.68±0.281)2)陽(yáng)性對(duì)照組2.51±0.391)2)3)19.58±1.451)2)3)12.46±0.711)2)3)0.49±0.361)2)F 值P 值空白對(duì)照組50.155 0.0004)55.336 0.0004)718.876 0.000 26.751 0.000

2.4 食源性AGEs 對(duì)血清炎癥因子的影響 4 組血清TNF-α、IL-2 及IL-6 表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)意義(均P＜0.05)。與空白對(duì)照組比較,食源性AGEs組、外源性AGEs 組和陽(yáng)性對(duì)照組血清TNF-α、IL-2及IL-6 表達(dá)水平均升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05),外源性AGEs 組和陽(yáng)性對(duì)照組高于食源性AGEs 組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05),陽(yáng)性對(duì)照組高于外源性AGEs 組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4 組肝功能指標(biāo)血清炎癥因子表達(dá)水平比較(±s,n=15)

表2 4 組肝功能指標(biāo)血清炎癥因子表達(dá)水平比較(±s,n=15)

組別AST(U/L)ALT(U/L)TNF-α(mg/kg)IL-2(mg/kg)IL-6(mg/kg)0341.53±8.69食源性AGEs 組60.87±5.491)51.27±10.801)80.73±15.361)67.73±9.351)48.73±6.711)外源性AGEs 組98.07±5.811)2)62.60±5.291)2)91.20±18.471)2)75.93±9.151)2)56.27±10.351)2)陽(yáng)性對(duì)照組114.60±6.661)2)3)80.00±7.151)2)3)99.40±19.311)2)3)96.33±7.891)2)3)71.47±9.321)2)3)F 值P 值空白對(duì)照組32.27±4.3544.67±2.6468.67±16.5958.47±8.647.293 0.000 70.753 0.000 8.660 0.000 52.466 0.000 33.146 0.000

2.5 食源性AGEs 對(duì)肝組織TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的影響 4 組肝組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及其mRNA 表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。與空白對(duì)照組比較,食源性AGEs 組、外源性AGEs 組和陽(yáng)性對(duì)照組TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白及其mRNA 表達(dá)水平均升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05),且陽(yáng)性對(duì)照組肝組織TLR4、MyD88、NF-κB 及MyD88mRNA 表達(dá)水平顯著高于食源性AGEs 組和外源性AGEs 組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 4 組TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白及mRNA 表達(dá)水平比較(±s,n=15)

表3 4 組TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白及mRNA 表達(dá)水平比較(±s,n=15)

組別TLR4MyD88NF-κBTLR4 mRNAMyD88 mRNANF-κ B mRNA空白對(duì)照組0.82±0.100.62±0.090.95±0.130.68±0.070.54±0.080.70±0.11外源性AGEs 組1.08±0.141)0.77±0.171)0.85±0.151)0.85±0.151)0.68±0.141)0.83±0.151)食源性AGEs 組1.11±0.181)0.87±0.131)0.95±0.111)0.95±0.111)0.75±0.121)0.86±0.161)陽(yáng)性對(duì)照組1.36±0.231)2)3)1.13±0.241)2)3)0.99±0.171)2)3)0.99±0.171)1.00±0.221)2)3)0.94±0.181)F 值P 值33.710 0.000 36.090 0.000 13.197 0.000 30.225 0.000 36.400 0.000 6.781 0.001

3 討 論

研究顯示,脂肪肝發(fā)病多與過(guò)度飲酒、營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩、胰島抵抗等危險(xiǎn)因素相關(guān)〔4～6〕,我國(guó)脂肪肝伴肝功能損害的發(fā)病人數(shù)不斷增加且有年輕化趨勢(shì)〔7〕。NAFL 病因多樣且復(fù)雜,目前尚未明確其發(fā)病機(jī)制,不斷探索、發(fā)現(xiàn)NAFL 病因及發(fā)病機(jī)制,對(duì)實(shí)施有效的干預(yù)措施以預(yù)防和控制疾病發(fā)生和發(fā)展具有重要的意義。

以往多項(xiàng)研究通過(guò)高脂誘導(dǎo)小鼠制備N(xiāo)AFL 模型均有成功的先例〔8,9〕。AGEs 是還原糖的羧基與大分子物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)等的氨基結(jié)合后經(jīng)過(guò)重排脫水等反應(yīng)形成的不可逆產(chǎn)物。食物中AGEs 含量差異除了與原材料有關(guān)外,與食物的加工方式亦有極大關(guān)聯(lián),因此本研究通過(guò)化學(xué)反應(yīng)方式制備外源性AGEs 及用電烤箱烘烤飼料以獲取食源性AGEs,旨為實(shí)驗(yàn)研究提供多種含AGEs 原材料。本文結(jié)果提示,飼料烘烤后可產(chǎn)生AGEs 增加,其可用作于食源性AGEs 飼料。本文結(jié)果表明,小鼠在喂養(yǎng)外源性AGEs 飼料、食源性AGEs 飼料和高脂飼料后,肝臟組織發(fā)生不同程度的脂肪變性。以往研究顯示AGE 受體(RAGE)是細(xì)胞表面分子的免疫球蛋白超家族成員之一,與AGE 及蛋白質(zhì)分子相互作用參與炎癥反應(yīng),高水平的AGE 可促進(jìn)RAGE 的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與促進(jìn)炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展〔10〕,肝臟組織發(fā)生炎癥反應(yīng)可能是加重其脂肪變性的重要原因。本文結(jié)果提示,食源性AGEs、外源性AGEs 及高脂飲食均能上調(diào)炎癥因子表達(dá)水平,進(jìn)一步證實(shí)了NAFL 發(fā)生與炎癥反應(yīng)機(jī)制高度相關(guān),這一結(jié)果與唐東暉等〔11〕、何峰等〔12〕研究結(jié)果相一致。本文結(jié)果表明,脂肪變性后所造成的血清TG、TC、LDL-C、AST、ALT、HDL-C 表達(dá)水平的高低取決于小鼠脂肪肝變性的嚴(yán)重程度。

TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路參與多種疾病病理生理過(guò)程,在炎癥性疾病中扮演著重要的作用。Xu 等〔13〕研究認(rèn)為利拉魯肽聯(lián)合人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB 炎癥途徑和氧化應(yīng)激改善NAFL 大鼠肝臟病變。El-Kashef 等〔14〕認(rèn)為硫代乙酰胺顯著增加NF-κB 表達(dá),增強(qiáng)TLR4 和NLPR3炎癥小體的產(chǎn)生而誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷作用。青蒿琥酯能抑制TLR4 及MyD88 表達(dá)改善NAFL 小鼠肝臟脂肪變性作用〔15〕。以上研究結(jié)果提示,NAFL 發(fā)病與TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路活化相關(guān),TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路表達(dá)升高可促進(jìn)炎癥反應(yīng),對(duì)肝臟脂肪變性具有消極作用。本研究結(jié)果提示,食源性AGEs、外源性AGEs 和高脂飼料均能上調(diào)TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路表達(dá),高脂飼料對(duì)TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路的作用更明顯。

綜上所述,食源性AGEs 促進(jìn)小鼠炎癥反應(yīng),加重小鼠肝臟脂肪變性,其可能作用機(jī)制與上調(diào)TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路表達(dá)相關(guān)。然而本研究仍有不足之處,由于食源性的AGEs 含量無(wú)法準(zhǔn)確確定,本研究尚未對(duì)食源性AGEs 劑量進(jìn)行討論,此外,外源性AGEs 組TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白及其mRNA 表達(dá)略高于食源性AGEs組,但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此上述結(jié)論仍需要開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。