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    基于網(wǎng)絡藥理學與分子對接技術(shù)探討石上柏在治療癌癥中的作用機制

    2022-12-26 12:08:20黃淑娟余騰驊邱宇安方義文劉利艷
    實用癌癥雜志 2022年12期
    關(guān)鍵詞:靶點癌癥通路

    武 樂 黃淑娟 余騰驊 邱宇安 方義文 梁 群 何 芳 劉利艷

    隨著人類生活方式的改變和環(huán)境的日益惡化,癌癥的發(fā)病率越來越高,最新的研究報告[1-4]顯示癌癥的發(fā)病率和死亡率已經(jīng)成為第二大威脅人類健康的疾病。在我國,癌癥的發(fā)病率和死亡率也是呈逐年上升的趨勢[5]。中醫(yī)認為癌癥屬于多發(fā)病、常見病、難治病,預后一般欠佳。癌癥屬“正虛邪實”,“正氣虧虛、毒瘀互結(jié)”是癌癥發(fā)病的重要因素[6-8],且認為,熱毒內(nèi)蘊可形成腫瘤,即熱灼血凝,凝結(jié)成塊,熱灼津液,久積成塊等。熱邪可以直入,也可諸邪侵入,郁久化熱;七情不舒,郁結(jié)成熱等,同時癌癥自身也可生熱成毒。因此,清熱解毒法在癌癥治療中起著重要的作用[9]。石上柏來源于卷柏科植物深綠卷柏(Selaginella doederleinii Hieron)的干燥全草,具有清熱解毒、祛風除濕、抗癌、止血的功效,對于多種腫瘤生長有抑制作用,常配伍其他中藥用于癌癥的治療,亦可配合放化療,以減輕放化療后患者出現(xiàn)的不適癥狀[10]。有研究顯示石上柏或其提取物能對鼻咽癌、肝癌、肺癌、喉癌、卵巢癌有作用[11-14]。然目前對石上柏治療癌癥的作用機制尚不明確?;诖耍瑸榱诉M一步研究石上柏的抗腫瘤作用機制,以石上柏為研究對象,人類癌癥疾病為靶標進行網(wǎng)絡藥理學研究,探究出石上柏在治療癌癥中的作用及其作用機制。

    1 資料與方法

    1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

    本研究所涉及的數(shù)據(jù)庫有:中藥活性成分查詢數(shù)據(jù)庫TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、化合物查詢數(shù)據(jù)庫PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、靶點預測數(shù)據(jù)庫swisstargetprediction (http://www.swisstargetprediction.ch/index.php)、疾病靶點數(shù)據(jù)DisGeNET(http://disgenet.org)和Genecards(https://www.genecards.org)、數(shù)據(jù)交集數(shù)據(jù)庫Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)、蛋白相互作用網(wǎng)絡平臺String(https://string-db.org/cgi/input.pl);通路查詢數(shù)據(jù)庫KEGG(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)、蛋白數(shù)據(jù)庫PDB(http://www.rcsb.org)、swissmodel(https://swissmodel.expasy.org)。所涉及的軟件有:網(wǎng)絡可視化Cytoscape3.7.1,通路富集與分子ClueGo2.5.4和CluePedia、R語言,分子對接軟件DISCOVERY STUDIO軟件等。

    1.2 石上柏活性成分及靶點篩選

    在TCMSP數(shù)據(jù)庫中搜集石上柏所有的活性成分;并根據(jù)化合物的類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18、口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥20%為篩選條件(若設(shè)為≥30%,活性成分芹菜素未被涵蓋,故設(shè)20%閾值)[15-17]。將納入活性成分分別在PubChem、swisstargetprediction數(shù)據(jù)庫中檢索,篩選物種為“homo sapiens”的靶點,并對各活性成分作用靶點進行篩選(篩選條件為Probability≥0.05),此即為石上柏的預測作用靶點。

    1.3 疾病靶點篩選

    在DisGeNET和Genecards數(shù)據(jù)庫,以關(guān)鍵詞“Cancer”進行檢索,篩選條件分別為:Score_gda≥0.05(DisGeNET),Relevance score≥10(Genecards),并將石上柏活性成分預測靶點與癌癥疾病靶點進行交集,得到共同的靶基因,繪制韋恩圖。

    1.4 藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡的構(gòu)建

    將藥物與活性成分靶點(共同靶基因)數(shù)據(jù)導入Cytoscape中,繪制藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖。

    1.5 PPI網(wǎng)絡的建立

    將交集后的靶基因上傳到String數(shù)據(jù)庫,將研究物種選擇為人類(Homo sapiens),獲取蛋白相互作用數(shù)據(jù),結(jié)果以TSV格式導出,然后導至Cytoscape軟件進行優(yōu)化構(gòu)建和分析蛋白相互作用網(wǎng)絡(PPI),節(jié)點大小和顏色均按“degree”排列,edge粗細和顏色均按“combined_score”排列;根據(jù)R語言篩出核心靶點,并繪制barplot圖。

    1.6 癌癥靶點基因通路與功能分析

    將篩選的核心靶基因輸入ClueGo數(shù)據(jù)庫,選擇物種Homo sapiens,選擇KEGG數(shù)據(jù)庫富集的通路,以具有統(tǒng)計學差異“P<0.05”、“Kappa Score”等于1為篩選條件,對石上柏治療癌癥作用的潛在靶點進行生物學功能和通路分析。并用CluePedia對所得的通路圖進行美化。最后構(gòu)建石上柏-成分-靶基因-信號通路的網(wǎng)絡拓撲圖。

    1.7 活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接驗證

    在上述步驟結(jié)果基礎(chǔ)上,選擇靶點數(shù)目最多的活性成分作為配體,PPI 網(wǎng)絡中“degree”最大的靶點作為受體,進行分子對接。在PDB、swissmodel數(shù)據(jù)庫下載所需蛋白結(jié)構(gòu),與pubchem下載的三維結(jié)構(gòu)配體一一對接,使用Discovery Studio中的“Clean Protein”對蛋白進行初步準備,包括刪除水分子,雜原子,加氫等步驟,再由程序定義蛋白活性位點。使用LibDock對接模式進行對接,Docking Preferences為High Quality,Conformation Methon為FAST,Number of Hotspots默認為100,Docking Tolerance值默認為0.25,與相應分子開始對接,對接完成后選取LibDockScore分值最高的分子-蛋白對接結(jié)構(gòu)(LibDockScore>100,構(gòu)象予以保留)。分析受體與配體相互作用,主要包括配體分子與蛋白間氫鍵,疏水,鹵鍵,Pi-Pi相互作用等,并保存其結(jié)構(gòu)圖。

    2 結(jié)果

    2.1 石上柏活性成分以及靶點篩選

    經(jīng)條件篩選,共篩出10個活性成分。在檢索預測靶點時發(fā)現(xiàn),有2個化合物無相關(guān)作用靶點,余下8個活性成分,再經(jīng)檢索和篩選后,得到194個預測靶點。見表1。

    表1 石上柏的活性成分及對應靶點

    2.2 疾病靶點篩選

    分別從DisGeNET和Genecards數(shù)據(jù)庫中獲取癌癥相關(guān)的疾病靶點4511個和1521個,與194個預測靶基因一起輸入Draw Venn Diagram進行交集后,得到共同靶基因78個,即為石上柏潛在作用靶點。見圖1。

    2.3 藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡的構(gòu)建

    將藥物與活性成分預測靶點(共同靶基因)數(shù)據(jù)導入Cytoscape中,繪制藥物-成分-靶點網(wǎng)絡可視圖(圖2)。圖2所示體現(xiàn)了石上柏治療癌癥具有多成分、多靶點協(xié)同作用的特點。連接度為前3的潛在活性成分分別為MOL007576(6-[5-(5,7-dihydroxy-4-keto-chromen-2-yl)-2-methoxy-phenyl]-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chromone)、MOL000008(apigenin)和MOL000359(sitosterol)。

    2.4 PPI網(wǎng)絡的建立

    將石上柏-癌癥78個共同靶基因上傳至String數(shù)據(jù)庫平臺獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)(TSV格式),然后導至Cytoscape優(yōu)化構(gòu)建和分析蛋白相互作用網(wǎng)絡(PPI):PPI網(wǎng)絡共有78個節(jié)點(共同靶基因)通過622條邊發(fā)生作用,平均節(jié)點Degree為15.9。經(jīng)R語言作出barplot圖(圖3),從圖中清楚可見VEGFA的Degree值為55,AKT1的Degree值為54,EGFR和ESR1的Degree值分別為47。

    2.5 癌癥靶點基因通路與功能分析

    篩選出排名前30的核心基因,共計33個。經(jīng)通路富集,得到42條信號通路,其中涉及癌癥的通路19條,激素類5條,血管生成1條,免疫方面2條,代謝相關(guān)通路3條等(圖4),EGFR、AKT1、MMP3、GSK3B、VEGFA等基因作為cross-talk 基因參與到 2 條及以上通路中,這些通路和基因涉及癌癥發(fā)生發(fā)展如細胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、血管新生等重要生物過程。拓撲圖顯示石上柏治療癌癥具有多成分、多靶點的協(xié)同作用。

    圖1 預測靶點與疾病靶點交集韋恩圖

    2.6 活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接驗證

    經(jīng)分子對接,顯示活性成分(6-[5-(5,7-二羥基-4-酮-色烯-2-基)-2-甲氧基-苯基]-5,7-二羥基-2-(4-羥基苯基)色酮)(MOL007576)、芹菜素(MOL000008)均能與蛋白AKT1、VEGFA穩(wěn)定結(jié)合。見表2。

    注:圈內(nèi)的8個節(jié)點分別代表8個活性成分,圈上和圈外均為作用靶點。

    圖3 各靶點相互作用的Degree分布(排名前50)

    3 討論

    本研究運用網(wǎng)絡藥理學和分子對接的方法對石上柏治療癌癥的作用機制進行研究,從石上柏已知的30個成分中篩選出10個有效成分。通過對化合物靶點網(wǎng)絡進行拓撲分析可以發(fā)現(xiàn),(6-[5-(5,7-二羥基-4-酮-色烯-2-基)-2-甲氧基-苯基]-5,7-二羥基-2-(4-羥基苯基)色酮)(6-[5-(5,7-dihydroxy-4-keto-chromen-2-yl)-2-methoxy-phenyl]-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chromone,MOL007576)、芹菜素(apigenin,MOL000008)和谷甾醇(sitosterol,MOL000359)可能是石上柏發(fā)揮作用的重要活性成分。 通過蛋白與蛋白之間的相互作用發(fā)現(xiàn)VEGFA、AKT1、EGFR 、ESR1、SRC、PTGS2、AR、MMP9、MMP2、IGF1R、KDR等蛋白為核心靶點。研究顯示,芹菜素能通過下調(diào)MMP-2、MMP-9、Bak1蛋白表達水平,上調(diào)Caspase-3表達來有效抑制腦膠質(zhì)瘤U87細胞增殖、促進凋亡[18]。通過Wnt/β-catenin信號通路來抑制喉癌細胞的增殖、遷移和侵襲[19];通過m-TOR/PI3K/Akt信號通路來抑制順鉑耐藥的腫瘤的生成[20]。血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA) 是一種能刺激血管內(nèi)皮細胞分裂增殖的糖蛋白,在體內(nèi)廣泛表達,與其受體 VEGFR 結(jié)合后,參與血管新生。研究顯示芹菜素能通過抑制 VEGF(A和B)表達,從而達到抑制血管生成的目的[21]。

    圖4 癌癥核心靶點所涉及通路

    表2 6-[5-(5,7-二羥基-4-酮-色烯-2-基)-2-甲氧基-苯基]-5,7-二羥基-2-(4-羥基苯基)色酮)(MOL007576)、芹菜素(MOL000008)與蛋白分子AKT1和VEGFA對接示意表

    β-谷甾醇通過AKT/GSK-3β信號通路抑制人胰腺癌的增殖、誘導其凋亡,抑制其遷移和侵襲[22],并通過激活線粒體介導的內(nèi)源性凋亡途徑和死亡受體介導的外源性凋亡途徑誘導HepG2細胞凋亡。研究顯示,其亦能抑制調(diào)控血管生成,從而促進腫瘤細胞凋亡[23]。我們研究與上述文獻報道基本一致。

    綜上所述,本研究以網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術(shù)初步驗證了石上柏主要活性成分與潛在作用靶點之間的相互作用,闡述了石上柏治療癌癥具有“多成分-多靶點-多通路”的作用機制,為后續(xù)深入研究石上柏治療癌癥的分子機制奠定了理論基礎(chǔ)。

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