葛根素抗器官纖維化作用機(jī)制的研究進(jìn)展

張 璋，陳衛(wèi)民，毛 舜，謝賽飛，謝 輝*，郭錦材*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.長沙市口腔醫(yī)院，湖南 長沙 410006）

器官纖維化是多種器官在外界或內(nèi)源性因素刺激下引起成纖維細(xì)胞增殖或表型轉(zhuǎn)化，器官內(nèi)膠原蛋白生成增多。 器官纖維化病因復(fù)雜，是炎癥、氧化應(yīng)激及自身免疫等因素共同作用而形成[1-2]。 器官纖維化常表現(xiàn)為彈性喪失、組織硬化和瘢痕，嚴(yán)重影響患者器官功能，最終可導(dǎo)致器官衰竭[3-4]。 目前，尚無抗纖維化的特異性治療方法，臨床上以糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑為主， 但兩類藥物常伴發(fā)嚴(yán)重的不良反應(yīng)[5]。 天然藥物具有療效好、不良反應(yīng)少等優(yōu)點，因此，從天然植物中提取活性成分用于抗纖維化是當(dāng)前的研究熱點。 研究發(fā)現(xiàn)，葛根素（puerarin, Pue）、姜黃素等天然藥物單體有較好的抗纖維化作用[6-7]。

Pue 是一種異黃酮類物質(zhì)，是中藥葛根主要生物活性成分[8]。 葛根可以用來治療外感頭痛、項背強(qiáng)痛、口渴、消渴等，具有解肌退熱、生津等功效，屬于無毒中藥[9]。Pue 自20 世紀(jì)50 年代被分離鑒定以來，就開始作為異黃酮類植物提取物而使用，對心血管系統(tǒng)等有重要的藥理作用[10]。 現(xiàn)代研究表明，Pue 在抗腫瘤[11]、抗氧化[12]、抑制炎癥[13]等方面有重要作用，可用于治療強(qiáng)直性脊柱炎[14]、糖尿病腎病[15]和心絞痛[16]等疾病。 研究發(fā)現(xiàn)，Pue 及其衍生物有抗纖維化作用[17]。 鄒奧男等[18]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)修飾后的7-O-[3-(4-嗎啉基)丙基]葛根素抗氧化活性顯著增強(qiáng)。 趙波等[19]研究表明，Pue 衍生物7,4’-二丙基葛根素和在堿性條件下合成的4’,7-O-二(N，N-二乙胺基)葛根素比Pue 抗氧化作用更強(qiáng)。 Pue 在引入糖基后得到葡萄糖苷衍生物，其抗腫瘤活性明顯提高[20]。本文從Pue 抗心臟纖維化、肝纖維化、肺纖維化、腎纖維化、子宮纖維化作用機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，總結(jié)其在抗器官纖維化中的機(jī)制，為深入研究Pue 抗纖維化的具體機(jī)制及臨床應(yīng)用提供參考。

1 Pue 抗心臟纖維化及其機(jī)制

心肌纖維化是多種心血管疾病發(fā)病過程中導(dǎo)致心力衰竭的重要病理過程。體內(nèi)外實驗證實，Pue 可作用于不同信號通路，減輕心肌纖維化。

蔡少艾[21]通過建立大鼠心臟纖維化模型，用Pue干預(yù)治療6 周后，核轉(zhuǎn)錄因子紅系2 相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2, Nrf2）表達(dá)增加，并向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，與UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1（UDP-glucuronosyltransferase 1A1, UGT1A1）的啟動子結(jié)合，UGT1A1 表達(dá)上調(diào)，活性氧(reactive oxygen species, ROS)減少，Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維表達(dá)減少，提示Pue 可減少大鼠心臟膠原的沉積，從而逆轉(zhuǎn)大鼠心臟纖維化。 CAI 等[22]通過將Pue 和血管緊張素Ⅱ干預(yù)心臟成纖維細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，ROS 減少，Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1 減少，Nrf2 進(jìn)一步增加，Nrf2通過上調(diào)UGT1A1，抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的p38 促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）磷酸化，膠原蛋白表達(dá)減少，用特異的Nrf2 干擾小RNA 或Nrf2 抑制劑戊二醇抑制Nrf2 可減弱Pue 抗纖維化和抗氧化作用。 上述結(jié)果表明，Pue 通過激活Nrf2/ROS 通路，抑制心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts, CFs）的膠原蛋白表達(dá)和ROS 生成，以達(dá)到抗心臟纖維化作用。

王子寬等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚模型中，與主動脈弓縮窄術(shù)組相比，Pue 聯(lián)合主動脈弓縮窄術(shù)處理后，左室射血分?jǐn)?shù)和左心室短軸縮短率顯著提高，腦鈉肽和β-肌球蛋白重鏈的mRNA均下降，下調(diào)血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和白介素-1β（interleukin-1β, IL-1β），上調(diào)Sirtl 蛋白水平，降低心肌細(xì)胞纖維化程度，提示Pue 可抑制心臟炎癥反應(yīng)和纖維化[23]。Pue 還可下調(diào)心肌轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）蛋白表達(dá)，從而改善心臟纖維化[24]。CHEN 等[25]通過皮下注射異丙腎上腺素建立小鼠心肌纖維化模型，Pue 干預(yù)后降低TGF-β1和核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）表達(dá)，減輕心肌組織膠原堆積，其機(jī)制可能為Pue 通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體α/γ， 降低TGF-β1的表達(dá)，抑制NF-κB，從而抑制小鼠心肌纖維化。 上述動物實驗發(fā)現(xiàn)，Pue 可改善心臟纖維化。 Pue 有抗心臟纖維化作用，NI 等[17]采用橫主動脈縮窄術(shù)建立心肌纖維化大鼠模型，從而分離得到原代CFs，發(fā)現(xiàn)脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）誘導(dǎo)CFs 可上調(diào)多腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（poly ADP-ribose polymerase-1, PARP-1）、高速泳動族蛋白B1（high-mobility group protein B1, HMGB1）、炎性細(xì)胞因子、α-平滑肌細(xì)胞肌動蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白，而Pue 可以減弱LPS 誘導(dǎo)的心肌纖維化，降低PARP-1表達(dá)，從而使HMGB1 表達(dá)降低，改善心肌纖維化，進(jìn)一步提示在細(xì)胞實驗研究基礎(chǔ)上，Pue 有抗心臟纖維化作用，其可能機(jī)制為Pue 通過調(diào)節(jié)HMGB1 介導(dǎo)的Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4, TLR4）-NF-κB 信號通路，改善心肌纖維化。

LI 等[26]通過H2O2誘導(dǎo)人冠狀動脈內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial-mesenchymal transition, EndMT），Pue干預(yù)后，減少血管內(nèi)皮鈣黏蛋白和分化簇31 表達(dá)，抑制α-SMA 和成纖維細(xì)胞蛋白-1 上調(diào)，緩解H2O2誘導(dǎo)的EndMT，其機(jī)制可能為Pue 抑制ROS 產(chǎn)生，激活磷脂酰肌醇3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase, PI3K）和絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase, AKT）通路，進(jìn)一步減少EndMT，起到抗心臟纖維化作用。

綜上所述，Pue 可通過激活Nrf2/ROS 通路、調(diào)節(jié)HMGB1 介導(dǎo)的TLR4-NF-κB 信號通路及抑制ROS 激活PI3K/AKT 通路等，起到抗心臟纖維化作用。

2 Pue 抗肝纖維化作用及其機(jī)制

肝纖維化是一個復(fù)雜的病理過程，是肝臟在遭受慢性損傷后，傷口持續(xù)愈合的病理生理過程，是肝硬化的早期階段，最終可發(fā)展為肝細(xì)胞癌。 研究表明，Pue 有抗肝纖維化作用。

譚越峰等[27]研究表明，水飛薊和葛根復(fù)合物對大鼠酒精性肝纖維化具有改善作用，水飛薊和葛根復(fù)合物處理后，膠原沉積減少，肝組織損傷得到改善。 王靜等[28]通過甘草葛根發(fā)酵組合物處理CCl4所致的大鼠慢性肝損傷模型后，與生理鹽水組相比，TGFβ1、脯氨酸肽酶、透明質(zhì)酸（hyaluronic acid, HA）均降低，提示甘草葛根發(fā)酵組合物對CCl4所致的大鼠慢性肝損傷模型有抗肝纖維化作用。

在葛根復(fù)合物的基礎(chǔ)上，馬婷等[29]研究發(fā)現(xiàn)，Pue 具有緩解酒精性肝纖維化的作用，Pue 干預(yù)后可減少CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織中膠原沉積，肝小葉結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)，同時對肝組織具有保護(hù)作用，減少白介素-6（interleukin-6, IL-6）、TNF-α 等炎癥因子損傷。在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化研究中，Pue對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化有保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過抑制PARP-1 的表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB 和減少ROS 產(chǎn)生，達(dá)到抗肝纖維化作用[30]。WANG 等[31]在類似CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的動物實驗研究中，Pue 對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化有抑制作用，降低α-SMA、TGFβ1、結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor, CTGF）及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)，其機(jī)制可能是通過抑制PARP-1 表達(dá)，從而抑制NF-κB 表達(dá)和ROS產(chǎn)生，從而達(dá)到抗肝纖維化作用。

學(xué)者們對Pue 抗肝纖維化的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。 LI 等[32]在肝纖維化大鼠模型的研究中，用Pue干預(yù)后，肝纖維化大鼠的TNF-α、NF-κB 表達(dá)明顯下調(diào)，TGF-β1 生成減少，Ⅰ型膠原減少，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal regulated kinase,ERK1/2）的相對蛋白表達(dá)量下調(diào)，膠原纖維含量顯著減少，成功地逆轉(zhuǎn)了大鼠的肝纖維化，機(jī)制可能為Pue 降低星狀細(xì)胞活化，減輕細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)水平，抑制TGF-β1/ERK1/2 通路。 XU 等[33]通過Pue 對二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Pue 處理后血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、HA、層粘連蛋白、Ⅲ型前膠原蛋白、Ⅳ型膠原蛋白水平顯著降低，肝臟勻漿中羥脯氨酸和Ⅰ型膠原含量降低。 Masson 三色染色顯示二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維化減輕，同時TGF-βl、Smad2、Smad3和α-SMA 在Pue 處理后特異性下調(diào)，Smad7 上調(diào)，由此發(fā)現(xiàn)，Pue 通過調(diào)節(jié)TGF-βl/Smad 通路，從而阻斷肝纖維化進(jìn)程。 董哲文等[34]研究發(fā)現(xiàn)，Pue 干預(yù)肝癌細(xì)胞的模型中，25、50、100 μmol/L Pue 可增加氧化物酶體增殖物激活受體-γ 的表達(dá)，下調(diào)TGF-β1和NF-κB p65 的表達(dá)，減輕肝纖維化，其可能機(jī)制為激活過氧化物酶體增殖物激活受體-α/γ，抑制NF-κB和TGF-β1 信號通路，起到抗肝纖維化的作用。

綜上所述，Pue 可通過抑制TGF-β1/ERK1/2 通路、調(diào)節(jié)TGF-βl/Smad 通路及抑制NF-κB 和TGFβ 信號通路，起到抗肝纖維化的作用。

3 Pue 抗肺纖維化作用及其機(jī)制

肺纖維化是一種以慢性進(jìn)行性肺實質(zhì)損害為主要特征的疾病，嚴(yán)重破壞肺的功能和結(jié)構(gòu)，其具有致命性。 研究發(fā)現(xiàn)，Pue 具有抗肺纖維化作用。

周帥等[35]對Pue 抗肺纖維化作用進(jìn)行了研究，通過建立缺氧性肺動脈高壓模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pue干預(yù)后與模型組相比，上調(diào)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶和總抗氧化能力水平，下調(diào)丙二醛（malondialdehyde, MDA），Jagged-1、Notch-3、Hes-5 表達(dá)降低，膠原纖維沉積減輕，顯著改善肺纖維化。 丁大力等[7]發(fā)現(xiàn)，通過Pue 處理博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺間質(zhì)纖維化模型，SOD 含量升高，MDA 含量降低，Pue 可減輕大鼠肺纖維化程度，其機(jī)制可能為Pue 增強(qiáng)SOD活力，降低MDA 含量，從而減輕炎癥及纖維化程度。

在此基礎(chǔ)上，HU 等[36]將不同濃度Pue 處理患急性呼吸窘迫綜合征的嬰幼兒肺成纖維細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pue 促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞凋亡，同時抑制肺成纖維細(xì)胞增殖和TGF-β1 的表達(dá)，上調(diào)Caspase3 表達(dá)，下調(diào)Bcl-2、TGF-β1 和Smad3 表達(dá)，抑制TGF-β1/Smad3 通路可降低急性呼吸窘迫綜合征肺纖維化的炎癥反應(yīng)。 HASAN 等[37]通過Pue 對百草枯（paraquat,PQ）誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Pue 可通過抑制CTGF、TGF-β1、血管內(nèi)皮生長因子、Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白，同時上調(diào)NF-κB、Nrf2 和α-SMA的表達(dá)，提高血紅素氧合酶-1、SOD 和谷胱甘肽的水平，Pue 通過抑制miR-21 的表達(dá)，阻斷PQ 誘導(dǎo)的卵泡抑素樣蛋白1（follistatin like 1, Fstl1）通路和氧化應(yīng)激，改善肺纖維化程度。 XUE 等[38]通過體內(nèi)外實驗研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA 和Pue 聯(lián)合治療特發(fā)性肺纖維化可抑制TGF-β1 或IL-6 通過JAK2-STAT3/STAT1 信號通路誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的活化和遷移，這表明丹參酮ⅡA 和Pue 可能通過減少炎癥反應(yīng)起到抗肺纖維化作用。

綜上所述，Pue 可通過抑制TGF-β1/Smad3 通路、阻斷Fstl1 通路起到抗肺纖維化作用。 Pue 與丹參酮ⅡA 聯(lián)合應(yīng)用也可通過JAK2-STAT3/STAT1 信號通路誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的活化和遷移，達(dá)到抗肺纖維化作用。

4 Pue 抗腎纖維化作用及其機(jī)制

腎纖維化是慢性腎病發(fā)展為終末期腎病的常見病理特征。 研究發(fā)現(xiàn)，Pue 有抗腎臟纖維化作用。

董小君等[39]對Pue 抗腎纖維化作用進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Pue 可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress, ERS）通路，防止細(xì)胞凋亡，預(yù)防腎纖維化的發(fā)生。在類似的腎纖維化小鼠模型研究中，H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激激活了上皮細(xì)胞凋亡和MAPK，而Pue 能逆轉(zhuǎn)這一變化，降低NOX4 含量，改善腎纖維化，其可能機(jī)制為Pue 通過MAPK 信號通路抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞凋亡[40]。WANG 等[41]通過Pue對單側(cè)輸尿管梗阻介導(dǎo)的腎損傷研究發(fā)現(xiàn)，Pue 可抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、 單核細(xì)胞趨化因子蛋白-1、細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白、α-SMA、Ⅰ型膠原和波形蛋白的表達(dá)，在Pue 作用下，纖維化通路TGFβ1、Smad3 和炎癥通路NF-κB p65、STAT3 的表達(dá)均受到不同程度的抑制，而Smad7 表達(dá)上調(diào)，結(jié)果表明，Pue 可通過調(diào)控NF-κBp65/STAT3 和TGFβ1/Smads 通路抑制炎癥因子的生成，逆轉(zhuǎn)小管損傷和小管間質(zhì)纖維化。

綜上所述，Pue 可通過抑制ERS 通路、調(diào)節(jié)MAPK信號通路及調(diào)控NF-κBp65/STAT3 和TGFβ1/Smads通路抗腎纖維化。

5 Pue 抗子宮纖維化作用及其機(jī)制

缺血-再灌注損傷是引起子宮纖維化，并使其功能障礙的重要原因。 LIN 等[42]通過缺血-再灌注損傷制備子宮纖維化大鼠模型，Pue 作用于Wnt/β-catenin通路，下調(diào)肥大細(xì)胞乳酶、TGF-β1 和α-SMA 的表達(dá)，進(jìn)而改善缺血-再灌注損傷誘導(dǎo)的子宮纖維化。

Pue 抗纖維化作用體內(nèi)實驗見表1，Pue 抗纖維化作用體外實驗見表2。

表1 Pue 抗纖維化作用體內(nèi)實驗

表2 Pue 抗纖維化作用體外實驗

6 結(jié)語

綜上所述，體內(nèi)外實驗研究表明Pue 有抗心臟纖維化、肝纖維化、肺纖維化、腎纖維化、子宮纖維化等作用。 降低炎性因子表達(dá)、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、抑制膠原蛋白表達(dá)及阻斷膠原纖維異常沉積，是Pue 抗器官纖維化的主要作用機(jī)制。 Pue 抗心臟纖維化的主要分子機(jī)制是激活Nrf2/ROS 通路、調(diào)節(jié)HMGB1 介導(dǎo)的TLR4-NF-κB 通路及抑制ROS 激活PI3K/AKT 通路；Pue 抗肝纖維化的主要分子機(jī)制是抑制TGF-β1/EKK1/2 通路、調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad7 通路；Pue 抗肺纖維化的主要分子機(jī)制是抑制TGF-β1/Smad3 通路、阻斷PQ 誘導(dǎo)的Fstl1 通路、抑制TGFβ1 或IL-6 介導(dǎo)的JAK-2-STAT3/STAT1 通路；Pue抗腎纖維化的主要分子機(jī)制是通過MAPK 信號通路抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞凋亡、抑制ERS通路、調(diào)控NF-κBp65/STAT3 和TGF-β1/Smads 通路；Pue 抗子宮纖維化的主要機(jī)制是抑制Wnt/βcatenin 通 路。 Pue 主 要 作 用 于TGF-β1、NF-κB、Nrf2/ROS 等信號通路起到抗纖維化作用，故TGFβ1、NF-κB、Nrf2/ROS 等是開發(fā)抗纖維化新藥的主要靶點。目前，Pue 抗纖維化的研究多為動物實驗和細(xì)胞實驗，且這些研究未通過基因敲除、過表達(dá)等驗證其靶點和結(jié)合位點。 后期需進(jìn)一步完善實驗驗證其特異性靶點，且需進(jìn)行臨床試驗，以便后期在臨床中應(yīng)用。 此外，Pue 有蛋白結(jié)合率高、毒性低等優(yōu)點，但其半衰期短、體內(nèi)消除快、與靶點結(jié)合時間短，因此，對Pue 進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，提高其藥效和生物利用度是后期開發(fā)抗纖維化新藥的一個研究方向。