燈心草煅炭前后UPLC指紋圖譜研究及菲類成分含量測定△

趙夢輝，鞠成國，2*，王巍，孟則敬，賈天柱，2

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；

2.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600

燈心草為燈心草科植物燈心草Juncus effususL.的干燥莖髓，具有清心火、利小便的作用，用于心煩失眠、尿少澀痛、口舌生瘡[1]，煅炭后具有止血作用[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，燈心草具有抗炎、抗氧化、降血壓、抗焦慮、鎮(zhèn)靜等作用[3-7]。燈心草提取物中發(fā)現(xiàn)多種菲類化合物，以9,10-二氫菲及二聚體菲類化合物為主。菲類成分具有聯(lián)苯骨架結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是植物燈心草的分類特征成分[4]，其中以去氫厄弗酚、厄弗酚、燈心草酚3 個成分含量最高[8]。中藥普遍存在道地性，不同產(chǎn)地的燈心草質(zhì)量各異。色譜指紋圖譜技術(shù)從中藥整體入手，以色譜特征峰構(gòu)成該藥材特有的色譜指紋圖譜全貌，可為藥材質(zhì)量分析與控制提供參考[8]。

1 材料

1.1 儀器

H-Class 型超高效液相色譜儀（包括QSM 型四元高壓梯度泵、FTN 型樣品管理器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Empower 2數(shù)據(jù)處理工作站，Waters公司）；AE240 型十萬分之一電子分析天平（Mettler-Toledo 公司）；FA1004B 型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Milli-Q Integral 型純水儀（Millipore 公司）；KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DFT-100 型高速萬能粉碎機(jī)（浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司）。

1.2 試藥

對照品去氫厄弗酚（批號：MB13634）、厄弗酚（批號：MB13633）、燈心草酚（批號：MB13637）均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度均大于98%；甲醇為色譜純；無水乙醇為分析純；水為超純水。

10 批燈心草經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定室王添敏教授鑒定為燈心草科植物燈心草Juncus effususL.的干燥莖髓。生品樣品編號為S1～S10，炭品樣品編號為T1～T10，樣品信息見表1。燈心炭的制備：按本課題組前期優(yōu)選的最佳工藝（控制投藥質(zhì)量與容器容積比為3 g·L-1，250 ℃密閉煅制15 min，待冷后取出）制得。

表1 燈心草樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 燈心草炮制前后指紋圖譜

2.1.1 色譜條件 ACQUITY UHPLC HSS-T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～5 min，3%～30%A；5～6 min，30%～35%A；6～7 min，35%～40%A；7～20 min，40%～100%A）；柱溫為27 ℃；檢測波長為265 nm；流速為0.2 mL·min-1；樣品室溫度為10 ℃；分析時間為20 min；進(jìn)樣量為1.0 μL，理論板數(shù)按燈心草酚計算應(yīng)不低于3000[9]。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取去氫厄弗酚、厄弗酚、燈心草酚對照品，加甲醇完全溶解，制得質(zhì)量濃度分別為68.35、81.60、82.41 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 取燈心草粉末（過四號篩）約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（250 W，40 kHz）處理30 min，取出，放冷，再次稱定質(zhì)量，以95%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，定量濾紙濾過，取續(xù)濾液，用0.22 μm微濾膜濾至進(jìn)樣小瓶，即得。

2.1.4 精密度試驗 取供試品（S10、T10）溶液，按照2.1.1項下的色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定生品各個共有峰相對保留時間的RSD 為0.02%～0.83%，測定炭品各個共有峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.67%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取供試品（S10、T10）溶液，按照2.1.1 項下的色譜條件測定，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測定生品各個共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.20%，測定炭品各個共有峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.18%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 取供試品（S10、T10）粉末0.3 g，各6 份，精密稱定，按2.1.3 項下方法制成供試品溶液，按照2.1.1 項下的色譜條件測定，分別進(jìn)樣，以燈心草酚為參照峰，測定生品各個共有峰相對保留時間的RSD為0.07%～0.41%，各共有峰相對峰面積的RSD為1.89%～2.86%；測定炭品各個共有峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.58%，各共有峰的相對峰面積的RSD為0.87%～1.92%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 燈心草、燈心炭指紋圖譜的建立 取10 批燈心草和燈心炭樣品，按2.1.3 項下的方法制成供試品溶液，按照2.1.1 項下的色譜條件測定。使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）分別建立10 批燈心草和燈心炭樣品指紋圖譜，并生成指紋圖譜的對照圖譜（圖1～3）[10]。根據(jù)“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）的譜峰匹配數(shù)據(jù)，10批生品色譜圖中可標(biāo)定15個共有峰，炭品色譜圖中可標(biāo)定16個共有峰。

圖1 燈心草、燈心炭UPLC指紋圖譜

燈心炭與燈心草相比，新增8 個峰（圖3 中峰3～5、7、9、12～14）；缺失5 個峰（圖2 中峰9～11、14、15），其中峰11 為厄弗酚；一些成分的量發(fā)生了明顯的變化，如圖2中峰12、13的含量顯著降低，分別為去氫厄弗酚、燈心草酚。這說明燈心草在炮制后，化學(xué)成分的種類及含量發(fā)生了明顯的變化。

圖2 燈心草UPLC指紋圖譜對照圖譜

圖3 燈心炭UPLC指紋圖譜對照圖譜

2.1.8 指紋圖譜相似度評價 使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版），采用平均數(shù)法計算10 批燈心草和燈心炭樣品的相似度[11]。結(jié)果燈心草（S1～S10）與對照圖譜的相似度分別為0.995、0.999、0.995、0.999、0.999、0.999、0.999、0.998、0.996、0.999。燈心炭（T1～T10）與對照圖譜的相似度分別為0.905、0.924、0.894、0.975、0.967、0.965、0.970、0.938、0.899、0.904。樣品與對照指紋圖譜的相似度均大于0.89，說明不同產(chǎn)地?zé)粜牟蒿嬈|(zhì)量一致性良好且煅炭工藝穩(wěn)定，炮制后飲片質(zhì)量仍具有一致性（表2～3）。

表2 10批燈心草樣品與對照指紋圖譜的相似度

表3 10批燈心炭樣品與對照指紋圖譜的相似度

2.1.9 主成分分析（PCA）將燈心草與燈心炭指紋圖譜的共有峰峰面積的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 26.0 軟件，因子分析檢驗結(jié)果顯示，KMO 檢驗系數(shù)為0.565，Bartlett 球形檢驗近似卡方值為278.574（P＜0.001），適合做因子分析；采用降維-因子分析技術(shù)，以特征值＞1 為提取原則[12]，共提取到4 個主因子，累積方差貢獻(xiàn)率為95.256%，說明前4 個因子能夠揭示燈心草在炮制過程中大多數(shù)的變異信息，可以反映樣品主要特征，具有良好的代表性，結(jié)果見表4。采用Origin 2019 軟件PCA 對10 批燈心草、燈心炭樣品共有峰峰面積進(jìn)行PCA，以觀察炮制前后燈心草的差異，結(jié)果見圖4。由圖4 可知，燈心草和燈心炭的主成分空間分布有各自特定的區(qū)域，表明兩者化學(xué)成分存在差異，PCA 能夠?qū)粜牟莺蜔粜奶繀^(qū)分開。

圖4 10批燈心草、燈心炭樣品PCA得分

表4 10批燈心草、燈心炭樣品因子分析特征值及方差貢獻(xiàn)率結(jié)果

2.1.10 聚類分析（CA）運用SPSS 26.0 軟件，以燈心草與燈心炭指紋圖譜的共有峰峰面積為變量進(jìn)行系統(tǒng)聚類，采用瓦德爾聯(lián)接法，以平方歐氏距離作為樣品相似度的距離公式，結(jié)果見圖5。CA 將10 批燈心草樣品S1～S10 聚為一類，10 批燈心炭樣品T1～T10 聚為一類。由此可見，CA 既能全面反映燈心草、燈心炭UPLC 圖的相似性，又能反映燈心草與燈心炭的差異。

圖5 10批燈心草、燈心炭樣品CA樹狀圖

2.2 不同產(chǎn)地?zé)粜牟葜?個菲類成分含量測定

2.2.1 色譜條件 ACQUITY UHPLC HSS-T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～3 min，55%～60%A；3～5 min，60%～75%A；5～7 min，75%～90%A；7～10 min，90%～95%A；10～11 min，95%A）；柱溫為27 ℃；檢測波長為270 nm；流速為0.2 mL·min-1；樣品室溫度為10 ℃；進(jìn)樣量為1.0 μL，理論板數(shù)按燈心草酚計算應(yīng)不低于3000[13-14]。

2.2.2 對照品溶液制備 同2.1.2 項下方法，UPLC結(jié)果見圖6。

圖6 厄弗酚、去氫厄弗酚、燈心草酚混合對照品UPLC圖

2.2.3 供試品溶液制備 同2.1.3 項下方法，UPLC結(jié)果見圖7。

圖7 燈心草飲片UPLC圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取2.1.2 項下混合對照品溶液，分別以不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇稀釋，得一系列混合對照品溶液。按照2.2.1 項下的色譜條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以對照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），計算得回歸方程，見表5。

表5 燈心草3個菲類成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.5 精密度試驗 取2.1.2項下混合對照品溶液，按照2.2.1項下的色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定去氫厄弗酚、厄弗酚、燈心草酚對照品的峰面積RSD 分別為0.02%、0.01%、0.02%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取2.1.3 項下供試品溶液（S10），按照2.2.1項下的色譜條件測定，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測定去氫厄弗酚、厄弗酚、燈心草酚峰面積RSD 分別為0.05%、0.08%、0.03%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取供試品（S10）粉末0.3 g，共6份，精密稱定，按2.1.3項下的方法制成供試品溶液，按照2.2.1 項下的色譜條件測定，分別進(jìn)樣，測定去氫厄弗酚、厄弗酚、燈心草酚含量的RSD分別為0.08%、0.03%、0.09%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取供試品（S10）粉末，精密稱定，分別加入一定量的對照品粉末，按2.1.3 項下的方法制成供試品溶液，按2.2.1 項下的色譜條件測定，計算回收率。結(jié)果去氫厄弗酚的平均回收率為98.67%，RSD 為0.83%，厄弗酚的平均回收率為98.95%，RSD 為0.42%，燈心草酚的平均回收率為98.74%，RSD 為0.90%，回收率均為95%～105%。

2.2.9 10批次燈心草中3個菲類成分含量測定 取不同產(chǎn)地的10 批燈心草飲片（S1～S10），按2.1.3項下方法制成供試品溶液，按2.1.1 項下的色譜條件測定，根據(jù)線性回歸方程計算含量及3 個菲類成分的總含量[15]，并對結(jié)果降序排列，結(jié)果見表6。

表6 不同產(chǎn)地的燈心草3個菲類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 討論與結(jié)論

中藥指紋圖譜技術(shù)作為一種質(zhì)量檢測手段，可有效反映色譜峰信息量較大的中藥質(zhì)量。本研究通過建立燈心草與燈心炭對照指紋圖譜，各批次的燈心草指紋圖譜與對照指紋圖譜之間的相似度均大于0.89，初步判斷，市售燈心草質(zhì)量無明顯差異。藥材中化學(xué)成分種類基本一致，但含量有所不同，可能與藥材道地性有關(guān)；不同產(chǎn)地的氣候、土壤、溫度不同；此外采集與凈制條件的差別都有可能對藥材質(zhì)量產(chǎn)生影響。燈心炭（T1～T10）與對照圖譜的相似度較高，則說明燈心炭煅制工藝穩(wěn)定，與燈心草（S1～S10）相似度相比均存在不同程度下降，差值依次分別為0.090、0.075、0.101、0.024、0.032、0.034、0.029、0.060、0.097、0.095，說明在煅炭過程中化學(xué)成分發(fā)生量變，且與生品飲片原產(chǎn)地有關(guān)。

本研究建立的CA、PCA方法均能夠很好地將燈心草與燈心炭樣品區(qū)分開來。CA結(jié)果表明，燈心草生品和炭品各自聚為一類，說明燈心草和燈心炭在化學(xué)成分含量上差異較大，可初步證實炮制對化學(xué)成分的影響，PCA 篩選得到影響樣品分類的4 個主因子，能夠揭示燈心草在炮制過程中大多數(shù)的變異信息，燈心草和燈心炭的主成分空間分布有各自特定的區(qū)域，CA 和PCA 都可將炮制前后樣品進(jìn)行區(qū)分，表明燈心草與燈心炭存在差異。

指紋圖譜比較發(fā)現(xiàn)，燈心炭與燈心草相比，新增8 個峰，缺失5 個峰，其中峰11 為厄弗酚。一些成分的量發(fā)生了明顯的變化，如圖2 中峰12、峰13的含量顯著降低，分別為去氫厄弗酚、燈心草酚，推測可能是在高溫煅制過程中，分子內(nèi)的酚羥基進(jìn)攻分子內(nèi)或分子間芐位的碳碳雙鍵，發(fā)生加成反應(yīng)，導(dǎo)致成分含量降低，目前不能確定新增峰所對應(yīng)的具體成分，推測新增成分可能為含量降低的成分在高溫缺氧條件下反應(yīng)所得產(chǎn)物。

目前，對中藥燈心草的指紋圖譜研究中，多以燈心草為研究對象，暫沒有對燈心炭指紋圖譜的研究。本研究建立的燈心草及燈心炭UPLC 指紋圖譜，能真實反映燈心草飲片炮制前后差異，相對于目前燈心草HPLC 指紋圖譜研究更加高效、快速、靈敏，可為燈心草炮制前后化學(xué)成分比較及其臨床使用及資源開發(fā)提供參考。

煅制得到的燈心炭經(jīng)UPLC 檢測，3個菲類成分含量過少，在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量限外無法積分，故未標(biāo)注燈心炭中3 個菲類成分含量。本課題組將會在后續(xù)研究中尋找生品與炭品所共有、均能用同種方法檢測到、能夠區(qū)分生品與炭品、能夠指導(dǎo)藥材質(zhì)量判別的成分或其他指標(biāo)。