柱前衍生化高效液相色譜法測定麥冬中多糖的含量

孫紅梅，李明華，程顯隆，魏鋒*，馬雙成，楊秀偉

1.無限極（中國）有限公司，廣東 江門 529100；

2.北京大學 前沿交叉學科研究院，北京 100871；

3.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；

4.北京大學 藥學院 天然藥物學系/天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京 100191

麥冬為百合科植物麥冬Ophiopogon japonicus（L.f）Ker-Gawl.的干燥塊根，具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心之功效，可用于肺燥干咳、陰虛癆嗽、喉痹咽痛、津傷口渴、內熱消渴、心煩失眠、腸燥便秘[1]。麥冬含有甾體皂苷、高異黃酮、糖類、揮發(fā)油和微量元素等有效化學成分[2]，其中多糖類成分具有降血糖[3-9]、調節(jié)免疫力[3,6,9-11]、抗氧化[3,6,9,12-13]、平喘、抗過敏[6,9]、抗心肌缺血[2-3,6,9]、解酒保肝[14]等藥理作用。目前多糖分析方法主要有比色法[15-19]、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法[20-23]、氣相色譜法[24]、離子色譜法[25]等，未有1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化高效液相色譜法對麥冬中多糖單糖的組成研究。比色法受中藥中成分復雜、干擾因素不易排除、成分含量變化幅度大等因素影響，重現性較差。高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法對色譜柱要求較高，容易基線漂移，色譜柱易出現化學降解現象，且檢測器價格昂貴，難以普及[26]。氣相色譜法對單糖測定時容易出現色譜峰異構化裂分，對糖醛酸和氨基糖的分析不太適合[26]。離子色譜法靈敏度較高，但是糖類在電極表面能將某些分子氧化或還原，并且易受環(huán)境溫度的影響，從而影響方法的準確性[24]。PMP 柱前衍生化高效液相色譜法首先是將多糖提取液進行水解，其次用PMP 衍生化試劑對水解液中單糖進行衍生化，形成具有紫外吸收的衍生化產物，最后采用高效液相色譜-紫外檢測法進行測定[26-29]，此方法相對上述各方法靈敏度高[28]、準確度高、操作簡便。本研究采用PMP 柱前衍生化高效液相色譜法對麥冬中多糖水解液中主要單糖的組成及含量進行研究，為麥冬的質量控制研究提供參考。

1 材料

1.1 試藥

PMP（批號：G1780030，純度：98.0%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；標準品來蘇糖（批號：K08D8B48856，純度：98%，上海源葉生物有限公司）；標準品甘露糖（批號：140651-201805，純度：100.0%）、鼠李糖（批號：111683-201502，純度：100%）、半乳糖醛酸（批號：111646-201702，純度：95.1%）、無水葡萄糖（批號：110833-201908，純度：99.8%）、半乳糖（批號：100226-201807，純度：100.0%）、阿拉伯糖（批號：1506-200202）均購自中國食品藥品檢定研究院；無水乙醇（批號：20200804）、氫氧化鈉（批號：20180615）、鹽酸（批號：20150930）均購自國藥集團化學試劑有限公司；三氟乙酸（批號：G2200020）、磷酸二氫鉀（批號：G7920020）均購自上海安譜實驗科技股份有限公司；水為純凈水。

11 批麥冬藥材均購自于市場，樣品信息見表1，經中國食品藥品檢定研究院中藥材室魏鋒研究員鑒定為百合科植物麥冬Ophiopogon japonicus（L.f）Ker-Gawl.的干燥塊根。

表1 麥冬樣品信息

1.2 儀器

e2695 型高效液相色譜儀（Waters 公司）；LC-2010A 型高效液相色譜儀（島津公司）；Biofuge Primor 型高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技有限公司）；ME155DU 型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；TTL-DC 型氮吹儀（北京同泰聯科技發(fā)展有限公司）；DGG-9030A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；FE-500 型再循環(huán)冷卻器（Julobo 公司）；DZTW 調溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；Milli-Q 型超純水系統(tǒng)（Millipore公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Waters Symmetry-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）（16∶84）為流動相，等度洗脫；檢測波長為250 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1；進樣體積10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 衍生化試劑的制備 取PMP 對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成0.3 mol·L-1的溶液，即得[29]。

2.2.2 內標溶液的制備 取來蘇糖標準品適量，精密稱定，加水溶解制成0.2 mg·mL-1的溶液，即得[29]。

2.2.3 對照品溶液的制備 取甘露糖、葡萄糖和半乳糖標準品適量，精密稱定，加水分別制成含甘露糖0.3 mg·mL-1、葡萄糖2.0 mg·mL-1和半乳 糖1.0 mg·mL-1的混合溶液。精密吸取該混合溶液0.125 mL，加內標溶液0.125 mL、0.3 mol·L-1氫氧化鈉溶液0.300 mL、衍生化試劑0.500 mL，密封，70 ℃加熱30 min，冷卻，再加0.3 mol·L-1鹽酸0.300 mL和水0.650 mL，搖勻，濾過，即得。

2.2.4 供試品溶液的制備 取樣品粉末（過三號篩）約2.0 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加80%乙醇150 mL，加熱回流1 h，趁熱濾過，殘渣用80%熱乙醇洗滌3次，每次10 mL，將殘渣及濾紙置燒瓶中，精密加水100 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質量，用水補足減失的質量，搖勻，轉移至離心管中，離心（轉速8000 r·min-1，離心半徑為12 cm）20 min。精密吸取上清液2.5 mL，置20 mL頂空瓶中，加6 mol·L-1三氟乙酸溶液0.5 mL，密封，110 ℃水解3 h，冷卻，氮吹儀吹干，殘渣加0.125 mL水溶解。加內標溶液0.125 mL、0.3 mol·L-1氫氧化鈉溶液0.300 mL、衍生化試劑0.500 mL，密封，70 ℃加熱30 min，冷卻，再加0.3 mol·L-1鹽酸0.300 mL和水0.650 mL，搖勻，濾過，即得。

2.3 專屬性試驗

取2.2 項下供試品溶液、混合對照品溶液、空白溶液、供試品溶液（未加內標）和空白溶液（未加內標）各10 μL，進樣測定。在2.1 項下色譜條件，甘露糖、葡萄糖和半乳糖衍生物的色譜峰可達到基線分離，且達到定量限要求，樣品中的其他成分對單糖組分的檢測無干擾，各成分分離度＞1.5，結果見圖1。理論板數按葡萄糖色譜峰計算不低于8000。

圖1 空白溶液、混合對照品溶液和麥冬樣品溶液高效液相色譜圖

2.4 線性方程

精密稱定甘露糖9.37 mg、葡萄糖60.83 mg、半乳糖30.44 mg，置于10 mL 量瓶中，加水溶解、定容并混勻。將上述溶液加水逐級稀釋成7 個質量濃度的混合對照品溶液，按2.2.3 項下方法制備對照品溶液，在2.1 項下條件進樣測定。以各組分質量濃度為橫坐標（X），色譜峰峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸。回歸曲線及線性范圍見表2。

表2 麥冬多糖中3個單糖測定標準曲線

2.5 精密度試驗

取同一質量濃度混合對照品溶液，重復進樣6次，測得甘露糖、葡萄糖、半乳糖峰面積的RSD 分別為0.8%、1.5%、1.2%，保留時間的RSD 分別為0%、0.1%、0.1%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取S1樣品，以2.2.4項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、6、10、16、20、24 h進樣，測定，以7 次進樣所測得的單糖峰面積與內標峰面積比值為考察指標，計算RSD。結果甘露糖、葡萄糖和半乳糖峰面積與內標峰面積比值平均值分別為0.10、0.24 和0.28，RSD 分別為1.4%、0.6%和3.0%，表明24 h內供試品溶液穩(wěn)定性較好。

2.7 重復性試驗

分別精密稱取同一批樣品（S5），6 份，按2.2.4 項下方法制備成供試品溶液，分別進樣，測定，并計算各樣品中單糖含量及RSD。結果麥冬中甘露糖、葡萄糖和半乳糖平均質量分數分別為0.11%、0.62%和0.21%，RSD分別為2.6%、3.6%和3.5%，表明方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

分別精密稱取甘露糖、葡萄糖和半乳糖對照品適量，加水溶解，制成質量濃度分別為0.012 6、0.058 1、0.027 5 mg·mL-1的混合對照品溶液。取6份麥冬樣品（S5）各1 g，精密稱定，按2.2.4 項下方法，操作至“將殘渣及濾紙置燒瓶中”，分別精密加上述混合對照品溶液100 mL，稱定質量，自“加熱回流1 h”起，按2.2.4 項下方法操作，制成供試品溶液，進樣，測定，并計算加樣回收率。結果見表3。表明加樣回收率試驗良好。

表3 麥冬中各單糖的回收率試驗結果

2.9 樣品含量測定

分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定色譜峰峰面積。按公式（1）分別計算衍生化單糖在麥冬樣品中的含量。以甘露糖、葡萄糖和半乳糖百分比的總和計算麥冬中多糖的含量。

單糖質量分數=（RU/RS）×AS×（F/W）×100%(1)

式中RU為供試品溶液中相關分析物與內標物的峰面積比；RS為對照品溶液中相關分析物與內標物的峰面積比；AS為衍生化標準溶液中相關分析物的質量（mg）；F為稀釋因子；W為所稱取的藥材質量（mg）[29]。

11 批麥冬樣品多糖含量測定結果見表4，麥冬總多糖平均質量分數為1.46%。

表4 麥冬中單糖及總多糖含量測定結果（n=2）

3 討論

本研究分別考察80%乙醇提取體積（150、200、250 mL）和提取時間（1、2、3 h），水提取體積（50、100 mL）和提取時間（1、2、3 h）對麥冬中多糖含量的影響，結果80%乙醇150 mL，提取時間1 h，水100 mL，提取時間1 h 時麥冬中多糖的含量最高。酸解條件及衍生化條件參考本課題組前期研究成果[29]。色譜柱考察了Waters Symmetry C18、Welch Ultimate XB-C18和Agilent TC-C18，規(guī)格均為（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫考察了25、30、35 ℃，流速考察了0.8、1.0、1.2 mL·min-1，結果顯示，不同品牌和型號的色譜柱、不同柱溫和不同流速對保留時間具有顯著的影響，對理論板數和分離度影響均不明顯。

雖然有文獻報道麥冬多糖的主要單糖成分為果糖和葡萄糖[22]，同時PMP 作為一種可以在強堿性的氫氧化鈉條件下與醛單糖反應的通用化學修飾試劑，無法修飾酮單糖（果糖）[30]，但是本研究以麥冬中多糖水解液中部分單糖即甘露糖、葡萄糖和半乳糖之和計多糖含量，既節(jié)省檢測成本又對麥冬中多糖的含量起到一定的控制作用。

馬定遠等[27]發(fā)現環(huán)境溫度對結果的影響很大，因此，樣品測定需隨行標準品對照，可避免因樣品衍生化過程中溫度變化對測定結果的影響。相對于外標法，測定結果更準確，重現性較好。本研究采用麥冬中不含有的來蘇糖作為內標物分別測定甘露糖、葡萄糖和半乳糖的含量，并以其總和計麥冬中多糖的含量，操作簡便、快捷，準確度高，重復性良好，可用于麥冬中多糖的含量測定，為其他藥材及飲片中多糖的測定提供參考。