大豆苗期根系根際酶譜原位分析

姜振峰，李珊珊，溫明星，孫亞男，趙宛瀛，劉志華

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北大豆生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

根系是植物吸收養(yǎng)分和水分的重要器官。作物正常生長發(fā)育是地上部光合作用與地下部根群吸收水分和養(yǎng)分協(xié)調(diào)的結(jié)果[1]。發(fā)育強(qiáng)壯的根系對促進(jìn)地上部分光合作用與有機(jī)物質(zhì)積累具有重要意義，影響作物產(chǎn)量[2]。Weaver指出，科學(xué)理解作物生產(chǎn)過程必須全面認(rèn)識作物根系發(fā)育、根群分布及不同環(huán)境條件下根系變化[3]。研究表明，健壯根系可有效提高大豆抗倒伏能力，提高產(chǎn)量[4]。大豆根系在不同品種、發(fā)育時期和環(huán)境條件作用下形態(tài)學(xué)特點(diǎn)不同。傅金民等指出，在大豆生育中前期，根系生長良好對提高產(chǎn)量具有積極作用[5]。田佩占研究表明，大豆育種應(yīng)注重培育后期根系發(fā)達(dá)且不早衰的新品種[6]。有關(guān)大豆根系形態(tài)研究，主要集中在不同抗逆性及不同生態(tài)類型大豆基因型差異方面[7-8]。對南方主栽大豆有限生長習(xí)性和北方主栽大豆亞有限生長習(xí)性根系形態(tài)比較研究少，大豆根系生物學(xué)特性不明確。明確作物根系生長發(fā)育時空分布特征及其與土壤環(huán)境相互關(guān)系，對作物新品種定向培育及在特定土壤條件下適時實(shí)施農(nóng)藝措施、創(chuàng)造良好根系生長環(huán)境、提高作物產(chǎn)量均具有重要指導(dǎo)意義[9-10]。

根系與土壤接觸界面、根系周圍幾毫米范圍內(nèi)微小土壤體積，形成獨(dú)特而復(fù)雜的生境生態(tài)位，稱之為根際[11]。根系向根際分泌多種物質(zhì)，包括單糖及氨基酸等可溶性單體，及與植株生長發(fā)育密切相關(guān)的各類水解酶。這些活性酶可促進(jìn)C、N、P循環(huán)，刺激微生物富集代謝，通過與養(yǎng)分水平正向反饋，達(dá)到提升營養(yǎng)周轉(zhuǎn)率的作用[12-13]。因此，根際被認(rèn)為是最具活力的酶活性熱點(diǎn)之一。酶降解有機(jī)高分子聚合物，產(chǎn)生可溶性低聚物和單體，對土壤有機(jī)質(zhì)動態(tài)變化乃至生物全球化學(xué)循環(huán)均極為敏感[14]。根系向土壤中釋放的酶是土壤質(zhì)量可靠指標(biāo)，提供土地污染、改良和其他利用變化信息。例如，以β-葡糖苷酶與纖維二糖水解酶為代表的纖維素酶群，可將土壤中存在的纖維素大分子分解為葡萄糖等易被吸收單體，為根系和微生物提供碳源，是調(diào)控纖維素連續(xù)降解過程關(guān)鍵，其活性直接限制纖維素水解[15]。將此類酶作為指標(biāo)，測量并觀察其活性變化，可探知根系向外部環(huán)境釋放營養(yǎng)物質(zhì)的規(guī)律及在根際間根系與土壤環(huán)境之間的交流過程[16-17]。馬星竹等利用酶活性測定技術(shù)，初步研究長期不同施肥條件下大豆田黑土酶活性[18]。劉慧璐等針對抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆，利用化學(xué)方法，測定大豆根際土壤中脲酶、蔗糖酶、堿性磷酸酶和過氧化氫酶活性，補(bǔ)充大豆根際酶活性研究[19]。目前需全面、系統(tǒng)分析各種酶活性變化規(guī)律，為強(qiáng)壯根系栽培技術(shù)及品種選育提供理論支持。

研究表明，不同土壤類型所固有理化性質(zhì)以及各種田間管理手段，包括施肥和對同一土壤的改良措施等，均對土壤酶活性造成影響[19]。不同質(zhì)地土壤理化性質(zhì)可能差異較大。土壤中礦物成分可與OM（有機(jī)質(zhì)）緊密結(jié)合，導(dǎo)致OM降解變緩。二者之間相互作用可促進(jìn)土壤形態(tài)和生化特性穩(wěn)定，使其更加肥沃[20]。土壤肥力下降是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中影響產(chǎn)量提升的重要因素。明確土壤肥力下降對農(nóng)作物根系生長發(fā)育的影響是穩(wěn)定和恢復(fù)糧食產(chǎn)量的必要前提，在大豆中報道較少。針對上述問題，本研究分析生長習(xí)性不同的3個大豆品種在正常和退化土壤根系表型特征；同時，建立根系發(fā)育碳代謝和能量代謝相關(guān)酶活性變化，試圖明確土壤中有機(jī)質(zhì)含量對大豆根系生長發(fā)育的影響規(guī)律，為培育不同環(huán)境條件下栽培高產(chǎn)抗倒伏大豆新品種提供根系角度的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 田間試驗(yàn)材料

大豆品種Charleston、東農(nóng)594和DN50由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供。Charleston為有限生長習(xí)性，適合窄行密植栽培，是南方地區(qū)主栽大豆品種類型；東農(nóng)594為亞有限生長習(xí)性，是北方地區(qū)主栽大豆類型；DN50為亞有限生長習(xí)性，小粒品種，有分枝，屬特用大豆。

1.1.2 酶譜活性原位測定材料

1.1.2.1 土壤樣品基本信息

根據(jù)土樣有機(jī)質(zhì)含量不同將土樣1定義為高有機(jī)質(zhì)土壤；土樣2為低有機(jī)質(zhì)土壤（見表1）。土壤樣本取回后經(jīng)天然曬干，過2 mm篩子篩選土壤樣品，剔除較大板結(jié)土塊及石礫等雜質(zhì)，以獲得顆粒均勻的土壤樣本。

表1 試驗(yàn)用土壤基本信息Table 1 Information of the soils used in current experiment

1.1.2.2 蛭石

實(shí)驗(yàn)室植物苗培養(yǎng)使用常規(guī)蛭石。

1.1.2.3 尼龍膜

N66有機(jī)尼龍膜，直徑200 mm，孔徑0.45μm，購自浙江海寧桃園醫(yī)療化工儀器廠。

1.1.3 主要試劑藥品

4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷（MUF-G）、4-甲基傘形酮酰磷酸酯（MUF-P）、4-甲基傘形酮（MUF）、MES buffer均購自德國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 根盒培養(yǎng)根系分析表型方法

1.2.1.1 根盒土壤和溶液準(zhǔn)備

取田間有機(jī)質(zhì)含量較高的地表20 cm表層土和有機(jī)質(zhì)含量較低土壤，室內(nèi)通風(fēng)晾干。碾碎過篩，去除石塊和秸稈雜質(zhì)，用于根盒培養(yǎng)根系試驗(yàn)。因土壤顆粒較細(xì)，田間土壤孔隙結(jié)構(gòu)差異較大，本研究向土壤中添加蛭石以提高土壤樣品孔隙度和吸水特性，盡量還原田間土壤原位狀態(tài)。另外，為還原土壤中營養(yǎng)環(huán)境，本研究利用高低有機(jī)質(zhì)土壤浸出液為根盒提供水分，模擬不同土壤環(huán)境。

1.2.1.2 根盒準(zhǔn)備

根盒為前后均可拆卸的長方形透明盒，規(guī)格為23 cm×17 cm×3 cm。根盒上端有一長方形開口，4 cm×2 cm，為出苗口；下端開有6個圓形小口，直徑6 mm，作為滲水口。

1.2.1.3 根盒土壤準(zhǔn)備

本研究分析高低有機(jī)質(zhì)土壤環(huán)境中根系生長狀態(tài)。將蛭石與兩種土壤混合均勻，設(shè)置兩類處理（L與H類）。每個處理設(shè)置6個重復(fù)，每個根盒為1個重復(fù)。打開根盒將混合土樣緩慢連續(xù)倒入根盒中，獲得均勻的填充環(huán)境且避免分層。關(guān)閉開口側(cè)，緩慢立起根盒，輕輕搖動使上層土壤保持水平。將根盒前后兩側(cè)嚴(yán)格密封，垂直靜置，利用重力夯實(shí)混合樣品環(huán)境。將根盒放在浸出液中，達(dá)到土壤相對含水量為60%，以保證種子萌發(fā)。

1.2.1.4 播種

選擇種粒飽滿，無損傷，大小一致Charleston、DN594、DN50種子作為試驗(yàn)用種。每個根盒中平行相距1～2 cm種植2粒種子，種植深度為表土層下0.5～1 cm。將根盒外側(cè)遮光處理，僅保留出苗口，以使幼苗長出。將根盒放入培養(yǎng)箱（GXZ-380，寧波江南，中國）中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱條件：白天溫度30℃，保持光照13 h，光合有效輻射強(qiáng)度均為300μmol·m-2·s-1；黑夜溫度為20℃，維持11 h。培養(yǎng)時，種子所在一面向下，傾斜60°放置根盒。由于重力作用，根系趨于表層土壤生長。種子萌發(fā)8 d后根尖已到達(dá)根盒底部，根系主根和側(cè)根特征呈現(xiàn)不同規(guī)律。因此，本研究以種子萌發(fā)8 d后根系為酶活性分析提供根系長度及生長邊界的表型基礎(chǔ)。

1.2.2 土壤酶活原位測定

1.2.2.1 酶譜法測定及紫外成像

在Kuzyakov Lab根際酶活性分析方法基礎(chǔ)上稍加修改作β-葡糖苷酶酶譜活性原位分析[21]。所用底物分別為：4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷（MUF-G）。底物本身結(jié)合一種熒光染料：4-甲基傘形酮（MUF）。當(dāng)?shù)孜锱c相應(yīng)特異性酶反應(yīng)時，MUF分子被釋放，于紫外線下可產(chǎn)生熒光反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)酶活性可視化。底物需溶解于緩沖液中（MESbuffer，MEShemisodium salt），溶液濃度設(shè)定為12 mmol·L-1。

按照根盒大小與根系生長實(shí)際情況將聚酰胺濾膜剪切成相應(yīng)尺寸，用每種酶的特異性底物溶液浸泡20 min，保證濾膜處于飽和狀態(tài)。將浸泡好的飽和膜覆蓋至土壤表面，孵育90 min。孵育后，暗室中將膜放置于紫外（UV）照射下，觀察熒光反應(yīng)（紫外線激發(fā)波長為355 nm，發(fā)射波長為460 nm），拍照。

1.2.2.2 酶譜圖像處理與分析

紫外光下，底物中攜帶的熒光物質(zhì)（MUF）呈現(xiàn)熒光反應(yīng)的位置即為底物被特異性酶水解的區(qū)域。熒光反應(yīng)強(qiáng)弱與酶活性呈正比。利用Image J處理酶譜圖像，利用Office Excel 2010和R函數(shù)分析數(shù)據(jù)。

1.2.2.3 酶譜活性標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

為計算酶活性，建立一個標(biāo)準(zhǔn)函數(shù)曲線。操作方法是：配制不同濃度梯度MUF溶液：0.01、0.10、0.20、0.25、0.50、1.00、2.00（mmol·L-1），將膜切割成1 cm2正方形，浸入梯度溶液。將飽和膜放入相同條件紫外光下，獲得飽和熒光區(qū)域平均灰度值。以“實(shí)際濃度=C（MUF aq）·S-1（飽和熒光區(qū)域）（mM·cm-2）”為X軸，以“實(shí)際灰度值=飽和熒光區(qū)域平均灰度值-背景灰度值”為Y軸，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線分析試驗(yàn)獲得圖像，獲得酶活性值，單位均為mM·cm-2。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Office Excel 2010、SPSS 19.0、Phtoshop 6.0和Image J軟件分析數(shù)據(jù)和處理圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-葡糖苷酶來源確定

通過尼龍膜隔離土壤和大豆根系進(jìn)行酶活性原位檢測，結(jié)果證明大豆根系可分泌β-葡糖苷酶到根系表面（見圖1），參與根際土壤中微生物種類和豐度變化，影響根際營養(yǎng)可利用的種類和豐度，反饋植株生長發(fā)育。酶活性原位分析可準(zhǔn)確反應(yīng)酶變化規(guī)律，所以本研究對β-葡糖苷酶活性進(jìn)行原位分析。

圖1 大豆根系分泌β-葡萄糖苷酶至根表面Fig.1 Evidence of soybean root secretes β-glucosidaseto root surface

2.2 主根酶活性原位定量方法建立

雖然在玉米等作物中已確定根際酶活性較高區(qū)域，但在大豆中尚未見報道。本研究通過分析原位酶活性熒光圖像，確定大豆根際酶活性較高區(qū)域，建立函數(shù)曲線對酶活性進(jìn)行原位定量。

首先，配制濃度為0.01、0.1、0.2、0.25、0.5、1、2 mmol·L-1的MUF溶液，測定1 cm2尼龍膜在梯度溶液浸潤后熒光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下：

該方程R2=0.9538，證明該線性函數(shù)擬合優(yōu)度較好，可用此函數(shù)代表兩個變量相關(guān)性?？捎墒剑?）得到式（2）：

其中，x′為圖像中熒光反應(yīng)位點(diǎn)像素級灰度值，y′為該位點(diǎn)代表的實(shí)際定量酶活。利用公式（2）即可獲得測定水解酶的根際活性變化規(guī)律。

2.3 主根酶活性分析

2.3.1 根系生長方向和直徑方向酶活性分析

根據(jù)3個大豆品種所有樣品主根系圖像及酶譜圖像進(jìn)行數(shù)值轉(zhuǎn)換，計算不同土壤環(huán)境下樣品酶活性變化，分析3個大豆品種在高低有機(jī)質(zhì)土壤β-葡糖苷酶活性沿根系生長方向及垂直根系生長方向分布規(guī)律。

結(jié)果如表2所示，沿Charleston主根方向β-葡糖苷酶在高低有機(jī)質(zhì)條件下酶橫向擴(kuò)散寬度均為根基部最低，向根尖逐漸升高，在根尖酶活性熱點(diǎn)區(qū)擴(kuò)散寬度達(dá)到最高值，在兩種土壤環(huán)境中擴(kuò)散寬度為1.48～2.04 mm。高低有機(jī)質(zhì)土壤間β-葡糖苷酶擴(kuò)散寬度有差異，低有機(jī)質(zhì)環(huán)境下β-葡糖苷酶活性橫向擴(kuò)散寬度大于高有機(jī)質(zhì)含量。即根系土壤有機(jī)質(zhì)含量較低時，β-葡糖苷酶活性分布向土壤中延伸程度更高。

沿DN594主根方向β-葡糖苷酶在根際向土壤中擴(kuò)散方式和Charleston類似（見表2），表現(xiàn)為主根基部酶向根際土壤中擴(kuò)散能力最低（1.34～1.73 mm），逐漸升高（根中部分布范圍為1.73～1.80 mm），在根尖部位達(dá)到最高值（1.99～2.37 mm）。比較結(jié)果表明，大豆品種間β-葡糖苷酶在根際擴(kuò)散能力上有差異。Charleston的β-葡糖苷酶在所有環(huán)境中擴(kuò)散寬度平均值為（1.57±0.15）mm，而DN594擴(kuò)散寬度為（1.83±0.17）mm。表明DN594根系β-葡糖苷酶活性更強(qiáng)。

DN50根際β-葡糖苷酶擴(kuò)散能力規(guī)律和Charleston、DN594類似，酶擴(kuò)散寬度均從根基部向根尖逐漸升高。在低有機(jī)質(zhì)土壤中酶活擴(kuò)散程度大于高有機(jī)質(zhì)土壤環(huán)境（見表2）。

表2 沿大豆主根方向β-葡糖苷酶活性橫向擴(kuò)散寬度Table 2 Transverse diffusion width ofβ-glucosidase activity along thetap root of soybean(mm)

2.3.2 沿根系方向酶活性強(qiáng)弱變化

根際酶活性與根系生命活動強(qiáng)弱密切相關(guān)。3個品種分析結(jié)果表明酶活性變化規(guī)律為根基部最低，沿根系向根尖逐漸升高，在根尖達(dá)到最大值，形成根尖酶活熱點(diǎn)。具體表現(xiàn)為Charleston的β-葡糖苷酶在有機(jī)質(zhì)土壤中活性由根基部向根尖逐漸升高，根尖區(qū)域形成熱點(diǎn)（見表3）。高有機(jī)質(zhì)土壤條件下β-葡糖苷酶活性高于低有機(jī)質(zhì)土壤。其中，高有機(jī)質(zhì)土壤中酶活性強(qiáng)度最高為（4.41±0.33）mM·cm-2，低有機(jī)質(zhì)土壤酶活性強(qiáng)度最高為（4.25±0.16）mM·cm-2。

DN594的β-葡糖苷酶沿主根生長方向酶活性變化規(guī)律和Charleston相似，均由根基部向根尖逐漸升高，根尖區(qū)域形成熱點(diǎn)（見表3）。有機(jī)質(zhì)對酶活性影響規(guī)律相同。高有機(jī)質(zhì)土壤中主根基部、中部及根尖酶活性均強(qiáng)于低有機(jī)質(zhì)土壤。

表3 沿大豆主根方向的β-葡糖苷酶活性強(qiáng)度Table3 Intensity ofβ-glucosidaseactivity along thetap root of soybean（mM·cm-2）

DN50的β-葡糖苷酶活性規(guī)律和Charleston、DN594類似，均在根尖形成活性最高熱點(diǎn)區(qū)，根基部活性最弱。但DN50沿主根方向酶活性強(qiáng)度表現(xiàn)出高有機(jī)質(zhì)環(huán)境小于低有機(jī)質(zhì)環(huán)境，表明有機(jī)質(zhì)含量對β-葡糖苷酶活性存在基因型差異。

2.4 側(cè)根酶活性分析

與主根分析方式相同，將側(cè)根分為上中下三段，即根基部、中間部分和尖端區(qū)域（根尖），分析側(cè)根酶活性。

2.4.1 酶活性徑向根際延伸

如表4所示，在兩種有機(jī)質(zhì)土壤環(huán)境條件下，Charleston植株側(cè)根，沿生長方向，即由根基部到根尖，酶活性橫向擴(kuò)散寬度均呈逐漸增加趨勢，在根尖區(qū)域達(dá)到最大寬度（1.70 mm）。

表4 沿大豆側(cè)根方向β-葡糖苷酶活性橫向擴(kuò)散寬度Table 4 Transversediffusion width ofβ-glucosidase activity along the lateral root of soybean(mm)

沿DN594側(cè)根方向β-葡糖苷酶在根際向土壤中擴(kuò)散方式和Charleston類似，表現(xiàn)為側(cè)根基部酶向根際土壤中擴(kuò)散能力最低（為1.08～1.19 mm），逐漸升高（根中部分布范圍為1.45～1.71 mm），根尖部位達(dá)到最高值（為1.88～1.90 mm）。土壤有機(jī)質(zhì)對酶活性無影響。在低有機(jī)質(zhì)環(huán)境下β-葡糖苷酶活性橫向擴(kuò)散寬度大于高有機(jī)質(zhì)含量。

DN50根際β-葡糖苷酶擴(kuò)散能力規(guī)律和Charleston、DN594類似。兩種土壤中，酶擴(kuò)散寬度均由根基部向根尖逐漸升高，在根尖區(qū)域達(dá)到最大擴(kuò)散寬度，為1.63～1.70 mm。但DN50在低有機(jī)質(zhì)環(huán)境中側(cè)根基部酶活擴(kuò)散寬度大于高有機(jī)質(zhì)土壤；在側(cè)根中部及根尖區(qū)域則相反，高有機(jī)質(zhì)土壤中酶擴(kuò)散寬度較大。

2.4.2 沿根系方向酶活性強(qiáng)弱變化

Charleston主根β-葡糖苷酶活性在高低有機(jī)質(zhì)土壤中均由根基部向根尖逐漸升高，根尖達(dá)到最大值并形成熱點(diǎn)（見表5）。

表5 沿大豆側(cè)根方向β-葡糖苷酶活性強(qiáng)度Table 5 Intensity ofβ-glucosidase activity along the lateral root of soybean（mM·cm-2）

側(cè)根也表現(xiàn)為相同規(guī)律。有機(jī)質(zhì)含量對側(cè)根根際酶活性影響不同。低有機(jī)質(zhì)土壤中側(cè)根的根基部到根尖酶活性強(qiáng)度最高為（5.58±0.13）mM·cm-2，高于高有機(jī)質(zhì)土壤，最高為（4.63±0.25）mM·cm-2。DN594的β-葡糖苷酶在根際酶活性變化規(guī)律和Charleston相似，均從根基部向根尖逐漸升高，在根尖區(qū)域形成熱點(diǎn)。在側(cè)根基部及根尖區(qū)域，高有機(jī)質(zhì)土壤中酶活性強(qiáng)于低有機(jī)質(zhì)土壤，而在側(cè)根中部相反。DN50的β-葡糖苷酶規(guī)律和Charleston、DN594類似，均在根基部活性最弱，根尖形成活性最高熱點(diǎn)區(qū)。但沿DN50側(cè)根方向酶活性強(qiáng)度表現(xiàn)高有機(jī)質(zhì)環(huán)境高于低有機(jī)質(zhì)環(huán)境，且在側(cè)根各部位均有此規(guī)律。綜上所述，不同生長習(xí)性大豆側(cè)根根際的β-葡糖苷酶活性均表現(xiàn)為由根基部向根尖逐漸升高的規(guī)律，但有機(jī)質(zhì)含量對β-葡糖苷酶活性影響存在基因型差異。

3 討 論

3.1 酶活性根際延伸規(guī)律

土壤是農(nóng)作物根系生長載體。根系從土壤中吸收水分及各種礦物質(zhì)元素，供應(yīng)地上部生長。在此過程中，根系細(xì)胞代謝活動向土壤中分泌多種酶類，影響根際微生物菌群種類和豐度。根際微生物直接影響根系吸收土壤中礦物質(zhì)元素能力。因此，研究根系分泌到土壤中酶種類和活性對分析植株地下地上協(xié)同生長具有重要意義。土壤根際酶功能及影響因素逐漸成為國內(nèi)外科學(xué)家研究熱點(diǎn)。針對土壤胞外酶在根際間活性延伸范圍，Razavi等試驗(yàn)證明根際酶活性具有植物物種特異性[22]。其中，玉米根系的酶活性在根系表層部位差異，扁豆則在根際間分布均勻。扁豆與大豆同為直根系作物，卻并未將扁豆劃分主側(cè)根系進(jìn)行討論。本試驗(yàn)以多種大豆品系為對象，劃分大豆直根系主根及主要側(cè)根，細(xì)致研究酶活性。試驗(yàn)結(jié)果體現(xiàn)出，在設(shè)定兩種不同環(huán)境處理間，Charleston主根根際β-葡糖苷酶活性擴(kuò)散延伸寬度，沿主根方向呈先穩(wěn)定隨后在中部區(qū)域變寬，在中后部擴(kuò)散寬度變窄，最后在主根尖端明顯擴(kuò)增。在DN594主根表層及根際間存在的β-葡糖苷酶，其活性延伸寬度在不同環(huán)境間均表現(xiàn)出于主根根部近前端區(qū)段增大，到達(dá)中部區(qū)段變窄，最后在尖端及根尖區(qū)域酶活性擴(kuò)散寬度達(dá)到最大。同時，DN50主根系外部，β-葡糖苷酶活性擴(kuò)散寬度表現(xiàn)為在主根前端增大，至主根中部維持一段較寬范圍，隨之在中后區(qū)段減小，在根尖區(qū)域變?yōu)樽顚挿秶?。說明土壤胞外酶在不同品種大豆主根表面及根際間活性擴(kuò)散寬度沿根系生長方向變化一致。

3.2 沿根系方向酶活性變化

沿大豆主根與側(cè)根胞外酶活性強(qiáng)度并非均勻統(tǒng)一。沿主根方向，在根系中部區(qū)段和根尖端存在酶的高活性區(qū)域；側(cè)根上高酶活性集中于根尖區(qū)段。說明胞外酶活性強(qiáng)度分布與沿根系位置有關(guān)[23]。例如，主側(cè)根均在其尖端部位表現(xiàn)為較高活性，具體可劃分在距離根尖1～2 cm處。根尖高活性酶反應(yīng)可能因根系對分泌物的釋放與滲出集中于根尖[24]，分泌物質(zhì)積累引發(fā)分泌效應(yīng)，刺激微生物活動和SOM分解，促使根尖細(xì)胞外酶產(chǎn)生。因此，根際間胞外酶活性分布可能與根際沉降和根系積累物的質(zhì)量與數(shù)量有關(guān)。由于根滲出物質(zhì)量和組成在根系不同部位均不同[25]，分解根際各類物質(zhì)的酶也隨之變化。因此，反映微生物與根系活躍程度的酶活性強(qiáng)弱分布產(chǎn)生差異。

主根與側(cè)根酶活性強(qiáng)弱分布具有統(tǒng)一性（根尖），也存在區(qū)別。主根上在中部出現(xiàn)酶活性高亮區(qū)域，側(cè)根更集中于尖端。推測不同原因可能有以下兩點(diǎn)：①主根與側(cè)根生長進(jìn)程不同，發(fā)育程度不同，可能與根系內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)；②可能與主側(cè)根生長趨向和位置有關(guān)。由第一點(diǎn)引發(fā)思考，主根是大豆根系最先生長發(fā)育的一條根系，在側(cè)根生成前便已進(jìn)行內(nèi)部結(jié)構(gòu)細(xì)胞群分化。主根中部為根系成熟區(qū)，次生壁集中形成。次生壁是細(xì)胞停止生長后，在初生壁內(nèi)側(cè)繼續(xù)積累的細(xì)胞壁層[26]，主要組分為果膠、纖維素、半纖維素及木質(zhì)素。次生壁形成需合成大量纖維素，纖維素合成及降解過程關(guān)鍵酶之一是β-葡糖苷酶，負(fù)責(zé)催化β-D-葡萄糖苷末端1,4-連接的β-D-葡萄糖殘基水解，調(diào)控纖維素動態(tài)過程。纖維素是自然界中常見多聚糖，β-葡糖苷酶活性提供纖維素降解信息，該酶活性現(xiàn)已得到廣泛評估。因此，在大豆主根中部區(qū)域，β-葡糖苷酶活性高亮反應(yīng)再次展現(xiàn)其與根系結(jié)構(gòu)形成的密切關(guān)系。從根系內(nèi)部結(jié)構(gòu)角度分析，根尖是整條根系中最為活躍部分，根尖中分生組織細(xì)胞不斷分裂更新，為根系生長發(fā)育提供新細(xì)胞，根系對營養(yǎng)和水分吸收及其他重要過程均發(fā)生在這一區(qū)域。因此，根尖處出現(xiàn)β-葡糖苷酶極高活性正是此區(qū)域代謝活動活躍的重要體現(xiàn)。β-葡糖苷酶作為控制纖維素代謝關(guān)鍵酶，是監(jiān)測C循環(huán)重要指標(biāo)。植物通過根部以高分子質(zhì)量和低分子質(zhì)量有機(jī)化合物形式平均向土壤中釋放20%光合碳（C）[27]?；铙w根系持續(xù)向根際中輸入C流積累是土壤中易得有機(jī)物重要來源。在根系表面及根際酶活性熱點(diǎn)區(qū)域，根系將內(nèi)部產(chǎn)物釋放至土壤，選擇并刺激微生物代謝活動，微生物群落受益于根際積累與生境生態(tài)位，對根際分泌各種物質(zhì)及胞外酶產(chǎn)生正向或負(fù)向反饋效應(yīng)[28]。

3.3 根際酶活性品種間差異分析

本試驗(yàn)分析3種不同類型大豆品種土壤酶活性，以沿根系方向酶活性強(qiáng)度為代表，將上述3種大豆對比，結(jié)果顯示，大豆主根系根際酶活性呈顯著規(guī)律。由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可看出（見表2和3），在高低兩種土壤環(huán)境中，Charleston主根方向β-葡糖苷酶活性最高。DN594與DN50差異不同。在低有機(jī)質(zhì)土壤中，DN594主根根際β-葡糖苷酶活性低于DN50；在高有機(jī)質(zhì)土壤中呈相反規(guī)律。因此，土壤胞外酶與植物抗倒伏性可能存在一定關(guān)系?？沟狗暂^強(qiáng)作物在其主根根際酶活性表現(xiàn)較高，可能與主根較為成熟有關(guān)。研究表明，β-葡糖苷酶活性高促進(jìn)纖維素大量合成，增厚根系機(jī)械組織與木質(zhì)化程度，通過提高根系固著力提高抗倒伏性[29]。本研究結(jié)果也表明，不同品種間根系酶活性強(qiáng)度差異明顯（如在低有機(jī)質(zhì)土壤中Charleston主根β-葡糖苷酶活性強(qiáng)度比DN50最多高出0.65 mM·cm-2；比DN594最多高出1.08 mM·cm-2；DN50比DN594最多高出0.43 mM·cm-2），且對地上部生長發(fā)育產(chǎn)生影響?？蓢L試將根際酶活性作為一類用于區(qū)分大豆品種的土壤指標(biāo)，對其他大豆品種作分類，分析地上部和地下部生長協(xié)調(diào)性。本研究選擇3種大豆為代表開展試驗(yàn)，對其他品種區(qū)分效果則有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.4 根際β-葡糖苷酶來源分析

β-葡糖苷酶可將纖維素分解為葡萄糖等易被吸收的糖單體，為根系和微生物提供碳源，是調(diào)控纖維素連續(xù)降解過程關(guān)鍵，其活性和纖維素降解密切相關(guān)。因此，將該酶作為指標(biāo)，可探知植物根系向外部土壤環(huán)境釋放纖維素等含碳化合物的規(guī)律及根系與土壤環(huán)境之間存在何種碳循環(huán)過程。但土壤中微生物也分泌β-葡糖苷酶，需確定試驗(yàn)中所測β-葡糖苷酶來源。利用尼龍膜隔離土壤和大豆根系，本研究結(jié)果表明大豆根系能夠分泌β-葡聚糖酶到根系表面參與根際生命活動。

4 結(jié)論

a.大豆根系表面存在比土壤中酶活性高的區(qū)域，即根際。主根根際酶活性沿根系方向擴(kuò)散寬度與酶活性強(qiáng)度分布一致。

b.β-葡萄糖苷酶活性呈現(xiàn)在不同有機(jī)質(zhì)含量土壤環(huán)境中，沿根系由低到高逐漸增加，到根尖活性最大的分布規(guī)律，在根尖形成酶活性熱點(diǎn)。酶活性最強(qiáng)區(qū)域也是根際向土壤中擴(kuò)散最大區(qū)域。

c.β-葡萄糖苷酶沿側(cè)根方向的根際酶活性呈明顯增加趨勢，擴(kuò)散寬度與酶活性強(qiáng)度分布一致，在側(cè)根根尖區(qū)段形成酶活性熱點(diǎn)。