TNFAIP1 對RhoA 的泛素化調(diào)節(jié)在黑色素瘤進(jìn)展中的作用

肖 瀟馮 浩唐 樺李 可李 藍(lán)

(湖南省人民醫(yī)院(湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院)皮膚科,長沙 410000)

惡性黑色素瘤起源于黑色素細(xì)胞,主要發(fā)生在皮膚中,具有高度轉(zhuǎn)移性腫瘤的特征,約5%的患者在初始診斷時出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。 盡管免疫治療或靶向治療藥物產(chǎn)生顯著的臨床益處,將五年總生存率提高到35%～50%,但很大一部分轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者對治療仍無反應(yīng)[2]。 因此,尋找黑色素瘤進(jìn)展的原因?qū)τ谶M(jìn)一步改進(jìn)治療策略仍然至關(guān)重要。腫瘤壞死因子α 誘導(dǎo)蛋白1(tumor necrosis factor αinduced protein 1,TNFAIP1)是一種眾所周知的BTB(bric-a-brac,tramtrack and broad complex)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域蛋白,它在DNA 合成、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移和免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[3-4]。 新出現(xiàn)的證據(jù)表明TNFAIP1 降低與非小細(xì)胞肺癌、子宮癌、胃癌等癌癥轉(zhuǎn)移和進(jìn)展密切相關(guān)[5-6]。 然而,TNFAIP1 在黑色素瘤中的潛在機制鮮有報道。 TNFAIP1 的一個主要抑癌機制涉及底物降解和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性[5]。最近研究發(fā)現(xiàn),TNFAIP1 通過介導(dǎo)RhoA 的泛素化來控制肺癌細(xì)胞遷移[5]。 RhoA 是小GTP 酶Rho 亞家族的成員,已證實靶向RhoA 調(diào)節(jié)耐藥黑色素瘤基因轉(zhuǎn)錄[7]。 然而,TNFAIP1 是否通過介導(dǎo)RhoA的泛素化參與黑色素瘤進(jìn)展仍不清楚。 因此,我們通過生物信息學(xué)分析檢測了黑色素瘤組織中TNFAIP1 和RhoA 的表達(dá)。 此外,我們還在黑色素瘤細(xì)胞中研究了TNFAIP1 和RhoA 之間的相互作用和功能。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

18 只SPF 級BALB/c 裸鼠(雌性,6～8 周,體重18～22 g)購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2018-0001]。 小鼠喂養(yǎng)于湖南省實驗動物中心[SYXK(湘)2018-0003],在標(biāo)準(zhǔn)動物房飼養(yǎng),濕度為40%～70%,溫度為20℃～22℃,12 h的光/暗循環(huán)。 動物實驗經(jīng)湖南省人民醫(yī)院(湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院)動物實驗倫理委員會審核批準(zhǔn)(HNRMLY-2020-014),并嚴(yán)格遵循實驗動物使用的3R 原則。

1.1.2 細(xì)胞

人皮膚黑色素瘤細(xì)胞系WM2664 和A2058 均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。 細(xì)胞接種在含有10%胎牛血清(FBS,美國Gibco 公司)、10 μg/mL 鏈霉素和100 U/mL 青霉素的Roswell Park Memorial Institute 1640 培養(yǎng)基(美國Gibco 公司)中培養(yǎng)。

1.1.3 臨床樣本

于2015 年3 月至2020 年10 月期間,從本院收集了82 名黑色素瘤患者的黑色素瘤組織和鄰近組織(距腫瘤至少5 cm)。 在所有黑色素瘤患者中,男性患者54 例,女性患者28 例,平均年齡(53.11 ±9.16)歲(范圍36～74 歲)。 病程(4.25 ± 2.24)個月;瘤體位置:手背部23 例,手指甲下15 例,外陰4例,頭面部16 例,下肢24 例。 其中伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37 例,不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45 例;根據(jù)皮膚癌的Clark分級定義:Ⅰ級19 例,Ⅱ級14 例,Ⅲ級11 例,Ⅳ級22 例,Ⅴ級16 例。 所有患者均無其他臨床病理特征,未接受術(shù)前治療,如放療或化療。 根據(jù)世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行黑色素瘤的組織學(xué)診斷。 所有收集的組織在-80℃下儲存直至使用。 研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)同意(20140843-1)。

1.2 主要試劑與儀器

Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen 公司;TNFAIP1、RhoA 的過表達(dá)質(zhì)粒和Ub 及其突變體的質(zhì)粒以及帶有各種標(biāo)簽(Flag/HA/Myc)TNFAIP1 購自上海Genepharma 公司;TRIzol 試劑購自美國Invitrogen 公司; PrimeScriptRT試劑盒購自日本TaKaRa 公司;Fast SYBR Green PCR 試劑購自美國Applied Biosystems 公司;CCK-8、山羊抗兔IgG 多克隆二抗購自上海Beyotime 公司;Matrigel、抗HA、Myc、Flag 抗體購自美國Sigma 公司;增強型放射免疫沉淀測定裂解物、二辛可寧酸蛋白質(zhì)定量試劑盒購 自 武 漢 Boster 公 司; 抗 TNFAIP1、 RhoA、 Ecadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH、Ki-67 抗體購自美國Abcam 公司。 ABI PRISM 7300 RT-PCR系統(tǒng)購自美國Applied Biosystems 公司。 光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析

重新更換下擺臂、減振器和右邊輪胎軸承后試車，異響故障明顯減輕，但是在來回打方向時，還是有不同程度的異響。根據(jù)故障現(xiàn)象和特性，判斷異響來自變速器差速器。抬下變速器，更換差速器，裝車路試，該車異響的故障被徹底排除。

下載了來自UCSC Xena(https:/ /xenabrowser.net/)的TCGA 數(shù)據(jù)庫中的黑色素瘤相關(guān)數(shù)據(jù),并且僅對具有來自RNA-seq 的生存數(shù)據(jù)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)的患者進(jìn)行了總體生存分析。 對于每個基因,使用TCGA 樣本id、時間(day_to_death 或 day_to_last_follow-up 時間)、狀態(tài)(活著或死亡)和表達(dá)水平(高表達(dá)或低/中表達(dá))的列構(gòu)建了一個制表符分隔的輸入文件。 樣品分為以下兩組:高表達(dá)組(TPM 值高于上四分位數(shù))和低/中表達(dá)組(TPM 值低于上四分位數(shù))。 Kaplan-Meier 生存曲線圖是為每種TCGA癌癥類型中的每個基因創(chuàng)建的,帶有“survival”包和“survminer”包。 通過對數(shù)秩檢驗比較高表達(dá)和低/中表達(dá)樣本的存活曲線。 Kaplan-meier 生存分析的詳細(xì)步驟在相應(yīng)的網(wǎng)站(https:/ /ucsc-xena.gitbook.io/project/overview-of-features/kaplan-meier-plots) 中描述。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長細(xì)胞用胰蛋白酶消化,以每孔1×105接種到6 孔板中,并根據(jù)Lipofectamine 2000的說明轉(zhuǎn)染,24 h 后達(dá)到約75%融合。 用TNFAIP1和RhoA 的過表達(dá)質(zhì)粒以及泛素(Ub)-wt、Ub-K48、Ub-K63 單獨或組合轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.3.3 定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)

使用TRIzol 試劑從細(xì)胞中提取總RNA。 按照PrimeScript RT 試劑盒的說明,將RNA 反向轉(zhuǎn)錄成

cDNA。 然后,通過Fast SYBR Green PCR 試劑和ABI PRISM 7300 RT-PCR 系 統(tǒng) 對 cDNA 進(jìn) 行RT-qPCR。 以GAPDH 為內(nèi)參照基因,采用2-ΔΔCt法計算每個基因的相對表達(dá)水平。 引物序列如下:GAPDH: Forward:5 ’-CGAGCCACATCGCTCA GACA-3’, Reverse: 5’-GTGGTGAAGACGCCAGTG GA-3’;TNFAIP1:Forward: 5’-ACACCAGACCGCA GCTCC A-3’,Reverse: 5’-TCGTGGAAGATTTCGGT GTC-3’; RhoA: Forward: 5’-TCCATTGCTGCTGTC TGATTTGTAG-3’,Reverse: 5’-AGCAAGGCATGAGT TGCACA-3’。

1.3.4 細(xì)胞增殖試驗通過CCK-8 和克隆形成測定法評估細(xì)胞的增殖。 將細(xì)胞(5×103個/孔)接種到96 孔板中并培養(yǎng)過夜。 隨后,每孔加入CCK-8(10 μL),再孵育2 h。然后,通過酶標(biāo)儀測量吸光度(450 nm)。 對于細(xì)胞集落形成測定,將癌細(xì)胞(100 個/孔)接種在12 孔板中,并在37℃培養(yǎng)箱中生長14 d。 將菌落(>50個細(xì)胞)固定10 min。 隨后,應(yīng)用結(jié)晶紫(1%)對菌落染色5 min。 在顯微鏡下測量菌落數(shù)(×200 放大倍數(shù))。

1.3.5 Transwell 檢測為了檢查癌細(xì)胞的侵襲能力,將1.0×106個癌細(xì)胞和200 μL 不含血清的培養(yǎng)基添加到用 Matrigel(8 μm)預(yù)處理的上室中。 同時,將含有10% FBS的600 μL 培養(yǎng)基加入下室。 培養(yǎng)48 h 后,用0.1%結(jié)晶紫對下室細(xì)胞進(jìn)行染色,光鏡下觀察計數(shù)。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡用含有蛋白酶抑制劑的增強型放射免疫沉淀測定裂解物裂解細(xì)胞,然后使用二辛可寧酸蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。 蛋白質(zhì)通過10%SDS-PAGE 分離,并電泳轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。 將膜在室溫下用5% 牛血清白蛋白封閉2 h,與抗TNFAIP1(1 ∶1000)、RhoA(1 ∶1000)、E-cadherin(1 ∶1000)、N-cadherin(1 ∶1000)、Vimentin(1 ∶1000)、Flag(1 ∶2000)、HA(1 ∶2000)、Myc(1 ∶1000)和GAPDH(1 ∶1000)在4℃下過夜。 隨后,應(yīng)用山羊抗兔IgG 多克隆二抗(1 ∶5000)孵育膜1 h。應(yīng)用ECL 化學(xué)發(fā)光顯示印跡。 通過Image J 軟件對條帶進(jìn)行量化,并標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH。

1.3.7 泛素化測定

將指定的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到黑色素瘤細(xì)胞中。 轉(zhuǎn)染48 h 后,將細(xì)胞與MG132(50 μg/mL)一起培養(yǎng)8 h,收獲并在IP 裂解緩沖液中裂解。 使用2 mg 抗HA標(biāo)簽抗體或IgG 對細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫沉淀,然后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡和IP 測定。

1.3.8 異種移植小鼠模型

將小鼠隨機分為載體組、 TNFAIP1 組和TNFAIP1+RhoA 組,每組6 只。 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的TNFAIP1 過表達(dá)或RhoA 處理過表達(dá)TNFAIP1 的WM2664 細(xì)胞(1 × 106個)或載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞皮下注射到裸鼠的右背側(cè)。 在指定的時間點監(jiān)測腫瘤體積。 注射后兩周,處死小鼠,切除腫瘤,稱重,拍照,免疫組化染色。

1.3.9 免疫組化染色

將腫瘤組織在4%多聚甲醛中固定過夜,石蠟包埋,并切成5 μm 厚的切片。 將石蠟切片脫蠟并再水合,并在室溫下在3% H2O2中孵育25 min,在山羊血清中封閉30 min。 然后,樣品用TNFAIP1(1 ∶2000)、RhoA(1 ∶200)、Ki-67(1 ∶200)等一抗在4℃孵育過夜。 之后,將樣品與二抗(HRP 標(biāo)記)在37℃下孵育30 min。 最后,加入新鮮制備的二氨基聯(lián)苯胺進(jìn)行顯色。 在光學(xué)顯微鏡下觀察組織。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 21.0 進(jìn)行處理。 測量數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(xˉ±sxˉ)。 通過配對樣本t檢驗檢查黑色素瘤組織和相鄰組織之間的數(shù)據(jù)。使用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行多組之間的比較。 使用重復(fù)測量方差分析和Tukey’s post-test 進(jìn)行不同時間點的組間比較。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNFAIP1 和RhoA 在黑色素瘤中的表達(dá)及臨床功能鑒定

在黑色素瘤患者收集的82 個臨床樣本觀察到,與癌旁正常組織相比,腫瘤組織中TNFAIP1表達(dá)顯著降低(P<0. 01)和RhoA 表達(dá)顯著升高(P<0. 01)(圖1)。 此外,通過TCGA 數(shù)據(jù)庫采用Kaplan-Meier 法和Log-rank 檢驗繪制生存曲線。 分析發(fā)現(xiàn),TNFAIP1 高表達(dá)的黑色素瘤患者預(yù)后良好。 具有RhoA 高表達(dá)的黑色素瘤患者預(yù)后不良。 此外,RhoA 表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(圖2)。

圖1 TNFAIP1 和RhoA 在黑色素瘤中的表達(dá)Note. A, TNFAIP1 expression in melanoma tissue samples. B, RhoA expression in melanoma tissue samples. Compared with normal group,**P<0.01.Figure 1 Expression of TNFAIP1 and RhoA in melanoma

圖2 TNFAIP1 和RhoA 在黑色素瘤中的臨床功能鑒定Note. A, Kaplan-Meier survival curve reflects the survival difference of melanoma patients with high or low expression of TNFAIP1. B, Kaplan-Meier survival curve reflects the survival difference of melanoma patients with high or low expression of RhoA. C, Kaplan-Meier survival curves reflect differences in survival between patients with metastatic melanoma with high or low expression of RhoA.Figure 2 Clinical function identification of TNFAIP1 and RhoA in melanoma

2.2 TNFAIP1 的過表達(dá)在體外抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖、侵襲

為了研究TNFAIP1 的功能,通過轉(zhuǎn)染TNFAIP1構(gòu)建過表達(dá)TNFAIP1 的黑色素瘤細(xì)胞,并通過RTqPCR 進(jìn)行驗證(圖3)。 與載體組相比,TNFAIP1組顯著抑制了黑色素瘤細(xì)胞的活力、克隆數(shù)和侵襲數(shù)(P<0.01)(圖4)。 TNFAIP1 組黑色素瘤細(xì)胞中N-cadherin 和Vimentin 的表達(dá)較載體組顯著降低(P<0.01),而E-cadherin 的表達(dá)增加(P<0.01)(圖5)。 總之,TNFAIP1 過表達(dá)抑制了黑色素瘤細(xì)胞的增殖、侵襲。

圖3 通過RT-qPCR 鑒定黑色素瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染物Note. Compared with the Vec group,***P<0.01.Figure 3 Identification of transfection in melanoma cells by RT-qPCR

圖4 TNFAIP1 過表達(dá)在體外抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖、侵襲Note. A, Melanoma cell viability was detected by CCK-8 assay. B, Melanoma cell proliferation was assessed by colony formation assay. C,Melanoma cell invasion was assessed by Transwell assay. Compared with the Vec group,**P<0.01,***P<0.001.Figure 4 TNFAIP1 overexpression inhibits the proliferation and invasion of melanoma cells in vitro

圖5 通過蛋白質(zhì)印跡定量黑色素瘤細(xì)胞中的E-鈣粘蛋白、波形蛋白和N-鈣粘蛋白水平Note. Compared with the Vec group,**P<0.01,***P<0.001.Figure 5 Quantification of E-cadherin, vimentin and N-cadherin levels in melanoma cells by Western blot

2.3 TNFAIP1 調(diào)節(jié)RhoA 泛素化

現(xiàn)已知在肝癌中TNFAIP1 可以通過泛素化修飾降解RhoA[8]。 本研究中,共免疫沉淀(Co-IP)的結(jié)果證實了TNFAIP1 和RhoA 在過表達(dá)RhoA 的WM2664 細(xì)胞中的直接相互作用(圖6)。 此外,標(biāo)記的TNFAIP1 在WM2664 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染,然后進(jìn)行內(nèi)源性IP 測定。 結(jié)果表明TNFAIP1 和RhoA 之間存在直接相互作用(圖6)。 接下來,分析了TNFAIP1介導(dǎo)的RhoA 泛素化。 TNFAIP1 和Ub 共轉(zhuǎn)染到過表達(dá)RhoA 的WM2664 細(xì)胞中,結(jié)果顯示TNFAIP1顯著促進(jìn)了RhoA 的泛素化。 過表達(dá)的TNFAIP1 主要促進(jìn)Rho 的K48 泛素化并部分抑制其K63 泛素化(圖7)。 K48 連接的泛素化主要通過蛋白酶體途徑介導(dǎo)降解,這與RhoA 的蛋白酶體降解一致。 為了更好地證明TNFAIP1 促進(jìn)了K48 連接的RhoA泛素化,我們用TNFAIP1 和Ub-K48 共轉(zhuǎn)染過表達(dá)RhoA 的WM2664 細(xì)胞,然后用蛋白酶體抑制劑MG132 處理WM2664 細(xì)胞。 根據(jù)蛋白質(zhì)印跡,在TNFAIP1 過表達(dá)后,RhoA 被Ub 修飾(圖8),表明TNFAIP1 確實顯著促進(jìn)了RhoA 的K48 連接的泛素化修飾。

圖6 TNFAIP1 與RhoA 之間的相互作用Note. A, Validation of the interaction between RhoA and TNFAIP1 in WM2664 cells by Co-IP. B, Validation of the interaction between TNFAIP1 and endogenous RhoA in WM2664 cells by IP.Figure 6 Interaction between TNFAIP1 and RhoA

圖7 TNFAIP1 對過表達(dá)RhoA 的WM2664 細(xì)胞中Rho、K48、K63 連接的ARhoA 泛素化的影響Note. A, RhoA-linked RhoA ubiquitination. B, K48-linked RhoA ubiquitination. C, K63-linked RhoA ubiquitination.Figure 7 Effect of TNFAIP1 on the ubiquitination of Rho, K48, K63-linked ARhoA in WM2664 cells overexpressing RhoA

圖8 TNFAIP1 對MG132 處理的過表達(dá)RhoA 的WM2664 細(xì)胞中K48 連接的RhoA泛素化的影響Figure 8 Effect of TNFAIP1 on ubiquitination of K48-linked RhoA in MG132-treated WM2664 cells overexpressing RhoA

2.4 RhoA 上調(diào)顯著逆轉(zhuǎn)了TNFAIP1 過表達(dá)體外對黑色素瘤細(xì)胞的影響

為了進(jìn)一步證實RhoA 和TNFAIP1 之間的分子關(guān)聯(lián),數(shù)據(jù)顯示,TNFAIP1 過表達(dá)對黑色素瘤細(xì)胞中RhoA 水平的影響被RhoA 顯著逆轉(zhuǎn)(圖9)。RhoA 的過表達(dá)顯著恢復(fù)了TNFAIP1 過表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和侵襲抑制作用(圖10)。 同樣,在TNFAIP1 過表達(dá)的黑色素瘤細(xì)胞中,RhoA 的過表達(dá)提高了N-鈣粘蛋白和波形蛋白水平,但降低了E-鈣粘蛋白水平(圖11)。 綜上,RhoA 的過表達(dá)在體外對TNFAIP1 的生物功能產(chǎn)生了負(fù)面影響。

圖9 RhoA 對過表達(dá)TNFAIP1 的腫瘤細(xì)胞中RhoA 的蛋白水平影響Figure 9 Effect of RhoA on the protein level of RhoA in tumor cells overexpressing TNFAIP1

圖10 RhoA 上調(diào)對TNFAIP1 過表達(dá)對黑色素瘤進(jìn)展的影響Note. A, Melanoma cell viability was detected by CCK-8 assay. B, Melanoma cell proliferation was assessed by colony formation assay, C, Melanoma cell invasion was assessed by Transwell assay. Compared with the Vec group,**P<0.01,***P<0.001. Compared with the TNFAIP1 group,#P<0.05,##P<0.01.Figure 10 Effect of RhoA upregulation on the overexpression of TNFAIP1 and the progression of melanoma

圖11 通過蛋白質(zhì)印跡定量黑色素瘤細(xì)胞中的E-鈣粘蛋白、波形蛋白和N-鈣粘蛋白水平Note. Compared with the Vec group,**P<0.01,***P<0.001. Compared with the TNFAIP1 group,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001.Figure 11 Quantification of E-cadherin, vimentin and N-cadherin levels in melanoma cells by Western blot

2.5 RhoA 上調(diào)顯著逆轉(zhuǎn)了TNFAIP1 過表達(dá)體內(nèi)對黑色素瘤細(xì)胞的影響

為了評估TNFAIP1 在黑色素瘤細(xì)胞腫瘤發(fā)生中的作用,用裸鼠進(jìn)行了皮下異種移植實驗。 結(jié)果表明,過表達(dá)TNFAIP1 的WM2664 細(xì)胞形成的腫瘤在大小和重量上均明顯小于載體組細(xì)胞形成的腫瘤,同時RhoA+TNFAIP1 組腫瘤在大小和重量均明顯高于TNFAIP1 組(P<0.001)(圖12)。 免疫組織化學(xué)染色顯示,與載體組相比,TNFAIP1 組腫瘤樣本中TNFAIP1 陽性細(xì)胞的百分比顯著增加(P<0.01),和RhoA、Ki-67 陽性細(xì)胞的百分比顯著降低(P<0.01)。 RhoA+TNFAIP1 組則逆轉(zhuǎn)了TNFAIP1組的這些變化(P<0.05)(圖13)。 總之,這些結(jié)果表明TNFAIP1 通過RhoA 介導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞的生長、侵襲和腫瘤發(fā)生。

圖13 免疫組化分析檢測TNFAIP1、RhoA 和Ki-67 的表達(dá)Note. Compared with the Vec group,**P<0.01,***P<0.001. Compared with the TNFAIP1 group,#P<0.05.Figure 13 Immunohistochemical analysis to detect the expression of TNFAIP1, RhoA and Ki-67

3 討論

全世界黑色素瘤的發(fā)病率持續(xù)上升,導(dǎo)致嚴(yán)重的社會經(jīng)濟問題[9]。 在本研究中, 我們發(fā)現(xiàn)TNFAIP1 在人黑色素瘤組織樣本中表達(dá)下調(diào),TNFAIP1 低表達(dá)是黑色素瘤患者的不良預(yù)后因素,表明TNFAIP1 可能是一種生物標(biāo)志物黑色素瘤。在進(jìn)一步研究中,我們評估了TNFAIP1 在黑色素瘤增殖和侵襲中的意義。 結(jié)果表明,黑色素瘤細(xì)胞中TNFAIP1 過表達(dá)抑制細(xì)胞增殖、侵襲。 從機制上講,我們通過Co-IP 驗證TNFAIP1 直接與RhoA 結(jié)合,并誘導(dǎo) RhoA 泛素化。 這些發(fā)現(xiàn)揭示了TNFAIP1/RhoA 可能是黑色素瘤的治療靶點。

TNFAIP1 調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生物學(xué)過程,包括蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運和降解、信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄[10]。 越來越多的報告表明,TNFAIP1 在多種人類惡性腫瘤中下調(diào),在細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲中起關(guān)鍵作用[11-12]。 例如,Li 等[5]報道CRL3BD9 E3 泛素連接酶復(fù)合物通過靶向TNFAIP1 降解以抑制癌細(xì)胞遷移。 還有研究表明TNFAIP1 下調(diào)導(dǎo)致結(jié)腸、乳腺癌和甲狀腺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖減少、周期停滯和細(xì)胞凋亡增加[4-5]。 一致地,本研究發(fā)現(xiàn)TNFAIP1 在黑色素瘤組織中下調(diào)。此外,TNFAIP1 過表達(dá)顯著降低了黑色素瘤細(xì)胞體外增殖、侵襲和EMT 表型,并在體內(nèi)抑制了腫瘤生長,表明TNFAIP1 可能是黑色素瘤的腫瘤抑制因子。

RhoA 已被充分證明是一種促進(jìn)腫瘤存活、進(jìn)展和遷移的轉(zhuǎn)錄因子[13-14]。 相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),RhoA介導(dǎo)的肌動蛋白絲和粘著斑的形成加速黑色素瘤增殖和遷移[15]。 此外,RhoA 上調(diào)通過激活波形蛋白驅(qū)動黑色素瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[16-17]。 先前的數(shù)據(jù)表明,TNFAIP1 作為底物特異性接合器,通過介導(dǎo)RhoA 的多泛素化和降解參與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)[18]。 本研究發(fā)現(xiàn)RhoA 在黑色素瘤組織中上調(diào),具有高表達(dá)RhoA 的黑色素瘤患者預(yù)后不良。此外,RhoA 表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了RhoA 作為黑色素瘤轉(zhuǎn)移靶點的重要性。 據(jù)報道,RhoA 是一種半衰期短的不穩(wěn)定蛋白質(zhì),可被TNFAIP1 泛素酶降解[19]。 泛素酶被認(rèn)為在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用,并已成為一類新的抗癌靶點[20-21]。 目前,關(guān)于TNFAIP1 對RhoA 泛素化的具體位點沒有詳細(xì)描述。 本研究發(fā)現(xiàn)TNFAIP1 介導(dǎo)了RhoA 的K48 連鎖泛素化。 此外,TNFAIP1 通過調(diào)節(jié)泛素介導(dǎo)的RhoA 降解抑制了黑色素瘤細(xì)胞增殖、侵襲和EMT 表型,而RhoA 基因過表達(dá)挽救了TNFAIP1 過表達(dá)引起的所有效應(yīng)。 因此,RhoA可能是黑色素瘤細(xì)胞中TNFAIP1 的下游因子。

總之,我們的數(shù)據(jù)表明TNFAIP1 在黑色素瘤中發(fā)揮腫瘤抑制作用,其通過誘導(dǎo)RhoA 泛素化抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。 因此,TNFAIP1-RhoA 軸可能是黑色素瘤潛在的抗癌靶點。