健脾消癌方調(diào)控巨噬細(xì)胞M2 極化對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲作用的研究

陳 娟，徐琳本，蔣益蘭，翦林宏，曾宏亮，譚小寧*

（湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410006）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer, CRC）是最常見的惡性腫瘤之一，在全球所有惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率中分別位居第3 位和第2 位[1]。研究表明，40%～50%的患者在診斷初期即發(fā)現(xiàn)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中無轉(zhuǎn)移者5 年生存率接近90%，而已轉(zhuǎn)移者5 年生存率僅為10%[1]。 腫瘤微環(huán)境是腫瘤的生存場(chǎng)所，具有低氧、低pH、炎癥、乳酸堆積等特點(diǎn)，在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵作用[2]。 在腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞被稱作腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophages,TAM），TAM 數(shù)量和分型變化與CRC 的發(fā)生發(fā)展和臨床治療密切相關(guān)[3]。 研究證實(shí)，M2 型巨噬細(xì)胞不但能發(fā)揮免疫抑制作用，還能促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中的血管生成和基質(zhì)重塑等，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[4]。

健脾消癌方是湖南省名中醫(yī)蔣益蘭教授根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)知識(shí)，根據(jù)CRC“脾氣虧虛、瘀毒內(nèi)結(jié)”的病機(jī)特點(diǎn)，以扶正祛邪為原則，以健脾益氣、化瘀解毒為治法而創(chuàng)立，具有顯著的臨床療效[5-6]。 本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，以TAM 作為研究對(duì)象，在體外通過將巨噬細(xì)胞與人CRC 細(xì)胞HCT116共培養(yǎng)的方法來模擬CRC 免疫微環(huán)境，探索健脾消癌方拮抗CRC 轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人CRC 細(xì)胞HCT116 購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，目錄號(hào)TCHu 99；人單核巨噬細(xì)胞THP-1購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，目錄號(hào)：TCHu 57。

1.2 藥物

健脾消癌方組成：人參15 g，茯苓15 g，薏苡仁30 g，淫羊藿15 g，白花蛇舌草30 g，石見穿30 g，莪術(shù)10 g，郁金15 g，炒枳殼6 g。 選用一級(jí)藥材，按生藥量加入10 倍水，煎煮1 h，保存藥液；藥渣再加入8 倍量水，煎煮1 h；合并藥液，濃縮成近2 倍水量時(shí)，放置過夜，去沉淀，繼續(xù)濃縮成1.5 g 生藥/mL備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD 大鼠20 只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：43072721110275225，飼養(yǎng)于湖南省中醫(yī)藥研究院屏障環(huán)境，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2020-0008。 飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～26 ℃、相對(duì)濕度50%～70%、12 h/12 h 光暗交替。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施（倫理審查編號(hào)：2021-0008），所有實(shí)驗(yàn)操作均按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。

1.4 主要試劑

RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司，批號(hào)：AD21356769）；胎牛血清（美國Gibco 公司，批號(hào)：2148169CP）；白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4）（美國PeproTech 公司，批號(hào)：200-04-5）；CD14、CD163流式抗體（美國eBioscience 公司，批號(hào)：12-0149-41、25-1639-41）；E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase，MMP-9）、β-actin 抗體（美國Proteintech公司，批號(hào)：00018701、00096022、573145、10004156）；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR 試劑盒（日本Takara 公司，批號(hào)：RR047A、RR820A）；ECL 發(fā)光液（美國Thermo 公司，批號(hào)：SF249787B）。

1.5 主要設(shè)備

化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（英國Syngene 公司，型號(hào)G:BOX ChemiXRQ）；熒光正置顯微鏡（德國Leica 公司，型號(hào)：DM4000）；微量核酸蛋白濃度分析儀（英國BioDrop 公司，型號(hào)：BioDrop Duo）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad，型號(hào)：powerpac、Mini Trans-Blot C）；熒光定量PCR 儀（美國Roche 公司，型號(hào)：FAST480Ⅱ）。

2 方法

2.1 健脾消癌方含藥血清制備

SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分為給藥組（12 只）和對(duì)照組（8 只）。 按體表面積法進(jìn)行大鼠等效劑量換算，給藥組大鼠按14.9 g/kg 灌胃給予健脾消癌方水煎液，1 次/d，灌胃前空腹12 h，連續(xù)1 周；對(duì)照組大鼠按15 mL/kg 灌胃給予生理鹽水。于第7天末次灌胃1 h 后腹主動(dòng)脈采血，所采血液以2000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，吸取上清液即血清，合并同組血清，用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后，無菌試管分裝，放置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

人單核巨噬細(xì)胞THP-1 為懸浮生長細(xì)胞，培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基；人CRC 細(xì)胞HCT116 貼壁生長于含10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基中。 細(xì)胞均在37 ℃及含有5% CO2環(huán)境的飽和濕度箱中培養(yǎng)。M0 型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)：將人單核巨噬細(xì)胞THP-1 用佛波酯（50 ng/mL）處理24 h 后，細(xì)胞貼壁生長，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD14 蛋白。 IL-4（10 ng/mL）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M0 型極化為M2 型，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)標(biāo)志物CD163 蛋白。

共培養(yǎng)體系建立：利用Transwell 小室建立非接觸的細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)，取佛波酯處理24 h 的對(duì)數(shù)生長期的THP-1 巨噬細(xì)胞，使用胰酶消化制成細(xì)胞密度為2×106/mL 的單細(xì)胞懸液，每孔約500 μL 接種于Transwell 小室內(nèi)底面，每孔補(bǔ)足培養(yǎng)基至2 mL。取生長狀態(tài)良好的HCT116 細(xì)胞，胰酶消化制成細(xì)胞密度為5×105/孔，接種于上室。

實(shí)驗(yàn)分組：空白血清對(duì)照組（加10%空白血清處理）；健脾消癌方含藥血清組（加10%含藥血清處理）；IL-4+空白血清組（加10 ng/mL IL-4 和10%空白血清處理）；IL-4+健脾消癌方含藥血清組（加10 ng/mL IL-4 和10%含藥血清處理）。 各組處理48 h 后進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞狀態(tài)

用胰酶消化佛波酯誘導(dǎo)的THP-1 細(xì)胞和IL-4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M0 型細(xì)胞，3000 r/min，離心半徑10 cm，離心3 min，小心吸取上清液，收集細(xì)胞，用PBS 清洗2 次后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照1×107/mL 的濃度用PBS（含1% BSA）重懸細(xì)胞。 待細(xì)胞充分混勻后，于每個(gè)流式管內(nèi)加入100 μL 混懸液，并分別加入具有熒光素偶聯(lián)的CD14、CD163 流式抗體5 μL，混勻后，室溫下避光孵育30 min，PBS 清洗2 次后，加入500 μL 的PBS（含1% BSA）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸，經(jīng)過濾后上機(jī)。

2.4 RT-PCR 法檢測(cè)Arg-1、CCL22 在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)

收集各組巨噬細(xì)胞，提取總RNA，BCA 法測(cè)定濃度，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行RNA 反轉(zhuǎn)錄cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃、30 min，85 ℃、20 s。然后以cDNA 為 模 板，GAPDH 為 內(nèi) 參 基 因，SYBR Green PCR 試劑盒擴(kuò)增Arg-1、CCL22，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，目的基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt計(jì)算。 基因引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

2.5 Transwell 法檢測(cè)HCT116 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力

Matrigel 膠與無血清培養(yǎng)基按1∶2 稀釋后，每個(gè)小室鋪膠60 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)60 min，使膠凝固制備Transwell 小室，然后每個(gè)小室加70 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37 ℃、30 min 水化基底膜。 將各組HCT116 細(xì)胞用無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含5 g/L BSA）制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，吸取100 μL加入到小室上室內(nèi)，下室加入佛波酯處理24 h 的對(duì)數(shù)生長期的THP-1 巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。 取出上室，放到裝有PBS 的新孔中，上室PBS 洗3 遍，用棉球擦干凈上室細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定20 min，將膜取下。 0.1%結(jié)晶紫染色5 min，水洗5 次，置膜于載玻片上，顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 Western blot 法檢測(cè)HCT116 細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin、MMP-9 表達(dá)

收集各組HCT116 細(xì)胞，加200 μL RIPA 裂解液和1% PMSF 提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法蛋白定量后上樣SDS-PAGE 電泳，PVDF 轉(zhuǎn)膜，5% BSA 封閉60 min，剪取對(duì)應(yīng)蛋白條帶分別加入E-cadheri（稀釋比例1∶2000）、Vimentin（稀釋比例1∶2000）、MMP-9（稀釋比例1∶1000）和β-actin（稀釋比例1∶2500）一抗，4 ℃孵育過夜，TBS-T 洗3 次，將稀釋后的二抗（用封閉液稀釋HRP 標(biāo)記的二抗，稀釋比例1∶5000）與膜共同孵育2 h，TBS-T 洗3 次×5 min，ECL 顯影。 將各條帶用Image J 軟件進(jìn)行灰度掃描并以βactin 為內(nèi)參計(jì)算各組平均值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)與極化

人單核巨噬細(xì)胞THP-1 形態(tài)飽滿，大小均一，為單獨(dú)生長的懸浮細(xì)胞（圖1A），采用佛波酯刺激THP-1 細(xì)胞24 h 后，光鏡下觀察到大部分細(xì)胞仍呈圓形或橢圓形，但細(xì)胞大小較誘導(dǎo)前縮小，貼壁較緊（圖1B）。CD14 作為人巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記物，用以檢測(cè)單核巨噬細(xì)胞的分化效率。據(jù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果可知，佛波酯處理后的細(xì)胞促進(jìn)CD14的蛋白表達(dá)(圖1C、1D)，說明THP-1 細(xì)胞被成功誘導(dǎo)成M0 型巨噬細(xì)胞。 IL-4 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M0（見圖2A）極化為M2 型（流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)標(biāo)志物CD163），光鏡下觀察到大部分細(xì)胞仍呈橢圓形，貼壁較緊，且易成團(tuán)生長（圖2B）。 據(jù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果可知，IL-4 處理后的細(xì)胞CD163 蛋白表達(dá)升高（圖2C、1D），說明IL-4 能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M0 型極化成M2型。

圖1 THP-1 細(xì)胞誘導(dǎo)成M0 型巨噬細(xì)胞

圖2 巨噬細(xì)胞M0 型極化為巨噬細(xì)胞M2 型

3.2 健脾消癌方對(duì)巨噬細(xì)胞中CCL22、Arg-1 mRNA 表達(dá)的影響

與空白血清對(duì)照組比較，健脾消癌方含藥血清組CCL22、Arg-1 表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；IL-4+空白血清組及IL-4+健脾消癌方含藥血清組CCL22、Arg-1 表達(dá)水平顯著增加（P<0.01）。 與IL-4+空白血清組比較，IL-4+健脾消癌方含藥血清組CCL22、Arg-1 表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。 詳見圖3。

圖3 各組巨噬細(xì)胞中Arg-1、CCL22 mRNA 表達(dá)

3.3 健脾消癌方對(duì)HCT116 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

Transwell 小室穿膜細(xì)胞的數(shù)量反映腫瘤細(xì)胞的體外侵襲轉(zhuǎn)移能力。與空白血清對(duì)照組比較，健脾消癌方含藥血清組及IL-4+健脾消癌方含藥血清組HCT116 細(xì)胞的侵襲數(shù)量明顯減少（P<0.01）；L-4+空白血清組細(xì)胞共培養(yǎng)體系中HCT116 細(xì)胞的侵襲數(shù)量顯著增加（P<0.01）。與IL-4+空白血清組比較，IL-4+健脾消癌方含藥血清組HCT116 細(xì)胞的侵襲數(shù)量降低（P<0.01）。 詳見圖4。

圖4 各組HCT116 細(xì)胞侵襲數(shù)量

3.4 健脾消癌方對(duì)HCT116 細(xì)胞E-cadherin、Vimentin、MMP-9 蛋白表達(dá)的影響

與空白血清對(duì)照組比較，健脾消癌方含藥血清組HCT116 細(xì)胞中Vimentin 蛋白表達(dá)降低，而Ecadherin 蛋白表達(dá)升高（P<0.05）；L-4+空白血清組及IL-4+健脾消癌方含藥血清組HCT116 細(xì)胞中Vimentin、MMP-9 蛋白表達(dá)增加，而E-cadherin 蛋白表達(dá)降低（P<0.01）。 與IL-4+空白血清組比較，IL-4+健脾消癌方含藥血清組HCT116 細(xì)胞E-cadherin 蛋白表達(dá)升高，Vimentin、MMP-9 蛋白表達(dá)降低（P<0.05）。詳見圖5。

圖5 各組HCT116 細(xì)胞E-cadherin、Vimentin、MMP-9 蛋白表達(dá)

4 討論

目前，CRC 仍然是嚴(yán)重危害全球的公共健康難題，其發(fā)病率和死亡率均位居癌癥前三[1]。從臨床來看，腫瘤細(xì)胞往往通過營造獨(dú)特的腫瘤微環(huán)境來逃避免疫監(jiān)視[7]。 腫瘤微環(huán)境中高乳酸、缺氧等可以促進(jìn)TAM 的浸潤或募集，TAM 能夠整合腫瘤微環(huán)境中的不同信號(hào)形成兩種相反的極化狀態(tài)，不同極化類型的巨噬細(xì)胞能夠表達(dá)不同的細(xì)胞因子、酶類以及細(xì)胞表面標(biāo)志物。 根據(jù)功能和表型的不同，巨噬細(xì)胞大致可分為M1 型和M2 型兩類[8]。

M2 型巨噬細(xì)胞能抑制局部免疫，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸和進(jìn)展。 GORDON 等[9]發(fā)現(xiàn)，在人類CRC 中，M2 型巨噬細(xì)胞可以高表達(dá)PD-1，而PD-1 抑制了T細(xì)胞的抗腫瘤功能和巨噬細(xì)胞的吞噬功能，發(fā)揮免疫抑制作用，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。 M2 型巨噬細(xì)胞不但能導(dǎo)致免疫抑制，還能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[10]。研究證實(shí)，結(jié)腸癌中M2 型巨噬細(xì)胞可以通過釋放各種趨化因子、促炎因子和生長因子來促進(jìn)轉(zhuǎn)移[11]。WAHAB 等[12]認(rèn)為，CRC 微環(huán)境中大量浸潤的巨噬細(xì)胞在IL-4、IL-13 等多種因子誘導(dǎo)作用下分化為M2 型的TAM，若可以阻斷相關(guān)因子，將有助于免疫治療取得成功。

中醫(yī)藥防治腫瘤具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，中醫(yī)藥能夠系統(tǒng)調(diào)控機(jī)體，抗腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，減少手術(shù)并發(fā)癥，減輕放射治療（簡(jiǎn)稱“放療”）、化學(xué)藥物治療（簡(jiǎn)稱“化療”）、分子靶向治療等所致毒副反應(yīng)，發(fā)揮協(xié)同增敏作用，改善腫瘤患者臨床癥狀，提高生存質(zhì)量，延長生存期，從而提高臨床獲益率[13-15]。 蔣益蘭教授經(jīng)過長期臨床實(shí)踐，凝練總結(jié)出CRC 主要由“脾虛、瘀積、巖毒”所致[16]。正氣虧虛是大腸癌發(fā)病的內(nèi)因，而脾為“后天之本”“氣血生化之源”，脾虛則腸癌“留著于脈，稽留而不去，息而成積”，是CRC 的“病復(fù)”（復(fù)發(fā)）和“傳舍”（轉(zhuǎn)移）的病機(jī)主線。 蔣益蘭教授以“健脾益氣，化瘀解毒”為防治CRC 術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的基本治法，擬定防治CRC 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的經(jīng)驗(yàn)方健脾消癌方。 加之手術(shù)創(chuàng)傷、放療、化療導(dǎo)致的損傷等影響，CRC 患者多會(huì)出現(xiàn)CD4+、CD8+、CD4+/CD8+及免疫球蛋白水平下降[17]，細(xì)胞免疫功能降低，免疫調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂，免疫抑制占優(yōu)勢(shì)，消化道局部免疫功能低下[18]。 本研究以CRC 腫瘤微環(huán)境為切入點(diǎn)，探討健脾消癌方對(duì)TAM 極化的調(diào)控作用，為健脾抗癌中藥的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

臨床研究顯示，健脾消癌方聯(lián)合化療，治療晚期轉(zhuǎn)移性CRC 可提高患者疾病控制率，延長晚期CRC 患者的無進(jìn)展生存期和總生存期，并能減輕化療所致不良反應(yīng)、提高患者生活質(zhì)量、有效降低腫瘤標(biāo)志物[5-6]。 前期實(shí)驗(yàn)研究表明，健脾消癌方可有效拮抗CRC 轉(zhuǎn)移[19-24]。 本研究通過Transwell 法構(gòu)建HCT116 細(xì)胞與M0 型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系，探討健脾消癌方調(diào)控巨噬細(xì)胞M2 極化對(duì)HCT116 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。 研究結(jié)果顯示，M2 型巨噬細(xì)胞能夠通過下調(diào)HCT116 細(xì)胞E-cadherin 表達(dá)，上調(diào)Vimentin、MMP-9 表達(dá)而促進(jìn)HCT116 細(xì)胞侵襲數(shù)量，健脾消癌方能下調(diào)巨噬細(xì)胞M2 型極化相關(guān)基因CCL22、Arg-1 表達(dá)，上調(diào)HCT116 細(xì)胞E-cadherin表達(dá)，下調(diào)Vimentin 表達(dá)，抑制HCT116 細(xì)胞侵襲數(shù)量，表明健脾消癌方能一定程度上抑制巨噬細(xì)胞M2極化，阻斷HCT116 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，而抑制CRC 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。本研究為健脾消癌方拮抗CRC 提供進(jìn)一步的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。關(guān)于健脾消癌方如何抑制巨噬細(xì)胞M2 極化需要進(jìn)行下一步調(diào)控機(jī)制的深入研究。