基于傳統(tǒng)煎藥工藝的大棗飲片標準湯劑制備及其質量評價方法分析△

曾杉，陳錦霞，林碧珊，陳偉彥，張汝瑩

國藥集團 廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528305

大棗Ziziphus jujubaMill.是鼠李科棗屬植物棗的果實，臨床上可作為營養(yǎng)品食用，又可入藥，對人體具有補中益氣的功效［1］。我國大棗的主要產(chǎn)地為山東、河北、山西、河南、甘肅、新疆等地區(qū)。大棗在中藥復方中入藥的歷史十分悠久，在《傷寒論》《本草綱目》《千金翼方》等多部古籍中均有其藥用記載?，F(xiàn)代藥理學研究表明，大棗在抗腫瘤、改善心腦血管循環(huán)、增強免疫力和造血功能等方面都有顯著的藥效作用［2-3］。大棗主要化學成分為核苷酸類及其衍生物、皂苷類、黃酮類、多糖類等，其中包括環(huán)磷腺苷（cAMP）、尿嘧啶、鳥苷、蘆丁、槲皮素、葡萄糖和鼠李糖等多種成分。cAMP 是大棗的主要水溶性成分之一，在成熟果實中含量最高，作為生理生化過程反向調節(jié)的第二信使，在基因轉錄和蛋白質合成中發(fā)揮重要作用［4-6］。標準湯劑是中藥配方顆粒生產(chǎn)工藝和質量的基準樣品［7］。本研究參照《醫(yī)療機構中藥煎藥室管理規(guī)范》煎煮方式［8］，制備了15 批大棗飲片標準湯劑，考察大棗標準湯劑的出膏率、cAMP 含量及轉移率、特征圖譜三大指標，旨在建立大棗配方顆粒產(chǎn)品質量的科學控制方法。

1 材料

1.1 儀器

H-class 型高效液相色譜儀（Waters 公司）；MS105DU 型十萬分之一天平、2002 型萬分之一天平（梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗儀（昆山儀器儀表有限公司）；Sunergy UV 型超純水儀（默克公司）；2 L 電控溫煎藥壺（深圳一枚王有限公司）。

1.2 試藥

對照品cAMP（批號：140709-201404，純度：99.8%）、蘆?。ㄅ枺?00080-201610，純度：91.6%）、鳥苷（批號：111977-201501，純度：93.6%）均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

大棗樣品分別從河南、山東、山西、甘肅、河北等主產(chǎn)地購得，經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為鼠李科植物棗Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果實，按《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版標準檢驗全部合格，參考《中國藥典》2020 年版大棗項下炮制方法制成飲片，除去雜質，洗凈，曬干，破開2～4 瓣。樣品信息見表1。

表1 大棗樣品信息

2 方法與結果

2.1 大棗標準湯劑的出膏率測定

取大棗飲片100 g，置于2 L 電控溫煎藥壺中，加水煎煮2 次。第1 次加入水800 g，浸泡30 min，文火煎煮60 min，煎液經(jīng)350 目濾布趁熱濾過，擠壓濾布至無明顯濾液滲出。第2 次加入水600 g，文火煎煮55 min，煎液用350目趁熱濾過，合并2次濾液后冷卻，將合并后的濾液減壓濃縮至約200 g浸膏，在磁力攪拌下，浸膏加水稀釋至固體質量分數(shù)約為15%，再分裝至10 mL棕色西林瓶中，每瓶分裝體積為5 mL，半加塞，置于真空冷凍干燥機中凍干，得大棗標準湯劑凍干粉，稱質量，按公式（1）計算出膏率。

2.2 大棗標準湯劑cAMP的含量測定

本研究參考了《美國草藥典》2021 年版［9］中收載的大棗果實標準中cAMP 含量測定色譜條件和供試品溶液制備方法，并進行了專屬性、線性、精密度、穩(wěn)定性、重復性、回收率等方法學考察，證明了該方法能準確用于測定大棗標準湯劑cAMP 的含量。

2.2.1 色譜條件 Eclipse C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μ m）；以甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀（8∶92）為流動相；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1，進樣量10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 取cAMP對照品約10 mg，精密稱定，置200 mL 量瓶中，加40%甲醇至刻度，搖勻，制成cAMP 質量濃度為50 μg·mL-1的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取大棗標準湯劑樣品約0.2 g，精密稱定，置20 mL 具塞量瓶中，加入40%甲醇適量，超聲處理（500 W，40 kHz）30 min，用40%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.4 專屬性考察 取大棗標準湯劑供試品溶液（編號：S10）、對照品溶液和空白溶劑同時進樣測定，結果見圖1，表明cAMP色譜峰專屬性好，不受空白溶劑干擾。

圖1 大棗標準湯劑專屬性考察色譜圖

2.2.5 線性關系考察 分別精密吸取配制成1.073、5.365、10.730、21.460、42.920、85.840 μg·mL-1的cAMP 對照品溶液各1 μL 進行測定，以峰面積為縱坐標（Y）峰面積，cAMP 質量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，線性回歸方程：Y=0.704 6X-0.040 7（r=1.000 0），表明質 量濃度 為1.073～85.840 μg·mL-1時cAMP與峰面積線性關系良好。

2.2.6 精密度試驗 取同一批大棗標準湯劑供試品溶液（編號：S10），連續(xù)進樣6次，按2.2.1項下色譜條件測定，結果cAMP峰面積RSD為0.4%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一批大棗標準湯劑供試品溶液（編號：S10），分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，測定cAMP峰面積RSD為0.3%，表明供試品溶液24 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復性試驗 取同一批大棗標準湯劑供試品溶液（編號：S10），按2.2.3項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件測定，測定cAMP含量RSD為0.8%，表明重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取同一批大棗標準湯劑供試品溶液（編號：S10）約0.2 g，精密稱定，平行稱取6 份，分別按1∶1 加入cAMP 對照品后，按2.2.3項下方法平行制備供試品溶液，測定cAMP含量并計算加樣回收率，結果見表2。cAMP 平均加樣回收率為99.7%，RSD 為0.4%，表明該方法回收率良好。

表2 大棗標準湯劑cAMP加樣回收率試驗結果

2.3 大棗標準湯劑特征圖譜方法測定

2.3.1 特征圖譜方法的建立 本研究參照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）》［10］，采用超高效液相色譜法（UPLC）建立了大棗標準湯劑的特征圖譜方法，并對檢測波長進行了考察，結果見圖2。

結果表明，通過對大棗標準湯劑進行二極管陣列檢測器全波長掃描，分別比較了210、230、254、300 nm 4 個檢測波長下的色譜圖，發(fā)現(xiàn)254 nm 作為檢測波長時，基線平穩(wěn)且干擾較小，可以檢測到更多色譜峰且分離度較好，因此，綜合考慮選254 nm 作為檢測波長。另外通過對比考察甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸和乙腈-0.1%磷酸水溶液3 種不同流動相，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸水溶液的峰個數(shù)、峰形和分離效果更好，綜合考慮選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液作為特征圖譜流動相。同時比較了水、50%甲醇、甲醇3 種不同提取溶劑的差異。選擇提取溶劑為水時，提取峰個數(shù)最多，峰分離效果最優(yōu)，最終確定特征圖譜的色譜條件和供試品制備方法。

2.3.2 特征圖譜色譜條件 Waters HSS T3 色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.6 μm）；流動相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，0%B；3～12 min，0%～10%B；12～25 min，10%～20%B；25～30 min，20%～95%B）；柱溫：30 ℃；流速：0.25 mL·min-1；檢測波長：254 nm；進樣量：1 μL；理論板數(shù)按cAMP峰計應不低于10 000。

2.3.3 對照品溶液的制備 分別取cAMP、鳥苷、蘆丁對照品適量，精密稱定，加40%甲醇制成質量濃度均為50 μg·mL-1的對照品溶液，即得。

2.3.4 供試品溶液的制備 取大棗標準湯劑樣品約0.4 g，精密稱定，置10 mL 具塞量瓶中，加水適量，超聲處理（500 W，40 kHz）30 min，用水定容至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3.5 對照品指認考察 分別取大棗標準湯劑供試品溶液（編號：S7）、cAMP、鳥苷、蘆丁對照品溶液同時進樣測定，結果見圖3，結果分別指認了峰5、峰6和峰11分別為鳥苷、cAMP和蘆丁。

圖3 大棗標準湯劑對照品指認色譜圖

2.3.6 精密度試驗 取大棗標準湯劑供試品溶液（編號：S7）連續(xù)進樣6次，以峰6為S峰，各特征峰與參照峰cAMP 的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2.0%，結果見表3～4，表明儀器精密度良好。

表3 大棗標準湯劑特征圖譜精密度試驗的相對保留時間

表4 大棗標準湯劑特征圖譜精密度試驗相對峰面積

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取大棗標準湯劑供試品溶液（編號：S7），分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，以峰6為S峰，各特征峰與參照峰cAMP的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2.0%，結果見表5～6，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

表5 大棗標準湯劑特征圖譜穩(wěn)定性試驗的相對保留時間

表6 大棗標準湯劑特征圖譜穩(wěn)定性試驗的相對峰面積

2.3.8 重復性試驗 平行制備6份供試品進樣測定，以峰6為S峰，各特征峰與參照峰cAMP的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2.0%，表明方法重復性良好。

2.4 樣品測定結果

2.4.1 出膏率結果 根據(jù)15批大棗飲片制成的標準湯劑平均出膏率為47.94%，按照大棗標準湯劑出膏率均值的70%～130% 計算其波動范圍為33.56%～62.32%，按照大棗標準湯劑出膏率計算其波動范圍為36.90%～55.73%。出膏率均值的70%～130%和波動范圍相差不大。為嚴格控制大生產(chǎn)中的大棗配方顆粒的出膏率，保證大棗配方顆粒的質量均一穩(wěn)定，結合15批大棗標準湯劑出膏率波動范圍，取15批大棗標準湯劑出膏率均值的70%～130%，即33.56%～62.32%。15批大棗標準湯劑的出膏率為36.90%～55.73%也在此范圍內，表明不同產(chǎn)地的大棗出膏率均一穩(wěn)定。

2.4.2 轉移率結果 采用《美國草藥典》2021年版第三部收載的大棗果實標準［9］中cAMP含量測定方法完成了15批飲片的測定，標準中規(guī)定大棗飲片質量分數(shù)不得少于0.010%。結果顯示15批大棗飲片中，cAMP質量分數(shù)為0.010%～0.044%（表7），均符合規(guī)定。采用相同方法對15批大棗標準湯劑進行含量測定，并按公式（2）計算cAMP轉移率。結果顯示15批大棗標準湯劑cAMP質量分數(shù)為0.013%～0.052%；cAMP 轉移率為48.06%～72.86%，平均轉移率為（59.82±17.95）%。為合理控制大生產(chǎn)中cAMP的轉移率，規(guī)定cAMP轉移率取均值的70%～130%較為合理，上述15批樣品全在該范圍內，能較為客觀反映標準湯劑中的轉移率特點。因此，大棗標準湯劑cAMP轉移率為48.06%～72.86%。

表7 15批大棗飲片及其標準湯劑cAMP含量和出膏率、轉移率

2.4.3 特征圖譜結果 測定15批大棗標準湯劑的特征圖譜記錄色譜圖，采用“中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）進行評價，結果見圖4～5，最終確定11個穩(wěn)定的共有峰，11個共有峰峰面積占總峰面積比值達90%以上，符合中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求，計算15 批大棗標準湯劑的相似度均大于0.90，表明不同產(chǎn)地的大棗標準湯劑基礎化學成分具有較好的一致性。

圖4 15批大棗標準湯劑特征圖譜疊加圖

3 討論

3.1 標準湯劑的制備工藝

本研究參照《醫(yī)療機構中藥煎藥室管理規(guī)范》［8］和《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》［11］，采用傳統(tǒng)煎煮方法制備大棗標準湯劑，根據(jù)方劑的性能確定煎煮時間，一般藥煮沸后再煎煮20～30 min，大棗屬于滋補類藥物需用文火慢煎約1 min。每劑藥一般煎2 次，藥劑第二煎的時間略縮短。由于中藥飲片的質地和吸水率相差較大，應根據(jù)不同的飲片確定加水量，經(jīng)考察大棗標準湯劑的加水量浸過藥面2～5 cm 為宜，確定一煎加8 倍水，二煎加6 倍水。煎煮后經(jīng)350 目的濾布濾過，濾液迅速用水冷卻，防止成分受熱損失，合并2 次煎液后采用低溫減壓濃縮后凍干，制得大棗標準湯劑凍干粉。本研究考察了不同目數(shù)的濾布的濾過效果，最終選擇350 目濾布進行固液分離；同時采用50 ℃低溫減壓進行濃縮，保證標準湯劑樣品的穩(wěn)定。

圖5 15批大棗標準湯劑對照特征圖譜

3.2 標準湯劑的應用

本研究采用傳統(tǒng)水煎煮工藝制備了15批大棗標準湯劑，結果出膏率為36.90%～55.73%，平均出膏率為（47.94±14.38）%。測定大棗標準湯劑中cAMP轉移率為48.06%～72.86%，平均轉移率為（59.82±17.95）%，測得的出膏率和轉移率均在標準湯劑《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》中規(guī)定的70%～130%，具有較高的集中度，表明大棗標準湯劑研究符合技術要求。建立的大棗標準湯劑特征圖譜共確定11個特征峰，并通過對照品指認了鳥苷、cAMP和蘆丁3個已知成分。將多批結果導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012版）計算相似度，結果15 批大棗標準湯劑樣品的特征圖譜相似度均高于0.90，表明不同產(chǎn)地的大棗飲片成分差異不大，質量穩(wěn)定，上述結果可以作為大棗配方顆粒質量控制依據(jù)，也能為其生產(chǎn)工藝提供質量控制參數(shù)，從而提高產(chǎn)品質量。