金釵石斛破壁粉對自發(fā)性高血壓大鼠血壓及心功能的影響

楊吉容，石京山,2

(1.遵義醫(yī)科大學 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學 藥學院藥理學教研室，貴州 遵義 563099)

高血壓以體循環(huán)動脈壓升高為主要表現(xiàn)[1]，是世界公認的心血管疾病的主要危險因素，對心、腦、腎等靶器官可造成嚴重損害[2]，持續(xù)的高血壓最初常見心臟舒縮功能下降，直至心肌細胞結(jié)構(gòu)功能的改變。因此降低血壓是防治繼發(fā)心腦血管重大疾病的有效方法。盡管目前用于降壓的藥物種類較多，如β受體阻斷劑、鈣通道阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、腺苷受體阻滯劑等，但這些藥物或可致心臟抑制、呼吸系統(tǒng)副作用、性功能障礙，或出現(xiàn)耐藥等。杜仲、石菖蒲、天麻等可用于高血壓的調(diào)理或聯(lián)合治療[3-4]，鐵皮石斛葉聯(lián)合黃精具有一定的降壓作用[5]。而鐵皮石斛和金釵石斛同屬于蘭科石斛屬植物，金釵石斛具有益胃生津，滋陰清熱的作用,主要用于熱病津傷，口干煩渴，胃陰不足等功效[6]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛超微粉能夠增強小鼠的免疫功能，并且具有抗腫瘤活性[7-8]。本課題組對金釵石斛中的主要有效成分生物堿開展了神經(jīng)系統(tǒng)保護和糖脂代謝相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)了金釵石斛生物堿具有神經(jīng)元保護，改善癡呆大鼠學習的記憶，調(diào)節(jié)糖脂代謝等作用。此外，民間用石斛破壁粉作為保健品服用，高血壓個體在服用金釵石斛破壁粉之后血壓波動得到良好的控制。為了探索金釵石斛是否具有降壓效果，本實驗利用SHR大鼠初步觀察了赤水產(chǎn)金釵石斛對自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneous hypertension rats，SHR)血壓和心臟的影響,為該藥用于高血壓病的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 金釵石斛破壁粉由貴州信天中藥產(chǎn)業(yè)投資有限公司提供，規(guī)格：破壁粉為200目，2.5 g/支，20支/盒，人用法用量：每次1支，每日2次；厄貝沙坦片(揚子江藥業(yè)，批號：17062612)，規(guī)格：75 mg/片，12片/盒；一氧化氮試劑盒(南京建成生物工程研究所)；吐溫80(Sigma公司)。

1.2 儀器 CDDA8八通道無創(chuàng)血壓測量儀(美國KENT公司)； Centrifuge 5417R離心機(德國Eppendorf公司)； BeckMAN coulTER離心機(美國貝克曼公司)；MULTISKAN GO酶標儀( 美國Thermo公司)； GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；日立H-600型透射電鏡(日本日立公司)；Vevo2100高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics)。

1.3 動物 SHR大鼠，同源的Wistar-Kyoto大鼠，雄性，8周齡，SPF級，體重220～250 g，來源于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXX(京)2016-0006；飼養(yǎng)條件：SPF級動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組及給藥 雄性SHR大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，SHR大鼠收縮壓達到149 mmHg后[9]，隨機分為SHR對照組、金釵石斛破壁粉低劑量組(0.5 g/kg)、 金釵石斛破壁粉中劑量組(1.0 g/kg)、金釵石斛破壁粉高劑量組(2.0 g/kg)、厄貝沙坦組(0.03 g/kg)每組8只。另設(shè)血壓正常WKY對照組，每組8只，采用灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥6周，WKY和SHR對照組大鼠給予等體積雙蒸水。

1.4.2 大鼠體重測定 分別測定每組大鼠給藥前及給藥后第1、2、3、4、5、6周的體重。

1.4.3 大鼠血壓測定 按多通道全自動無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)使用要求操作，在安靜、清醒狀態(tài)的環(huán)境下分別測定每組大鼠給藥前及給藥后第2、4、6周的尾動脈血壓，測定收縮壓(Systolic blood pressure，SBP)和舒張壓(Diastolic blood pressure，DBP)，為避免時辰血壓波動的影響，每次測定均在上午10～12時進行，在給藥每只大鼠連續(xù)測量3次，取平均值，血壓測量均由同一人操作。

1.4.4 心臟超聲檢測 大鼠在每次給藥2 h給藥后，以3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，采用Vevo2100高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)進行常規(guī)檢測大鼠心臟功能情況。具體操作過程為：大鼠麻醉后脫掉胸毛，取仰臥位固定在操作臺，使用MS250探頭，探頭定位：探頭上的“切跡”朝向大鼠頭部，逆時針旋轉(zhuǎn)30～45°，得到胸骨旁長軸切面的左心室B型超聲圖像，接著切換為M型超聲圖像，用系統(tǒng)自帶測量軟件測量左心室功能。

1.4.5 HE染色觀察心臟組織形態(tài)學 取各組大鼠相同部位左心室心肌組織置于4%多聚甲醛固定48 h，常規(guī)石蠟包埋切片，以二甲苯脫蠟。具體過程為：二甲苯I和二甲苯Ⅱ各5 min脫蠟,100%、95%、90%、80%乙醇各5 min復水，然后雙蒸水清洗3 min，染色：蘇木素5 min，蒸餾水洗，鹽酸乙醇分化30 s，自來水沖洗15 min(提插數(shù)次)，用伊紅染色3 min，蒸餾水清洗3 min； 常規(guī)脫水，透明，封片：95%乙醇(Ⅰ)1 min，95%乙醇(Ⅱ)1 min，100%乙醇(Ⅰ)1 min，100%乙醇(Ⅱ)1 min，二甲苯石碳酸(3∶1)1 min，二甲苯(Ⅰ)1 min，二甲苯(Ⅱ)1 min，中性樹脂封固；最后使用BX43光學顯微鏡觀察心肌病理變化。

1.4.6 透射電子顯微鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu) 切取各組大鼠左心室肌1 mm3組織塊，置于2.5%戊二醛電鏡液中固定48 h，常規(guī)電鏡包埋，超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，采用日立H-600型透射電子顯微鏡觀察心肌標本細胞核、閏盤和線粒體以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等超微結(jié)構(gòu)的改變，并且照相和記錄。

1.4.7 血清中NO含量測定 根據(jù)一氧化氮測試盒說明書要求操作，通過酶標儀測定波長為550 nm時各孔吸光度OD值，然后根據(jù)試劑盒其中的計算公式得出大鼠血清中NO的含量。

2 結(jié)果

2.1 金釵石斛破壁粉對SHR大鼠體重的影響 SHR大鼠給藥6周體重增加均低于WKY對照組；然而，與SHR對照組相比，金釵石斛破壁粉低劑量組和金釵石斛破壁粉高劑量組大鼠體重有所下降(P<0.05，見圖1)。

#：與WKY對照組比較，P<0.05; *：與SHR對照組比較,

2.2 金釵石斛破壁粉對SHR大鼠收縮壓的影響 在給藥前，與WKY對照組相比，SHR對照組大鼠收縮壓升高，且隨著給藥時間增加，SHR對照組大鼠收縮壓持續(xù)增高，均高于140 mmHg(P<0.01)，與SHR對照組比較，金釵石斛破壁粉各劑量給藥組大鼠收縮壓明顯降低(P<0.05)；厄貝沙坦組大鼠收縮壓明顯降低(P<0.05)，如圖2所示。

#：與WKY對照組比較，P<0.05; *：與SHR對照組比較，

2.3 金釵石斛破壁粉對SHR大鼠舒張壓的影響 WKY對照組舒張壓無明顯差異。與SHR對照組相比，厄貝沙坦組與金釵石斛破壁粉各劑量組給藥兩周后其舒張壓與給藥前比較均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，如圖3所示。

#:與WKY對照組比較，P<0.05; *：與SHR對照組比較，

2.4 金釵石斛破壁粉對SHR大鼠左心功能的影響 與WKY對照組比較，SHR對照組收縮末期、舒張末期的左室前后壁厚度均增厚(P<0.05)，舒張末期左室內(nèi)徑降低(P<0.05)，左心室射血分數(shù)較WKY對照組相比代償性增高。與SHR對照組相比，金釵石斛破壁粉中、高劑量組及厄貝沙坦組中左心室前后壁厚度在舒縮期均顯著改善(P<0.05)，結(jié)果表明金釵石斛破壁改善SHR大鼠心臟肥厚(見圖4～5)。

A：WKY對照組； B：SHR對照組；C：金釵石斛破壁粉低劑量組；D：金釵石斛破壁粉中劑量組；E： 金釵石斛破壁粉高劑量組；F：厄貝沙坦組；×400。

A：收縮末期左心室前、后壁厚度；B：收縮期及舒張期左室內(nèi)徑；C：舒張末期左心室前、后壁厚度；D：左心室射血分數(shù)；a、b、c、d、e、f:WKY對照組、SHR對照組、金釵石斛破壁粉低劑量組、金釵石斛破壁粉中劑量組、金釵石斛破壁粉高劑量組、厄貝沙坦組；#：與WKY對照組比較，P <0.05; *：與SHR對照組比較，

2.5 金釵石斛破壁粉對SHR大鼠心臟組織形態(tài)學的影響 HE染色，在光鏡下觀察WKY對照組心肌細胞形態(tài)正常，排列整齊，心肌間質(zhì)無明顯增生，擴張等表現(xiàn)。與WKY對照組相比，SHR對照組部分心肌細胞排列紊亂，間隙增寬，見局灶性心肌肥大。與SHR對照組相比，金釵石斛破壁粉各給藥組對局灶性心肌肥大有所改善(見圖6)。

A：WKY對照組； B：SHR對照組；C：金釵石斛破壁粉低劑量組；D：金釵石斛破壁粉中劑量組E：金釵石斛破壁粉高劑量組；F：厄貝沙坦組；標尺=20 μm,放大倍數(shù)×400。

2.6 金釵石斛破壁粉對SHR大鼠心臟超微結(jié)構(gòu)的影響 透射電鏡下觀察可見WKY對照組大鼠心肌肌絲排列整齊、線粒體豐富、線粒體嵴排列整齊；SHR對照組可見心肌肌節(jié)結(jié)構(gòu)模糊、肌絲排列稀疏，線粒體嵴腫脹。而金釵石斛破壁粉給藥組肌絲排列較致密，線粒體嵴稍脹腫(見圖7)。

2.7 各組大鼠血清NO含量 與WKY對照組相比，SHR對照組血液中NO含量升高。與SHR對照組相比，高劑量金釵石斛破壁粉給藥后，大鼠血清NO含量降低(P<0.05，見圖8)。

#：與WKY對照組比較，P <0.05; *：與SHR對照組比較，

3 討論

金釵石斛其化學成分主要包括生物堿類和多糖類化合物，生物堿類化學成分為最早分離并進行結(jié)構(gòu)確認的化合物[10]，其作用主要為抗腫瘤、抗衰老、改善學習記憶、提高免疫力和降糖等[11]。另有文獻報道金釵石斛提取物對小鼠便秘癥狀有一定的改善作用[12-13],金釵石斛化學成分中多糖為主要成分之一，具有抗腫瘤的作用[14]。此外，金釵石斛還具有抗白內(nèi)障、抗衰老的作用[15]，據(jù)此開展了金釵石斛相關(guān)保健品的研發(fā)[16]。

有研究報道金釵石斛多糖具有降血壓的療效[17]，民間用金釵石斛破壁粉作為保健品服用時發(fā)現(xiàn)，針對合并高血壓，服用西藥后血壓控制不好的患者，通過服用赤水產(chǎn)金釵石斛后其血壓得到了良好的控制，但是至今金釵石斛破壁粉的降壓作用鮮有報道。故本課題旨在通過動物實驗，科學明確金釵石斛破壁粉的降壓藥理作用。SHR大鼠和人類原發(fā)性高血壓形成的機制相同,出現(xiàn)的并發(fā)癥與人的高血壓并發(fā)癥很相似[18]。研究結(jié)果表明，金釵石斛破壁粉對SHR大鼠的收縮壓有明顯的降壓作用，中、高劑量時對舒張壓的降低作用明顯，同所用劑量的厄貝沙坦相當，反映出金釵石斛有比較明確的降壓療效。血壓過高會增加心臟的負擔，長期會引起心肌勞損，盡管實驗時間較短，還沒有出現(xiàn)模型大鼠明顯的心肌損害，但是實驗中仍然可見左心室肥厚，金釵石斛破壁粉在明顯降壓的同時，用藥6周后，LVPWd、LVAWd、LVID及LVEF均有所改善，表明金釵石斛可能具備心肌保護的潛在價值。有文獻報道在SHR動物模型中，血漿NO的水平變化具有時相性，在3～6月內(nèi)SHR血漿NO水平明顯增加，而在12月齡降至與正常 Wistar對照組相似水平[19],本研究結(jié)果與此一致。NO雖然是舒張血管物質(zhì)，但在系統(tǒng)性高血壓中并非是主要的調(diào)節(jié)因素。相反有文獻報道NO在系統(tǒng)性高血壓并發(fā)的器官損傷中發(fā)揮炎性介質(zhì)的作用，其可通過刺激血管內(nèi)皮素釋放，進而刺激血管內(nèi)皮增生，成為高血壓形成以及血管平滑肌細胞和心肌細胞產(chǎn)生病理反應(yīng)的機制之一。本實驗觀察到高劑量金釵石斛能顯著降低血漿中NO含量，結(jié)合研究報道的神經(jīng)元保護作用及抗炎作用與其減少NO有關(guān)，提示金釵石斛降低SHR心臟損害可能與其抑制心肌NO產(chǎn)生，通過抗氧化機制改善心臟做功的潛在機制。AgⅡ受體阻滯劑厄貝沙坦與NO的研究集中于前者通過減少后者的釋放而發(fā)揮心功能和減少血管、肺組織的纖維化形成，但也有關(guān)于厄貝沙坦降壓的同時，血漿NO增加的報道[20-22]。本研究給予厄貝沙坦后在明顯降壓的同時，血漿NO含量甚至略高于模型對照組，提示金釵石斛破壁粉的降壓機制與之不同，厄貝沙坦增加NO水平的臨床意義值得進一步深入研究。

本實驗中所選用的金釵石斛破壁粉給藥劑量是根據(jù)人體使用金釵石斛破壁粉的保健劑量換算成的動物劑量，前述金釵石斛的主要成分為生物堿和金釵石斛多糖等。如果按照這兩個主要成分含量測算，本實驗所用破壁粉中的生物堿、金釵石斛多糖量極低，是否意味著除此外與降壓有關(guān)的還有其它成分，還是全藥多靶點作用的結(jié)果，非常值得進一步深入研究。

本研究結(jié)果表明金釵石斛破壁粉可明顯降低SHR大鼠血壓，改善心功能，其機制值得深入研究。