米泔水炮制桔梗過程中微生物變化規(guī)律研究△

于鑫鑫，丁純潔，陳麗艷，孫銀玲，鄭宏宇，王偉明

黑龍江省中醫(yī)藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036

桔梗為桔?？浦参锝酃latycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.的干燥根，主入肺經(jīng)，具有宣肺利咽、祛痰排膿的功效[1]，是原中華人民共和國衛(wèi)生部公布的藥食同源品種[2]，在我國有著悠久的藥用及食用歷史。米泔水，也稱“米泔”“淅二泔”“米瀋”，是淘洗大米或糯米時第2 次濾出的白色混濁液體，含少量淀粉及維生素等，是中藥炮制常見液體輔料之一[3]。米泔水炮制中藥是傳統(tǒng)炮制方法之一，在古代應用廣泛，現(xiàn)代多用于炮制蒼術、射干、藜蘆等[4-6]。米泔水制桔梗（MZJ）最早出現(xiàn)于宋代，《小兒衛(wèi)生總微論方》中記載“去蘆，米泔水浸一宿，焙干用”[7]，明清兩代較為盛行?！侗静菥V目》中也有記載“今但刮去浮皮，米泔水浸一夜，切片，微炒用?！盵8]但歷版《中華人民共和國藥典》中收載的桔梗飲片均為生品，MZJ飲片未收載于任何標準中，且其炮制原理也未得到科學詮釋。本研究以現(xiàn)代中藥炮制理論為指導，參照古籍記載的方法用米泔水炮制桔梗，借助16S rRNA 測序技術，考察MZJ 浸泡液中微生物群落結(jié)構及豐度變化，為從微生物發(fā)酵及桔梗成分的生物轉(zhuǎn)化角度闡明MZJ 炮制原理提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

桔梗生品飲片購于北京同仁堂哈爾濱藥店（批號：210501，產(chǎn)地：安徽亳州），由黑龍江省中醫(yī)藥科學院王偉明研究員鑒定為桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.的干燥根；糯米購于超市；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，北京諾博萊德科技有限公司）；Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix（New England Biolabs 公司）；引物由Wekemo Tech Group Co.公司合成。

1.2 儀器

LM17R 型冷凍高速離心機（美國賽默飛世爾公司）；LDZM-60KC 型高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；DHP9272 型恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）；DYCP-32C 型瓊脂糖水平電泳儀（北京市六一儀器廠）；Qubit 型熒光定量儀（美國Life Technologies 公司）；2100 型生物分析儀（美國Agilent Technologies 公司）；Novaseq 6000 型測序儀（美國Illumina 公司）；T100 型梯度聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 樣本的制備

米泔水的制備：取糯米適量，粉碎，過五號篩，每1 g 糯米粉加水50 mL，攪拌均勻，得米泔水混懸液[9]。

MZJ 浸泡液的制備：取桔梗生品飲片30 g，加8 倍量米泔水，于28 ℃浸泡72 h，分別取相同體積浸泡12、24、48、72 h 的溶液，12 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為8.6 cm），收集菌體，分別命名為MZJ1、MZJ2、MZJ3、MZJ4。

分別將米泔水、桔梗生品飲片加8 倍量水作為對照，于28 ℃浸泡24 h，12 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為8.6 cm），收集菌體，分別命名為MG和JG。

所有樣品均為無菌條件下采集及處理，分別制備3個平行樣品，處理后的樣品于-80 ℃冰箱保存待測。

2.2 DNA提取、PCR擴增及高通量測序

DNA 提取：采用CTAB 法提取各樣本基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，用無菌水稀釋樣品至1 ng·μL-1。

PCR 擴增：采用引物341F（5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'）和806R（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）對樣本的V3+V4可變區(qū)進行擴增。PCR反應體系30 μL，其中Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix（2×）15 μL、正向引物（0.2 mol·L-1）1 μL、反向引物（0.2 mol·L-1）1 μL、gDNA（1 ng·μL-1）10 μL，雙蒸水（ddH2O）補足至30 μL。擴增程序為98 ℃預變性1 min；98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s；共進行30 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。委托深圳微科盟科技集團有限公司采用Illumina Novaseq平臺對樣本進行雙端測序。

2.3 高通量測序結(jié)果分析

測序所得數(shù)據(jù)經(jīng)接頭序列（barcode）拆分后獲得有效序列信息，采用QIIME 2.0 軟件包對有效序列進行操作分類單元（OTU）聚類/去噪和物種分類分析，形成OTU 和其他物種分類等級（門、綱、目、科、屬、種）的物種豐度譜。利用qiime 2 diversity 插件及R 語言對α多樣性及β多樣性進行分析。對OTU 豐度矩陣中每個樣本的序列總數(shù)在不同深度下隨機抽樣，以每個深度下抽取到的序列數(shù)及其對應的OTU 數(shù)量繪制稀釋曲線；選取Observed OTU，Shannon、Chao1 指數(shù)對炮制過程中菌群豐度及多樣性進行分析；繪制韋恩圖，直觀展現(xiàn)各樣本組間特有或共有OTU占比；根據(jù)樣本的OTU豐度信息計算Bray Curtis、Weighted Unifrac 和Unweighted Unifrac 距離來評估不同樣品間的微生物群落結(jié)構差異；基于Weighted Unifrac 距離進行非度量多維尺度（NMDS）分析、主坐標分析（PCoA）和主成分分析（PCA），通過二維排序圖描述群落樣本的結(jié)構分布。利用Python LEfSe 軟件包進行線性判別分析及影響因子（LEfSe）分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 稀釋曲線及韋恩分析

對JG、MG、MZJ1、MZJ2、MZJ3、MZJ4 組共18 個樣品進行測序分析，所得測序數(shù)據(jù)經(jīng)過barcode拆分，獲得有效序列信息，得到1 898 034條序列，樣本中所含最大序列數(shù)為115 484，最小序列數(shù)為95 999，平均測得105 446 條序列。對OTU豐度矩陣中每個樣品序列總數(shù)在不同深度下隨機抽樣，以每個深度下抽到的序列數(shù)及其對應的OTU數(shù)量構建α多樣性稀釋曲線（rarefaction curve），隨著測序深度的增加，稀釋曲線達到飽和狀態(tài)，即使增大樣本容量，曲線變化也非常微小，說明測序數(shù)據(jù)量合理且足夠大，能滿足后續(xù)分析要求[10]，見圖1。

圖1 基于Observed OTU的不同樣本稀釋曲線

使用韋恩圖對樣本共有OTU 進行分析，從圖2可以看出，MZJ 不同浸泡時間溶液中共有OTU 數(shù)為116，隨著浸泡時間的增加，特有OTU 數(shù)量先增加后減少。6 組樣品共有OTU 數(shù)為80 個，MG 和JG 特有OTU數(shù)分別為50、54個。

圖2 MZJ各組樣品OTU韋恩圖

3.2 α多樣性分析

α多樣性主要用于考察樣本內(nèi)微生物群落的豐度和多樣性。Observed OTU 和Chao1 指數(shù)是樣本菌群豐度的表征，數(shù)值越高說明菌群豐富度越高。Shannon、Simpson 指數(shù)與樣本中菌群多樣性相關，數(shù)值越大群落多樣性越高[11]。結(jié)果顯示，隨著MZJ炮制時間的增加，浸泡液菌群豐度呈先增加后降低的趨勢，其中MZJ1 和MZJ2 菌群豐度較接近，且高于其他4 組樣本，菌群多樣性也較高，MZJ4 菌群豐度和多樣性均降至最低（表1）。

表1 MZJ樣品α多樣性指數(shù)（,n=3）

表1 MZJ樣品α多樣性指數(shù)（,n=3）

3.3 β多樣性分析

β多樣性分析主要用于考察不同樣本間群落結(jié)構的相似性。采用基于Weighted Unifrac 距離進行的NMDS 分析。相較于Bray Curtis 距離和Unweighted Unifrac 距離，Weighted Unifrac 距離在考慮物種豐度信息的同時也考慮了物種的有無。由圖3A可知，該聚類脅強系數(shù)為0.032 5（＜0.05），說明NMDS分析結(jié)果能夠清晰反映群落間相似程度，具有很好的代表性[12]。MZJ1 距離MG 較近，說明菌落組成具有較高相似性，隨著MZJ 炮制時間的增加距離逐漸變遠，說明菌落組成差異逐漸變大，MZJ3 和MZJ4 的菌落組成具有較高相似性，同時與JG 組的距離也逐漸加大。PCoA 表明，PC1 和PC2 的累積方差貢獻率為89.70%，可反映出大部分信息，PCoA 結(jié)果與NMDS分析結(jié)果相近（圖3B）。PCA結(jié)果表明，PC1和PC2的累積方差貢獻率僅為26.56%，因此未參考PCA結(jié)果。

圖3 MZJ樣品菌群β多樣性分析

3.4 菌群組成及相對豐度分析

3.4.1 門水平菌群組成及相對豐度分析 如圖4 所示，各組樣本主要菌群組成均為變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）。其中JG組變形菌門相對豐度為73.86%，厚壁菌門相對豐度為26.10%；MG 組變形菌門相對豐度為93.15%，厚壁菌門相對豐度為6.65%；MZJ1～MZJ4 變形菌門相對豐度分別為89.75%、56.35%、31.39%和37.70%，而厚壁菌門相對豐度分別為10.20%、43.57%、68.61%和62.30%。結(jié)果表明，MZJ 炮制前期變形菌門占優(yōu)勢，隨著炮制時間的延長，厚壁菌門相對豐度增加，成為優(yōu)勢菌門，炮制48 h 時趨于穩(wěn)定。

圖4 MZJ樣品門水平各菌群的相對豐度

3.4.2 屬水平菌群組成及相對豐度分析 選取相對豐度前20 的菌屬進行分析。如圖5 所示，JG 組相對豐度較高的菌屬包括腸桿菌科未明確分類屬（Unspecified_Enterobacteriaceae，31.40%）、魏斯氏菌屬（Weissella，21.48%）、腸桿菌屬（Enterobacter，18.21%）、歐文氏菌屬（Erwinia，9.50%）等。MG組豐度較高的菌屬包括腸桿菌屬（45.34%）和腸桿菌科未明確分類屬（34.21%）等。MZJ 各組樣本主要優(yōu)勢菌有腸桿菌科未明確分類屬、乳球菌屬（Lactococcus）、魏斯氏菌屬、歐文氏菌屬等，隨著炮制時間的增加，腸桿菌科未明確分類屬相對豐度先上升后下降，在MZJ1、MZJ2、MZJ3、MZJ4 中分別為17.98%、24.06%、16.17%和11.84%；乳球菌屬相對豐度顯著上升，在MZJ1 中僅為2.24%，在MZJ4 中達到40.15%；魏斯氏菌屬相對豐度前24 h 迅速上升然后下降，在MZJ1、MZJ2、MZJ3、MZJ4中分別為1.89%、20.34%、24.71%和14.32%；歐文氏菌屬相對豐度顯著下降，在MZJ1 中為50.44%，在MZJ4 中僅為2.72%。除上述菌屬外，葡糖桿菌屬（Gluconobacter）、泛菌屬（Pantoea）、明串珠菌屬（Leuconostoc）變化也較大。葡糖桿菌屬在浸泡48 h 前所占豐度均小于1.00%，而在72 h 豐度增至17.24%；泛菌屬豐度則隨炮制時間的增加呈下降趨勢，由11.82%迅速下降至低于1.00%；明串珠菌屬豐度則隨著炮制時間的增加而增加，由1.47%增至7.58%。

圖5 MZJ樣品屬水平各菌群的相對豐度

3.5 組間OTU差異顯著性分析

LEfSe 分析基于相對豐度表，可篩選具有統(tǒng)計學差異的菌群，是非參數(shù)檢驗和線性判別分析的結(jié)合，適合菌群豐度差異檢驗[13]，用線性判別分析（LDA）值表示。每個分組的特征微生物（LDA值＞4）見圖6。JG、MZJ4組未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學意義的菌群，MG組的特征菌包括假單胞菌目（Pseudomonadales）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、鞘氨醇桿菌科（Sphingobacteriaceae）、鞘脂桿菌綱（Sphingobacteriia）、鞘氨醇桿菌目（Sphingobacteriales）；MZJ1 組的特征微生物包括γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、變形菌門、歐文氏菌屬；MZJ2組的特征微生物包括塔堤查仁桿菌屬（Tanticharoenia）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）、羅爾斯 通菌屬（Ralstonia）、草酸桿菌科（Oxalobacteraceae）；MZJ3組的特征微生物包括厚壁菌門、乳桿菌目（Lactobacillales）、芽孢桿菌綱（Bacilli）。

圖6 MZJ樣品差異菌群的LDA值分析

4 討論

米泔水炮制中藥多以浸制為主，時間為1～7 d，目前對于其炮制原理研究，多數(shù)研究者認為米泔水可去除藥材中的油脂，降低藥物的辛燥之性和滑腸作用，如米泔水炮制蒼術能夠降低揮發(fā)油、蒼術素和蒼術酮的含量[9]。另外，米泔水炮制中藥還可降低毒性，劉亞蕾等[14]考察了不同輔料炮制何首烏的減毒效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，米泔水的減毒效果優(yōu)于大棗和黑豆，且炮制前后化學成分發(fā)生了轉(zhuǎn)化，其中順式二苯乙烯苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷含量下降明顯，推測此2 種成分可能是何首烏潛在的毒性相關成分，初步推測是由于米泔水的吸附作用而導致其含量下降。王金輝等[6]研究表明，米泔水炮制藜蘆可降低藜蘆新堿的含量從而降低毒性。射干藥材經(jīng)米泔水炮制后，苷類成分含量降低，苷元類成分含量增加，表明苷類成分發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化，推測米泔水炮制射干過程中可能有微生物的參與從而使苷類轉(zhuǎn)化為苷元[5]。本課題組前期預實驗結(jié)果顯示，桔梗經(jīng)米泔水炮制后皂苷、多糖等成分的含量有升有降，而米泔水中僅含有少量淀粉和維生素等成分[9]，故推測在浸泡過程中除了物理、化學作用外，可能還有微生物參與，米泔水可提供微生物所需的碳源和微量元素而有利于優(yōu)勢菌的生長繁殖，微生物產(chǎn)生的多種生物酶可促進桔梗中的成分發(fā)生生物轉(zhuǎn)化。

本研究中16S rRNA基因測序結(jié)果表明，隨著炮制時間的增加，浸泡液的菌群多樣性下降，菌群豐度先增加后下降。β多樣性分析結(jié)果顯示，MZJ1 與MG 組菌落組成具有較高相似性，MZJ 炮制前期的微生物可能來自于米泔水，隨著炮制時間的延長，浸泡液中適宜生長的菌群大量繁殖，菌落組成差異逐漸變大。MZJ3 與MZJ4 組菌落組成具有較高相似性，可能是浸泡液中菌群生長達到穩(wěn)定期。MZJ 炮制過程中溶液中微生物群落結(jié)構呈動態(tài)變化，炮制初期，變形菌門占優(yōu)勢菌，隨著炮制時間增加，營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣不斷被消耗，加之厚壁菌門的微生物不斷產(chǎn)生有機酸，變形菌門微生物不能適應缺氧、高酸的極端環(huán)境，相對豐度逐漸下降。而厚壁菌門大多數(shù)為厭氧微生物，且能適應缺氧、高酸等極端環(huán)境，相對豐度逐漸增加，成為優(yōu)勢菌門[15]。進一步從屬水平分析各組細菌群落組成，發(fā)現(xiàn)乳球菌屬相對豐度隨著炮制時間增加而增加，炮制72 h 高達40.15%。乳球菌屬歸屬于乳酸菌[16]，主要存在于乳制品、植物產(chǎn)品中，乳球菌屬的乳酸乳球菌Lactococcus lactis是乳酸菌中最具代表性的菌株，也是全球公認的安全微生物，主要用于食品發(fā)酵、藥物生產(chǎn)和飼料添加等[17-18]。魏斯氏菌屬是一類廣泛存在于發(fā)酵食品中的乳酸菌[16]，在賦予發(fā)酵食品風味即通過代謝及轉(zhuǎn)化合成反應生成酮類、醛類、醇類、酯類、萜類等風味物質(zhì)的同時，也能提高發(fā)酵食品的安全性[19]。本研究中，隨著炮制時間增加，MZJ浸泡液中魏斯氏菌屬相對豐度逐漸上升，48 h 達到最大值24.71%。明串珠菌屬是一類異型發(fā)酵乳酸菌[16]，和魏斯氏菌屬細胞均為短棒狀，常成對或成鏈出現(xiàn)，共存于發(fā)酵食品中[19]，隨著炮制時間增加，MZJ 浸泡液中明串珠菌屬相對豐度逐漸增加。葡糖桿菌屬廣泛應用于醫(yī)藥、化工、食品等多個領域，一般生活在含糖豐富的環(huán)境中，參與多種氧化反應，可將不同碳鏈長度的多羥基化合物氧化成對應的酮糖，可用于生產(chǎn)果聚糖[20-21]。本研究中葡糖桿菌屬在MZJ1、MZJ2、MZJ3 組相對豐度均小于1.00%，而MZJ4 組中葡糖桿菌屬相對豐度達到17.24%，推測MZJ4 中糖類物質(zhì)含量較前3 組有明顯增加，推測葡糖桿菌屬的氧化特性對桔梗中多羥基化合物化學結(jié)構也會產(chǎn)生一定影響。

LEfSe 分析結(jié)果顯示，γ-變形菌綱、腸桿菌科、腸桿菌目、變形菌門、歐文氏菌屬是MZJ1 組的特征微生物。歐文氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬都屬于腸桿菌科，歸屬于變形菌門、γ-變形菌綱、腸桿菌目，歐文氏菌屬常寄生于植物并引起腐敗病[22-23]，MZJ1 組中歐文氏菌屬相對豐度為50.44%，隨著炮制時間增加，相對豐度大幅降低，MZJ4組中歐文氏菌屬相對豐度僅為2.72%。腸桿菌屬中細菌大部分屬于致病菌，常出現(xiàn)于土壤、污水、腐爛蔬菜等中，對人類健康有危害[24]。本研究中，腸桿菌屬為米泔水中主要優(yōu)勢菌屬，相對豐度高達45.34%，但在MZJ 浸泡液中相對豐度較低，且隨著炮制時間增加而降低，推測這可能和桔梗的抑菌作用相關[25]。泛菌屬細菌具有致腐性，易引起油桃、青棗、多肉等水果及植物腐爛、變質(zhì)[26-28]。本研究結(jié)果顯示，泛菌屬豐度隨著炮制時間的增加而逐漸降低，在MZJ1組中為11.82%，在MZJ2組中僅為1.29%，在MZJ3、MZJ4組中不足1.00%。

綜上分析，MZJ 炮制初期歐文氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬等有害菌屬為優(yōu)勢菌屬，隨著炮制時間增加，乳球菌屬、魏斯氏菌屬、明串珠菌屬等乳酸菌類群成為優(yōu)勢菌屬，這可能是由于炮制初期溶液中豐富的營養(yǎng)成分、少量的氧氣及適宜的pH為歐文氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬等有害微生物提供適宜環(huán)境，促使其在炮制初期大量繁殖，隨著炮制時間增加，乳球菌屬、魏斯氏菌屬、明串珠菌屬等乳酸菌大量分泌乳酸，環(huán)境pH下降，部分不耐酸的細菌死亡，同時乳酸菌的代謝產(chǎn)物細菌素、過氧化氫、雙乙酰等也能有效抑制細菌生長[29]，從而使歐文氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬等腸桿菌科微生物相對豐度大幅降低，而乳酸菌類群由于適應于低酸、少氧環(huán)境，因此隨著炮制時間增加相對豐度增大，此外乳酸菌在生長代謝過程中可分泌大量胞外多糖，排出體外，炮制液中多糖含量增加，促進了葡糖桿菌屬的生長，因此在炮制后期，葡糖桿菌屬相對豐度激增。本研究明確了米泔水炮制桔梗過程中微生物的變化規(guī)律，后續(xù)將通過實驗進一步考察MZJ 炮制過程中不同微生物間及微生物與桔梗中的成分之間相互作用機制，為揭示MZJ 炮制原理提供參考，為基于微生物發(fā)酵角度闡釋米泔水炮制其他中藥的科學內(nèi)涵提供了新的思路。