吞噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白1和原鈣黏附蛋白17啟動(dòng)子甲基化水平對(duì)胃癌早期診斷的價(jià)值分析

趙洪乾 范少鵬 范立奎 李 磊

胃癌(gastric cancer，GC)是臨床上常見的腫瘤性疾病，尤其是隨著人們生活方式和飲食習(xí)慣的改變，GC的發(fā)病率也在逐年增加[1-2]。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，2020年，全球范圍內(nèi)，確診的新發(fā)胃癌病例約為74萬(wàn)例，其中89%以上病例出現(xiàn)在發(fā)展中國(guó)家，以中晚期胃癌為主[3]。單就我國(guó)而言，我國(guó)每年新發(fā)的胃癌患者約為12.4萬(wàn)例，約86%以上患者為中晚期胃癌，少數(shù)為體檢發(fā)現(xiàn)的早期胃癌[4]。對(duì)于晚期胃癌患者，手術(shù)效果欠佳，多以放化療為主，5年生存率較低[5-6]。因此，如何對(duì)GC患者做到早期診斷和早期治療是臨床上的熱點(diǎn)問(wèn)題。

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)改變，也是癌癥發(fā)生的早期重要改變之一。相關(guān)研究表明，在胃癌患者血清組織中可見抑制基因(TSG)的甲基化，包括FAM5C，MYLK和p16等，并且可以在早期胃癌組織中表達(dá)量增加[7-8]。因此，檢測(cè)胃癌患者中血清中DNA的甲基化水平可能是胃癌早期診斷的潛在方法。上皮內(nèi)瘤變(IN)是一種潛在的癌前病變，具有GC的高風(fēng)險(xiǎn)，因此，住院患者的篩查對(duì)于GC的診斷和預(yù)測(cè)至關(guān)重要。因此，在本研究中，以吞噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)和原鈣黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)啟動(dòng)子甲基化水平作為檢測(cè)指標(biāo)，探求對(duì)胃癌早期診斷的作用，以期做到早期診斷和早期治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集自2018年1月至2020年1月我院普外科收治的147例患者為研究對(duì)象，其中胃上皮內(nèi)瘤變者49例，腸上皮化生者40例，胃癌患者58例，并且以142例體檢健康者作為對(duì)照組。

收集患者的一般資料，包括性別、年齡等，收集患者的臨床病理學(xué)資料，包括腫瘤大小、位置、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期等。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①治療前均經(jīng)胃鏡活檢，明確胃癌的診斷；②無(wú)血液系統(tǒng)疾?。虎蹮o(wú)明顯手術(shù)禁忌；④了解試驗(yàn)的目的和方法，簽署知情同意書的患者。

1.3 排除診斷

①合并嚴(yán)重的內(nèi)科疾病的患者，比如嚴(yán)重高血壓，糖尿病，冠心病等，不適合手術(shù)治療；②未簽署知情同意書的患者。

1.4 血清標(biāo)本收集和DNA抽提以及重亞硫酸鹽修飾

抽取患者的清晨血，肘靜脈取血后，將血清置于預(yù)先加入肝素的試劑管中保存，4 ℃預(yù)冷離心機(jī)離心2000 rpm，時(shí)間設(shè)置為15 min，抽提上層的血清，分裝于1.5 ml的EP管中，置于-80 ℃以保存。

DNA的提取選擇碧云天公司的血清DNA提取試劑盒，按照說(shuō)明書要求配置Buffer AW1試劑和Buffer AW2試劑，取消融的400 μl血漿，置于EP管中，加入400 μlBuffer AL，恒溫水浴箱孵育10 min，4 ℃預(yù)冷離心機(jī)離心2000 rpm，時(shí)間設(shè)置為15 min，取沉淀，加入400 μL無(wú)水乙醇，置于離心柱中，加入500 μL Buffer AW1試劑，4 ℃預(yù)冷離心機(jī)離心8000 rpm，時(shí)間設(shè)置為5 min，取沉淀，加入400 μl無(wú)水乙醇，置于新離心柱中，加入500 μl Buffer AW2試劑，4 ℃預(yù)冷離心機(jī)離心8000 rpm，時(shí)間設(shè)置為5 min，反復(fù)2次后，提取DNA樣本以備用。在260 nm波長(zhǎng)下通過(guò)光譜法測(cè)量DNA濃度。用Zymo-DNA修飾試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理。

1.5 甲基化特異性PCR檢測(cè)(MSP)

經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽處理后，DNA樣本中的未甲基化胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏ぃ谆奏げ蛔?。引物設(shè)計(jì)由上海瑞捷生物有限公司負(fù)責(zé)。PCR的MSP擴(kuò)增體系選擇Zymo Taq PreMix 反應(yīng)體系，體積容量選擇6.5 μl，MSP反應(yīng)程序設(shè)置：95 ℃反應(yīng)10 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，然后在95 ℃下處理30 s，退火溫度設(shè)置為56 ℃下處理40 s，然后加入反應(yīng)底物，瓊脂糖凝膠中120 V電泳30 min，然后紫外成像系統(tǒng)下觀察條帶，引物序列見表1。

表1 ELMO1和PCDH17的基因序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 胃癌腫瘤組織的甲基化結(jié)果

結(jié)果顯示，GC患者的腫瘤和相鄰正常DNA樣本進(jìn)行全基因組Illumina甲基化EPIC芯片分析。比較了腫瘤和正常組織之間的甲基化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)865918個(gè)CpG位點(diǎn)中的2180個(gè)(0.25%)在腫瘤組織中差異甲基化。這些CpG位點(diǎn)位于837個(gè)功能基因附近；腫瘤組高甲基化率為78.4%(1710個(gè)CpG位點(diǎn))，低甲基化率為21.6%(470個(gè)CpG位點(diǎn))。與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，認(rèn)為吞噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白1(Engulfment and cell motility 1,ELMO1)和原鈣黏附蛋白17(Protocadherin 17，PCDH17)啟動(dòng)子甲基化水平變化最大。

2.2 各組患者血漿中ELMO1和PCDH17的瓊脂糖結(jié)果

結(jié)果顯示，與對(duì)照組患者血漿中ELMO1和PCDH17的含量相比，胃癌組，上皮內(nèi)瘤變組和腸化生組的血漿含量明顯升高(P<0.05)，見圖1。

注：NC為對(duì)照組；IM為腸上皮化生組；IN為上皮內(nèi)瘤變組；GC為胃癌組。

2.3 胃癌患者臨床參數(shù)與血漿DNA甲基化的相關(guān)性分析

結(jié)果顯示，外周血中ELMO1啟動(dòng)子甲基化與腫瘤分化程度呈正相關(guān)(OR=2.509，95%CI：1.207～3.424，P<0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(OR=2.427，95%CI：1.114～4.076，P<0.05)，與浸潤(rùn)深度呈正相關(guān)(OR=2.306，95%CI：1.136～3.548，P<0.05)，與CEA表達(dá)呈正相關(guān)(OR=2.115，95%CI：1.158～5.508，P<0.05)，與Hp表達(dá)呈正相關(guān)(OR=2.327，95%CI：1.479～4.638，P<0.05)。

外周血中PCDH17啟動(dòng)子甲基化與腫瘤分化程度呈正相關(guān)(OR=2.634，95%CI：1.336～4.008，P<0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(OR=2.967，95%CI：1.327～4.267，P<0.05)，與浸潤(rùn)深度呈正相關(guān)(OR=2.576，95%CI：1.436～3.007，P<0.05)，與CEA表達(dá)呈正相關(guān)(OR=2.658，95%CI：1.367～5.157，P<0.05)，與Hp表達(dá)情況呈正相關(guān)(OR=2.997，95%CI：1.856～5.435，P<0.05)，見表2。

表2 胃癌患者臨床病理參數(shù)與血漿DNA甲基化的相關(guān)性分析/例

2.4 上皮內(nèi)瘤變組患者臨床病理參數(shù)與血漿DNA甲基化的相關(guān)性分析

結(jié)果顯示，外周血中ELMO1和PCDH17啟動(dòng)子甲基化水平與上皮內(nèi)瘤變組患者臨床病理參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表3。

2.5 腸上皮化生組患者臨床病理參數(shù)與血漿DNA甲基化的相關(guān)性分析

結(jié)果顯示，外周血中ELMO1和PCDH17啟動(dòng)子甲基化水平與腸上皮化生組患者臨床病理參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表4。

2.6 聯(lián)合檢測(cè)外周血中ELMO1和PCDH17甲基化對(duì)胃癌的診斷價(jià)值

結(jié)果顯示，聯(lián)合檢測(cè)外周血中ELMO1和PCDH17甲基化后的約登指數(shù)和ROC曲線下面積也明顯增加，高于任一單獨(dú)指標(biāo)或其他聯(lián)合方式檢測(cè)，見表5。

表3 上皮內(nèi)瘤變組患者臨床病理參數(shù)與血漿DNA甲基化的相關(guān)性分析/例

表4 腸上皮化生組患者臨床病理參數(shù)與血漿DNA甲基化的相關(guān)性分析/例

表5 聯(lián)合檢測(cè)外周血中ELMO1和PCDH17甲基化對(duì)胃癌的診斷價(jià)值

3 討論

胃癌是臨床上的常見腫瘤類型之一，多于患者的飲食、生活習(xí)慣密切相關(guān)。而對(duì)于胃癌的診療中，最重要的治療方法是早期診斷，早期治療和早期預(yù)防。對(duì)于胃癌的早期診斷方法的探索中，血清學(xué)指標(biāo)是臨床上較為常用的方法之一。既往研究中，探究血清中胃蛋白酶原(PG)I、PGII和胃泌素-17(G-17)水平在萎縮性胃炎和胃癌篩查中的價(jià)值和臨床適用性，從而為臨床上胃癌的診斷和治療提供思路[9]。也有研究探究血清中的lncRNA MIAT和lncRNA CCAT1在胃癌早期診斷中的應(yīng)用，可以作為生物標(biāo)志物存在[10-11]。但是，其特異性和敏感性欠佳。在本研究中，我們以血清中吞噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白1和原鈣黏附蛋白17啟動(dòng)子甲基化水平作為研究切入點(diǎn)，探究其對(duì)胃癌早期診斷和早期治療中的作用。

吞噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)是指具有保守序列的一類蛋白質(zhì)，與細(xì)胞的侵襲，遷移和吞噬密切相關(guān)。既往研究[12]中，他們認(rèn)為肺癌細(xì)胞可以通過(guò)TGF-β信號(hào)通路介導(dǎo)ELMO1調(diào)控的腫瘤細(xì)胞的侵襲和凋亡。也有研究探討ELMO1在三陰性乳腺癌(TNBC)上皮細(xì)胞遷移和侵襲中的作用和機(jī)制。利用細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲試驗(yàn)，分別評(píng)估細(xì)胞活力、遷移和侵襲。結(jié)果表明，ELMO1的下調(diào)抑制了MDA-MB-231細(xì)胞的活力、遷移和侵襲，并降低了Rac1的活性，研究結(jié)果表明ELMO1通過(guò)RhoA/Rac1途徑抑制TNBC上皮細(xì)胞的遷移和侵襲[13]。原鈣黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)屬于鈣黏附蛋白超家族中的一員，可以發(fā)揮抑癌的作用。PCDH17的基因突變和甲基化改變與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，比如鼻咽癌，乳腺癌等。在本研究中，我們通過(guò)比較胃癌患者和癌周組織比較了腫瘤和正常組織之間的甲基化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)吞噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)和原鈣黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)啟動(dòng)子甲基化水平變化最大。

DNA的甲基化改變是表觀遺傳學(xué)的常見類型之一，抑癌基因可以通過(guò)甲基化改變，基因的功能發(fā)生改變，從而進(jìn)一步調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲和凋亡。既往研究中，抑瘤素M受體基因可以通過(guò)甲基化修飾，與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，可以作為生物靶向因子[14]。在本研究中，利用PCR瓊脂糖檢測(cè)胃癌患者，腸上皮化生，上皮內(nèi)瘤變和對(duì)照組患血清中吞噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)和原鈣黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)的甲基化改變，結(jié)果表明，胃癌患者中吞噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)和原鈣黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)的甲基化水平明顯升高。

此外，本研究還探究了胃癌患者中，吞噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)和原鈣黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)的甲基化改變與臨床資料的相關(guān)性，結(jié)果表明，外周血中ELMO1和PCDH17啟動(dòng)子甲基化情況與腫瘤的分化程度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，浸潤(rùn)深度，CEA表達(dá)水平和Hp表達(dá)情況呈正相關(guān)(P<0.05)。分析原因，可能是腫瘤分化越差，淋巴結(jié)已經(jīng)轉(zhuǎn)移，浸潤(rùn)深度較高，CEA表達(dá)水平較高以及Hp陽(yáng)性的患者外周血中ELMO1和PCDH17啟動(dòng)子甲基化水平明顯升高，可以作為生物標(biāo)志物而存在。此外，本研究還聯(lián)合檢測(cè)外周血中ELMO1和PCDH17甲基化對(duì)胃癌的診斷價(jià)值，結(jié)果表明，聯(lián)合ELMO1和PCDH17啟動(dòng)子甲基化水平檢測(cè)后，靈敏度和特異性明顯升高，約登指數(shù)和ROC曲線下面積也明顯增加。與朱春霞等[15]的研究結(jié)果相似，ELMO1和PCDH17的甲基化水平可以作為胃癌患者早期診斷的指標(biāo)之一。

但是，本研究也存在一定的局限性，比如入組病例多為單中心病例，而且具體的作用機(jī)制尚未可知。因此，在本研究的后續(xù)工作中，將進(jìn)一步完善該項(xiàng)工作。