特應(yīng)性皮炎患兒外周血miR-155 表達(dá)與Th1/ Th17 細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的相關(guān)性分析

周曉宇 羅 亭 王潤(rùn)超

湖北省十堰市太和醫(yī)院皮膚科，湖北十堰 442000

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是慢性炎癥性皮膚病，可引起患者劇烈瘙癢，多發(fā)于嬰幼兒期，隨著年齡增長(zhǎng)患病率降低[1-4]。AD 發(fā)病與遺傳、表皮屏障破壞和免疫系統(tǒng)失調(diào)等因素有關(guān)[5]。輔助性T 細(xì)胞（T helper cell，Th cell）1、Th17 通過(guò)分泌細(xì)胞因子調(diào)控其他免疫細(xì)胞的活化和增殖，AD 患兒中Th1/Th17存在明顯失衡，Th17 細(xì)胞處于主導(dǎo)地位[6]。微RNA（micro RNA，MiR）-155 是一種重要的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑，可靶向特定基因影響免疫細(xì)胞表型和細(xì)胞因子水平[7-8]。鑒于此，本研究擬探討miR-155 表達(dá)與Th1/Th17 的關(guān)系，以期為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018 年2 月至2021 年9 月湖北省十堰市太和醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）收治的89 例AD 患兒為AD 組，其中男49 例，女40 例；年齡2 個(gè)月～6 歲，平均（3.02±1.59）歲；體重指數(shù)14.5～17.3 kg/m2，平均（15.35±1.26）kg/m2。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國(guó)兒童特應(yīng)性皮炎診療共識(shí)（2017 版）》[9]；②年齡1 個(gè)月～12 歲；③患兒家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①濕疹、脂溢性皮炎；②麻風(fēng)、疥瘡、真菌病、皮膚細(xì)菌感染；③系統(tǒng)性自身免疫疾病。根據(jù)特應(yīng)性皮炎評(píng)分指數(shù)[10]將AD 患者分為輕度組（0～24 分，28 例）、中度組（＞24～50 分，37 例）、重度組（＞50 分，24 例）。另選擇同期我院體檢的25 名健康兒童為對(duì)照組，其中男15 名，女10 名；年齡1 個(gè)月～7 歲，平均（3.11±1.62）歲；體重指數(shù)14.2～16.7kg/m2，平均（14.93±1.17）kg/m2。兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2018-014）。

1.2 研究方法

所有受試者入組后24 h 內(nèi)采集靜脈血6 ml，離心（相對(duì)離心力為699 g，離心半徑為15 cm）取上清液。miR-155 檢測(cè)：取外周全血樣本100 μl，采用Direct-Zol RNA MiniPrep（美國(guó)Zymo Research 公司，批號(hào)：190535）試劑盒分離總RNA，Nanodrop 分光光度計(jì)獲得A260/A280比值為1.8～2.1 的RNA，采用Prime-ScriptTNRT 試劑盒（日本TaKaRa 公司，批號(hào)：J02415）將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。LightCycler 480?實(shí)時(shí)PCR 儀（瑞士羅氏公司）和PCR SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TaKaRa 公司，批號(hào)：GF0527）進(jìn)行PCR 反應(yīng)，引物由Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)并由Sangon（China）合成。miR-155 正向引物：5’-CTCGTGGTTAATGCTAATTGTGA -3’，反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6 正向引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTA-3’，反向引物：5’-CGAATTTGCGTGTCATCCTTG-3’。PCR 反應(yīng)體系：Power SYBR?Green PCR Master Mix 2.5 μl，cDNA（12.5 ng）引物2 μl，RNase-Free ddH2O 21 μl。反應(yīng)條件：95℃15 min，然后是40 個(gè)循環(huán)94℃15 s，55℃30 s，70℃30 s。2-ΔΔCT法計(jì)算miR-155 相對(duì)表達(dá)量。

Th1/Th17 檢測(cè)：取肝素抗凝試管標(biāo)本，加入熒光標(biāo)記的鼠抗人CD4 抗體，APC 標(biāo)記的鼠抗人白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-7 抗體，PE 標(biāo)記的鼠抗人RORγt抗體（武漢艾美捷科技有限公司，批號(hào)：203521），磷酸鹽緩沖液重懸，CytoFLEX 流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson 公司）檢測(cè)Th17 細(xì)胞占比、Th1 細(xì)胞占比，計(jì)算Th1/Th17。

Th1、Th17 相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)：取血清樣本，Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛公司）應(yīng)用酶鏈免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)Th1 細(xì)胞因子γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-2，Th17 細(xì)胞因子IL-17和IL-23 水平，試劑盒購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司（批號(hào)：AF0268）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AD 組與對(duì)照組miR-155、Th17 和Th1 細(xì)胞占比、Th1/ Th17 比較

AD 組miR-155 表達(dá)、Th17 細(xì)胞占比高于對(duì)照組，Th1 細(xì)胞占比、Th1/Th17 低于對(duì)照組（P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 AD 組和對(duì)照組miR-155、Th17 和Th1 細(xì)胞占比、Th1/Th17 比較（）

表1 AD 組和對(duì)照組miR-155、Th17 和Th1 細(xì)胞占比、Th1/Th17 比較（）

注AD：特應(yīng)性皮炎；miR：微RNA；Th：輔助性T 細(xì)胞

2.2 AD 組與對(duì)照組Th1、Th17 相關(guān)細(xì)胞因子比較

AD 組IFN-γ、IL-2、IFN-γ/IL-17 低于對(duì)照組，

IL-17、IL-23 高于對(duì)照組（P ＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 AD 組與對(duì)照組Th1、Th17 相關(guān)細(xì)胞因子比較（）

表2 AD 組與對(duì)照組Th1、Th17 相關(guān)細(xì)胞因子比較（）

注AD：特應(yīng)性皮炎；IFN-γ：γ 干擾素；IL：白細(xì)胞介素

2.3 AD 不同嚴(yán)重程度亞組miR-155、Th17 和Th1 細(xì)胞占比、Th1/ Th17 比較

重度組miR-155 表達(dá)，Th17 細(xì)胞占比高于輕度組和中度組，Th1 細(xì)胞占比、Th1/Th17 低于輕度組和中度組；中度組miR-155 表達(dá)，Th17 細(xì)胞占比高于輕度組，Th1 細(xì)胞占比、Th1/Th17 低于輕度組（P ＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 AD 不同嚴(yán)重程度亞組miR-155、Th17 和Th1 細(xì)胞占比、Th1/Th17 比較（）

表3 AD 不同嚴(yán)重程度亞組miR-155、Th17 和Th1 細(xì)胞占比、Th1/Th17 比較（）

注：與輕度組比較，aP ＜0.05，與中度組比較，bP ＜0.05。AD：特應(yīng)性皮炎；miR：微RNA；Th：輔助性T 細(xì)胞

2.4 AD 不同嚴(yán)重程度亞組Th1、Th17 相關(guān)細(xì)胞因子比較

重度組IFN-γ、IL-2、IFN-γ/IL-17 低于輕度組和中度組，IL-17、IL-23 高于輕度組和中度組；中度組IFN-γ、IL-2、IFN-γ/IL-17 低于輕度組，IL-17、IL-23 高于輕度組（P ＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 AD 不同嚴(yán)重程度亞組Th1、Th17 相關(guān)細(xì)胞因子比較（）

表4 AD 不同嚴(yán)重程度亞組Th1、Th17 相關(guān)細(xì)胞因子比較（）

注 與輕度組比較，aP ＜0.05；與中度組比較，bP ＜0.05。AD：特應(yīng)性皮炎；IFN-γ：γ 干擾素；IL：白細(xì)胞介素

2.5 miR-155 與Th1、Th17 及其相關(guān)細(xì)胞因子的相關(guān)性分析

AD 組患兒miR-155 表達(dá)與Th17 細(xì)胞占比、IL-17、IL-23 呈正相關(guān)（r=0.541、0.402、0.295，P ＜0.05），與Th1 細(xì)胞占比、Th1/Th17、IFN-γ、IL-2、IFN-γ/IL-17呈負(fù)相關(guān)（r=-0.571、-0.607、-0.432、-0.321、-0.409，P ＜0.05）。

3 討論

AD 與皮膚屏障功能受損和特應(yīng)性背景有關(guān)，刺激物、接觸過(guò)敏原、食物等均可誘發(fā)AD[11-12]。免疫反應(yīng)在AD 發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，T 淋巴細(xì)胞亞群間不平衡導(dǎo)致細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)改變，促進(jìn)免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，引起表皮炎癥和屏障功能障礙[13-14]。miRNA 與免疫和炎癥疾病密切相關(guān)，可通過(guò)激活先天免疫細(xì)胞，引起慢性炎癥來(lái)促進(jìn)哮喘、過(guò)敏性鼻炎和AD 等疾病的發(fā)展[15]。

miR-155 是來(lái)源于B 細(xì)胞整合簇基因的一個(gè)外顯子，與信使RNA3’UTR 結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)，免疫細(xì)胞發(fā)育和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[16]，通過(guò)靶向c-Fos 促使樹(shù)突細(xì)胞成熟，上調(diào)抗原呈遞細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ和共刺激分子表達(dá)，間接激活CD4+T 細(xì)胞并促使初始CD4+T 細(xì)胞增殖分化[17]。有報(bào)道顯示，miR-155 分別通過(guò)靶向含SH2 結(jié)構(gòu)域的肌醇5-磷酸酶1和細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子-1 激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)膿毒癥急性肺部炎癥反應(yīng)[18]。在過(guò)敏性鼻炎中，下調(diào)miR-155 可調(diào)控其下游靶標(biāo)GATA 連接蛋白3，抑制Th2 細(xì)胞因子減輕過(guò)敏性反應(yīng)[19]。miR-155 還通過(guò)調(diào)節(jié)活性氧-環(huán)氧合酶-2 軸參與哮喘氣道炎癥反應(yīng)[20]。本研究結(jié)果顯示，miR-155 在AD 患兒外周血中表達(dá)上調(diào)，且隨著病情加重表達(dá)增加，提示miR-155 過(guò)表達(dá)與AD 發(fā)病和病情進(jìn)展可能有關(guān)。動(dòng)物研究顯示，AD 小鼠miR-155 表達(dá)，IgE、腫瘤壞死因子-α、IL-6水平均增高[21]，Bergallo 等[22]研究顯示，AD 患兒miR-155 表達(dá)增高且與AD 免疫失調(diào)有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，miR-155 過(guò)表達(dá)與AD 患兒Th1/Th17 失衡有關(guān)。Th17 是能分泌IL-17 的T 淋巴細(xì)胞亞群，其產(chǎn)生的IL-17 能有效介導(dǎo)中性粒細(xì)胞激活，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。Th1 參與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)，輔助細(xì)胞毒性T 細(xì)胞分化，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答等[23]。本研究結(jié)果顯示，AD 患兒Th1/Th17 向Th17 偏移，與王相華等[24]報(bào)道類(lèi)似?？赡苁且?yàn)閙iR-155 通過(guò)下調(diào)細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子-1 的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)Th17 細(xì)胞分化，還可通過(guò)靶向IFN-γ 受體α 鏈促進(jìn)Th1 細(xì)胞極化，調(diào)控Th1/Th17 平衡[17]。因此，miR-155 過(guò)表達(dá)可能引起Th17過(guò)度分化，導(dǎo)致Th1/Th17 失衡，當(dāng)敲除miR-155 后則可抑制Th17 細(xì)胞分化，抑制T 細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，恢復(fù)Th1/Th17 平衡[25]。

綜上，AD 患兒外周血miR-155 表達(dá)增高，miR-155 高表達(dá)與Th1/Th17 失衡及Th1、Th17 相關(guān)細(xì)胞因子異常有關(guān)；miR-155 可能通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th17參與AD 發(fā)病過(guò)程。本研究不足之處在于樣本量較少，尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本例數(shù)加以證實(shí)。