絕經(jīng)后婦女維生素B相關(guān)基因3′-UTR多態(tài)性與骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折的相關(guān)性分析

劉珂，劉遠(yuǎn)

(1.北京廣外社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京 100055；2.淮安市第二人民醫(yī)院，江蘇淮安 223000)

既往研究顯示，年齡、吸煙、飲酒、類固醇應(yīng)用、高同型半胱氨酸血癥、維生素缺乏等與骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折(Osteoporotic vertebral compression fractures,OVCF)相關(guān)[1-2]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，高水平的同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)可產(chǎn)生過(guò)量自由基，增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)破骨細(xì)胞活性和骨吸收，抑制骨形成，加速骨量丟失和骨質(zhì)疏松形成[3]。維生素也與骨骼健康密切相關(guān)，維生素B6、B9(葉酸)和B12(甲鈷胺)缺乏會(huì)導(dǎo)致血清Hcy水平升高。研究顯示，甲鈷胺可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，甲鈷胺缺乏可通過(guò)提高Hcy和甲羥甲基丙烯酸水平，增加破骨細(xì)胞形成[4]。維生素B1(硫胺素)可能抑制核因子κb配體誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成的受體激活劑，維生素B1缺乏可能與骨健康不良之間存在聯(lián)系[5]。雖然維生素B在骨代謝中發(fā)揮重要作用，但維生素B相關(guān)基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松之間的關(guān)系研究較少見報(bào)道。本研究選擇4種已知與B族維生素相關(guān)的基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)，包括TCN2(編碼TCⅡ)、CD320(編碼TCⅡ受體)、SLC19A1(編碼RFC1)和SLC19A2(編碼硫胺素載體1)，探討這4種單核苷酸多態(tài)性與本地絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥和OVCF的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究為前瞻性病例對(duì)照研究，研究符合《赫爾辛基宣言》原則，本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)本研究，所有受試者均簽署知情同意書。選擇2020年1月～2021年3月在本院就診的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者157例(其中OVCF61例)作為研究組，所有患者均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①末次月經(jīng)距今來(lái)訪日期>1年，或自發(fā)性閉經(jīng)6個(gè)月伴血清FSH水平>40 mIU/mL，符合絕經(jīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②雙能X線骨密度儀檢測(cè)骨密度T值<-2.5，符合骨質(zhì)疏松的診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者伴或不伴影像學(xué)診斷的OVCF；③患者對(duì)研究知情并簽署同意書。選擇同期在本院健康體檢的非骨質(zhì)疏松絕經(jīng)后婦女157例作為對(duì)照組，所有受試者腰部和髖部T值>-1.0，患者無(wú)脊柱或髖部骨折。兩組受試者均排除：①合并彌漫性特發(fā)性骨質(zhì)增生、腦垂體疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺功能亢進(jìn)等代謝性疾??；②近期口服抗凝劑、避孕藥、激素替代療法、類固醇激素、鈣、維生素D或維生素B等影響骨代謝的藥物者；③血清陰性脊柱關(guān)節(jié)病；④腦卒中或缺血性心臟??；⑤癌癥患者或外籍患者；⑥精神疾病患者或嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙者。研究組受試者年齡54～79歲，平均(68.73±6.45)歲；體質(zhì)量指數(shù)(22.46±2.85)kg/m2；對(duì)照組受試者年齡52～79歲，平均(68.94±6.08)歲；體質(zhì)量指數(shù)(22.58±2.64)kg/m2。兩組受試者年齡、體質(zhì)量指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 研究方法

收集受試者5mL外周血，離心分離白細(xì)胞后，采用G-DEXIIb基因組DNA提取試劑盒(江萊生物)提取基因組DNA，用聚合酶鏈反應(yīng)和限制性片段呈現(xiàn)基因多態(tài)性(PCR-RFLP)對(duì)CD320 rs9426 C>T、TCN2 rs10418 C>T、SLC19A1 rs1051296 G>T和SLC19A2 rs16862199C>T的3’-UTR多態(tài)性進(jìn)行基因分型(見圖1)。使用PrimerQuest設(shè)計(jì)引物序列：CD320 rs9426 C>T：正向：5’-TGTCTTAAGCACAGGGCCGTTCTA-3’，反向：5’-GGTCCCTGGACACTCCCCATG-3’；TCN2 rs10418 C>T，正向：5’-ACTCTGTTAGAGTGGCAGATC-3’，反向：5’-GCTTTAATTTTGTCAGAGGCAGG-3’；SLC19A1 rs1051296 G>T：5’-GCTTCTCTGTCTCTGTGGAAA-3’，反向：5’-AAGCCTGGCACATACCAA-3’；SLC19A2 rs16862199 C>T：正向：5’-GCAGGAATCACATCTATCCTAGTTCC-3’，反向：5’-GCTTAAGGTACGCTTGCTTGTC-3’。

圖1 限制性片段程度多態(tài)性隨基因型的變化(A示：CD320 rs9426 C>T；B示：TCN2 rs 10418 C>T；C示：SLC19A1 rs1051296 G>T；D示：SLC19A2 rs16862199 A>G)

1.3 其他臨床資料收集

包括血糖、血Hcy、葉酸、高密度脂蛋白(high density lipoprotein-C,HDL-C)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein-C,LDL-C)、甘油三酯(triglyceride,TG)、維生素B12等血清學(xué)指標(biāo)，以及骨密度(bone mineral density,BMD)、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)、收縮壓(systolicbloodpressure,SBP)等指標(biāo)。血糖、HDL-C、LDL-C、TG等采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)，采用熒光偏振免疫測(cè)定法測(cè)定Hcy，采用競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定法檢測(cè)葉酸水平，使用Bio-Rad Quataphase Ⅱ放射測(cè)定法檢測(cè)維生素B12水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律的吻合度檢驗(yàn)

2.2 兩組受試者基因型比較

兩組受試者CD320 rs9426 SNP存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，TCN2 rs 10418、SLC19A1 rs 1051296、SLC19A2 rs16862199 SNP差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組受試者4種維生素B相關(guān)基因基因型比較(例)

2.3 四個(gè)SNP的等位基因組合與骨質(zhì)疏松和OVCF的關(guān)系

采用MDR方法分析四個(gè)SNP的等位基因頻率(順序?yàn)镃D320 rs9426、TCN2 rs 10418、SLC19A1 rs 1051296、SLC19A2 rs16862199，見表2)，有兩個(gè)等位基因綜合在對(duì)照組和研究組之間存在顯著差異，分別是C-T-T-C和T-C-G-C(P<0.05)；5個(gè)等位基因在對(duì)照組和OVCF組之間存在顯著差異，分別是C-C-G-T、C-C-T-C、C-C-T-T、C-T-T-C和T-C-G-C(P<0.05)；3個(gè)等位基因在對(duì)照組和非OVCF研究組患者之間存在顯著差異，分別是C-T-G-C、C-T-G-T和C-T-T-C(P<0.05)。見表2。

表2 四個(gè)SNP的等位基因組合與骨質(zhì)疏松和OVCF的關(guān)系

3 討論

新的證據(jù)表明，B族維生素特別是維生素B1、甲鈷胺和葉酸對(duì)骨骼有保護(hù)作用，而同型半胱氨酸對(duì)骨骼健康有不利影響[6]。既往研究已經(jīng)證實(shí)，葉酸、維生素B12、維生素B6和維生素B2均參與了Hcy代謝[7]。因此，葉酸和維生素B12缺乏可能導(dǎo)致血清同型半胱氨酸水平升高，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和OVCF。鈷胺素首先與鈷胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(transcobalamin II,TCⅡ)復(fù)合，然后TCⅡ-鈷胺素復(fù)合物通過(guò)細(xì)胞表面TCⅡ受體(CD320基因編碼)的相互作用進(jìn)入細(xì)胞[8]。硫胺和葉酸可分別通過(guò)硫胺載體1(TC1，由SLC19A2編碼)和還原葉酸載體(由SLC19A1編碼)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中[9]。B族維生素狀態(tài)與直接參與維生素吸收/攝取(CD320)或轉(zhuǎn)運(yùn)(TCN2、SLC19A1、SLC19A2)基因中的SNP有關(guān)，這些基因中的SNP可通過(guò)維生素的個(gè)體作用及其對(duì)Hcy濃度的影響，對(duì)骨健康產(chǎn)生有害作用。

本研究探討了位于CD320、TCN2、SLC19A1和SLC19A2基因3’-UTR的SNP與絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥和OVCF之間的可能關(guān)聯(lián)。本研究的主要結(jié)果包括：①CD320 CT+TT在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者中發(fā)生率顯著升高，提示CD320 CT+TT可能與絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松發(fā)生相關(guān)；②C(CD320)-T(TCN2)-T(SLC19A1)-C(SLC19A2)和T(CD320)-C(TCN2)-G(SLC19A1)-C(SLC19A2)等位基因組合與骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)顯著增加相關(guān)；③C-C-G-T、C-C-T-C、C-C-T-T、C-T-T-C和T-C-G-C等5個(gè)等位基因組合與OVCF風(fēng)險(xiǎn)顯著增加相關(guān)。既往研究顯示，與非骨質(zhì)疏松患者相比，骨質(zhì)疏松患者尤其是OVCF患者表現(xiàn)為更高水平的葉酸和高Hcy水平。本研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了影響同型半胱氨酸水平的B族維生素基因型與骨質(zhì)疏松和OVCF發(fā)病率的關(guān)系。

總體而言，本研究表明，在攜帶基因型CD320-CT+TT和多個(gè)基因組合型的患者中，骨質(zhì)疏松癥和OVCF發(fā)生率顯著增加。Stone等[10]研究顯示，miR-126結(jié)合位點(diǎn)的SNP與總Hcy水平升高和甲基丙二酸水平顯著相關(guān)。來(lái)自BPROOF研究的橫斷面研究顯示，女性Hcy水平升高與骨超聲參數(shù)之間呈顯著負(fù)相關(guān)[11]。Hcy可能會(huì)阻礙骨內(nèi)膠原交聯(lián)的形成，從而以獨(dú)立于骨密度的方式降低骨強(qiáng)度。Yang等[12]研究顯示，一般人群中的血清Hcy水平輕微上升即與脊柱和髖部骨折風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。DNA甲基化在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，蛋氨酸向Hcy轉(zhuǎn)化涉及到一個(gè)甲基去除，高水平的Hcy可抑制這種轉(zhuǎn)化，降低DNA甲基化活性和改變基因表達(dá)，從而影響CD320基因表達(dá)。等位基因-等位基因組合分析顯示，不同基因綜合與骨質(zhì)疏松和OVCF風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，提示可能存在基因-基因相互作用，這一點(diǎn)需要進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，本研究顯示，3′-UTR中CD320基因的單核苷酸多態(tài)性可能與絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松及OVCF的發(fā)生有關(guān)，CD320、TCN2、SLC19A1和SLC19A2的特定等位基因組合可能增加骨質(zhì)疏松癥和OVCF的易感性。