腫瘤心臟病學(xué)動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

張 鈺孟婷婷田 鵬鄭 燕*蘇國(guó)海*

(1.山東大學(xué),濟(jì)南 250013;2.濟(jì)南市中心醫(yī)院,濟(jì)南 250013;3.專科轉(zhuǎn)化研究中心,山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬中心醫(yī)院,濟(jì)南 250013)

隨著抗腫瘤藥物的不斷更新,抗腫瘤療效顯著提高,腫瘤患者的病情得到好轉(zhuǎn),但隨之而來的腫瘤本身對(duì)心功能的影響及抗腫瘤藥物相關(guān)心血管毒性卻成為腫瘤病人死亡的另一重要原因。 在此背景下,作為研究腫瘤學(xué)和心血管病學(xué)的新型交叉學(xué)科,腫瘤心臟病學(xué)(cardio-oncology)應(yīng)運(yùn)而生[1]。

抗腫瘤治療過程中引起的心血管毒性是腫瘤心臟病學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容之一。 已有報(bào)道,傳統(tǒng)的化療藥,靶向藥、免疫檢查點(diǎn)抑制劑和放療等都可能會(huì)引起潛在危及生命的心血管并發(fā)癥,包括心力衰竭、高血壓、心律失常、心肌炎和心肌缺血等[1]。對(duì)其發(fā)病機(jī)制及保護(hù)性藥物的研究引起越來越多的重視,正逐漸成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 動(dòng)物模型在其中的作用不容忽視,當(dāng)前大部分體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用了嚙齒類動(dòng)物構(gòu)建腫瘤心臟病學(xué)模型。 然而,不同的研究中所選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系,藥物劑量和評(píng)價(jià)指標(biāo)存在較大差異[2]。 建立貼近于臨床的腫瘤心臟病學(xué)動(dòng)物模型,對(duì)研究抗腫瘤過程中發(fā)生心血管毒性的分子機(jī)制,尋找理想的生物標(biāo)志物意義重大,可幫助醫(yī)生制定合理的診療方案以預(yù)防和及時(shí)治療心血管并發(fā)癥。 本文對(duì)當(dāng)前已發(fā)表的腫瘤心臟病學(xué)動(dòng)物模型進(jìn)行綜述,分析其特點(diǎn),助力研究者構(gòu)建合適的腫瘤心臟病學(xué)動(dòng)物模型。

1 蒽環(huán)類藥物動(dòng)物模型

蒽環(huán)類藥物是治療乳腺癌、淋巴瘤、白血病的一線用藥,應(yīng)用較廣泛,包括阿霉素(doxorubicin,DOX)、柔紅霉素、表柔比星等。 蒽環(huán)類藥物引起心血管毒性發(fā)病率較高且隨著累積用藥劑量的增大,心臟毒性的風(fēng)險(xiǎn)增高,是最早引起學(xué)者關(guān)注的產(chǎn)生心臟毒性的抗腫瘤藥[3]。 當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)蒽環(huán)類藥物激發(fā)心臟毒性的機(jī)制有以下途徑:活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生、鈣超載、脂質(zhì)過氧化和線粒體功能障礙等。 相關(guān)研究的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)多采用小鼠、大鼠模型,根據(jù)研究目的分為急性損傷模型和慢性損傷模型。

1.1 小鼠模型

由于存在遺傳背景清晰,操作方便,所采集的數(shù)據(jù)指標(biāo)便于分析等有利因素,小鼠模型在腫瘤心臟病學(xué)研究中最為常用。 當(dāng)前大部分研究蒽環(huán)類藥物動(dòng)物模型采用C57BL/6 小鼠,以腹腔注射方式給藥。

1.1.1 非荷瘤小鼠模型

急性損傷模型為短期內(nèi)大劑量給藥:累積劑量20～30 mg/kg 的阿霉素[4-6],在用藥后第1～2 周超聲顯示射血分?jǐn)?shù)比對(duì)照組下降15%～30%,組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞間有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

慢性損傷模型的給藥方案在不同課題組差異較大:給藥時(shí)間大約為2～12 周,累積劑量18～36 mg/kg 不等[7-12]。 觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)差異也較大(4～13周),這與給藥方案及檢測(cè)手段的不同有關(guān),實(shí)驗(yàn)結(jié)果超聲示左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS) 比對(duì)照組下降10% ～20%,心肌壞死標(biāo)志物升高等表現(xiàn)。 較溫和的給藥方案如3 mg/kg,每周1 次,持續(xù)12 周;與5 mg/kg,每周1 次,持續(xù)4 周相比,其監(jiān)測(cè)心臟毒性的時(shí)間點(diǎn)較長(zhǎng)(12 周 vs.4 周);同樣Noel 等[8]采用每周注射3 mg/kg 的用藥方案,心臟磁共振(cardiac magnetic resonance imaging,CMR)在第4 周發(fā)現(xiàn)異常,有明顯的細(xì)胞外體積分?jǐn)?shù)(extracellular volume fraction,ECV)增加,整體縱向應(yīng)變(global longitudinal strain,GLS)惡化,而另一課題組超聲在第12 周監(jiān)測(cè)到心臟損傷,提示采用磁共振可更早監(jiān)測(cè)到心臟損傷[11]。

比較不同課題組采取相同的給藥方式得出的結(jié)果發(fā)現(xiàn)[7,9],以5 mg/kg 的劑量,每周給藥1 次,累積20 mg/kg 的用藥方案,可在第4 周超聲檢測(cè)到心臟損傷,能獲得較穩(wěn)定的腫瘤心臟病動(dòng)物模型,降低小鼠死亡率,縮短模型建立時(shí)間。

雖然是同種系小鼠,但在不同研究中存在周齡、體重不同,及實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)條件等差異,導(dǎo)致小鼠對(duì)藥物的耐受性不同,所以需要更多的研究探索,盡可能控制各項(xiàng)可變因素,以建立合適的建模方案。

1.1.2 荷瘤小鼠模型

荷瘤鼠模型較非荷瘤鼠模型能夠更好地模擬腫瘤患者的真實(shí)情況,可同時(shí)觀察化療藥對(duì)腫瘤的治療效果及對(duì)心血管的影響。 然而由于操作較復(fù)雜,當(dāng)前檢索到6 篇蒽環(huán)類藥物的荷瘤鼠模型,其中有5 篇乳腺癌模型[13-16],1 篇為肉瘤模型[17]。

乳腺癌模型中,多數(shù)報(bào)道選擇同種鼠源4T1 乳腺癌細(xì)胞,BALB/c 小鼠乳腺脂肪墊原位或皮下成瘤,其中兩項(xiàng)研究采用10 mg/kg 大劑量短時(shí)間給藥,累積20～30 mg/kg,在第2～3 周出現(xiàn)心肌損傷[14,16];另一項(xiàng)研究采用4 mg/kg,每周給藥1 次,持續(xù)3 周,在第6 周檢測(cè)到心肌損傷[15]。

采用C57BL/6 小鼠,E0771 乳腺癌細(xì)胞成瘤,成瘤后腹腔注射阿霉素5 mg/kg,每周給藥1 次,持續(xù)3 周,于第3～4 周檢測(cè)到心臟損傷[16]。 與非荷瘤C57BL/6 小鼠模型相比,荷瘤鼠心肌損傷出現(xiàn)的時(shí)間較早。

另有一項(xiàng)報(bào)道中,為研究人源乳腺癌,將人乳腺癌細(xì)胞TB474 接種于免疫缺陷BALB/c 小鼠建模[13],成瘤后DOX 5 mg/kg,每周給藥1 次,累積劑量40 mg/kg,于第16 周檢測(cè)到心臟損傷。

肉瘤模型為KM 鼠,采用鼠源S180 肉瘤細(xì)胞,皮下成瘤,每 d 給藥2 mg/kg,,持續(xù)10 d,成功建立急性心臟損傷模型[17]。

以上荷瘤鼠動(dòng)物模型首先要成瘤,然后給予抗腫瘤藥,可觀察藥物對(duì)腫瘤和心血管的作用,對(duì)于同時(shí)研究抗癌作用和心臟保護(hù)治療提供了較為適宜的模型手段。 但由于當(dāng)前報(bào)道較少,尚需要進(jìn)行更多的探索,以尋找合適的建模方案(見表1)。

首先就是開展新型職業(yè)農(nóng)民培育和培養(yǎng)工作，使農(nóng)民能夠通過高質(zhì)量的科技教育培訓(xùn)，掌握現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)和經(jīng)營(yíng)管理理念，摒棄以往的陳舊生產(chǎn)觀念，提升農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的整體效率。

表1 蒽環(huán)類小鼠動(dòng)物模型Table 1Anthraceneclinemouse animal model

1.2 大鼠模型

與小鼠相比,大鼠體積大,影像學(xué)觀察更為清楚,解剖操作方便直觀,存活率也較高。 同樣,由于操作簡(jiǎn)便,大鼠的非荷瘤模型較荷瘤模型應(yīng)用廣泛。 Wistar 大鼠,SD 大鼠和Fischer(F344)大鼠均有應(yīng)用,其中Wistar 大鼠使用較多(見表2)。

用藥方案多采用每隔1～3 d 腹腔注射1 次,累積9～18 mg/kg,心肌損傷指標(biāo)的檢測(cè)時(shí)間在第13～14 天[18-22]。 Sergazy 等[22]采用單次大劑量(8 mg/kg)注射后第8 天檢測(cè)到心肌損傷血清標(biāo)志物的異常。

有兩項(xiàng)研究采用尾靜脈注射的給藥方式:小劑量多次給藥(1.5 mg/kg,累積9 mg/kg)于第51 天檢測(cè)到LVEF 降低[19]。 單次尾靜脈注射阿霉素5 mg/kg,第70 天超聲出現(xiàn)肥厚型心肌病和擴(kuò)張型心肌病兩種變化[20]。 提示蒽環(huán)類藥的慢性心臟毒性不容忽視。

Todorova 課題組的研究中構(gòu)建了大鼠荷瘤模型:Fischer(F344)大鼠同種乳腺癌MatBIII 細(xì)胞,乳腺脂肪墊接種成瘤。 急性損傷模型采用單次腹腔給藥12 mg/kg,3 d 后觀察到出現(xiàn)急性心臟損傷[23];慢性損傷模型腹腔注射2 mg/kg,1 周2 次,累積12 mg/kg,于3 周后檢測(cè)到心臟功能及心肌細(xì)胞毒性改變[24]。

總的來說,當(dāng)前蒽環(huán)類腫瘤心臟病學(xué)動(dòng)物模型研究較多,但仍需在不同課題組間進(jìn)行比較,尋找穩(wěn)定統(tǒng)一的建模方案,以利于課題組間進(jìn)行研究結(jié)果的比較(見表2)。

表2 蒽環(huán)類大鼠動(dòng)物模型Table 2 anthracycline rat model

2 免疫抑制劑類動(dòng)物模型

最近幾年臨床病例顯示,免疫檢查點(diǎn)抑制劑(checkpoint inhibitors,ICIs)能夠有效的提高晚期腫瘤患者的生存率。 然而免疫抑制療法的心血管損傷也不容忽視,其中最顯著的損傷就是急性心肌炎[25],對(duì)其機(jī)制的研究引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。Tay[26]等 和Liu 等[27]的研究中采用了荷瘤小鼠模型,分別皮下注射黑色素瘤細(xì)胞和結(jié)腸癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞建立荷瘤模型,腹腔注射給藥,PD-L1 抗體每只100～150 μg,PD-1 抗體每只200～250 μg,在第1 d天觀察到心肌標(biāo)志物的異常升高,成功構(gòu)建腫瘤心臟病動(dòng)物模型。 Michel 等[28]為了研究抗PD-1 療法在治療黑色素瘤中的心臟毒性作用,每隔1 d 腹腔注射250 mg PD-1 抗體,注射6 次后檢測(cè)到小鼠LVEF 下降,整體徑向應(yīng)變下降51%。 在非荷瘤鼠模型的構(gòu)建中,陳振寅等[29]綜合考量小鼠的存活率和臨床患者的用藥劑量分析,實(shí)驗(yàn)得出最適宜的建模方案為尾靜脈注射抗PD-L1 10 mg/kg 或抗PD-1 12.5 mg/kg ,每周1 次,在第4 周超聲示LVEF,LVFS 下降,誘發(fā)心血管損傷。 也有課題組在第1 天和第14 天分別腹腔注射PD-1 抗體5 mg/kg,在第28 天超聲觀察到LVEF 和LVFS 下降[30-31]。

3 抗血管生成靶向藥物類動(dòng)物模型

新生血管的生成在腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散起著至關(guān)重要的作用,因此血管生成抑制劑在抗腫瘤治療中應(yīng)用較為廣泛。

研究報(bào)道此類的抗腫瘤藥可以誘發(fā)心力衰竭,高血壓,QT 間期延長(zhǎng)和室性心律失常[32]。 當(dāng)前研究主要針對(duì)血管生成抑制劑舒尼替尼和大分子單抗靶向藥貝伐單抗展開,均采用小鼠非荷瘤模型:舒尼替尼25～50 mg/kg,每天灌胃給藥持續(xù)2～6周[33-36]。 貝伐單抗每周靜脈給藥10 mg/kg,累積劑量20～40 mg/kg[35-36]。 小鼠模型出現(xiàn)心臟毒性的最早時(shí)間在用藥后的第2 周,表現(xiàn)為超聲顯示LVEF下降,血清肌鈣蛋白水平增高,血壓增高等變化。

4 抗HER-2 單克隆抗體類動(dòng)物模型

單克隆抗體曲妥珠(赫賽汀)靶向抑制HER-2蛋白,在HER-2 過表達(dá)的乳腺癌、胃癌等的治療中較多應(yīng)用,其心臟毒性的發(fā)病率在1.7%～20%。 曲妥珠單抗誘導(dǎo)心臟毒性的小鼠模型中,多采用腹腔注射3～10 mg/kg 的曲妥珠,累積劑量9～20 mg/kg,連續(xù)的超聲檢測(cè),最早在第10 天可觀察到左室舒張末期內(nèi)徑增加, 射血分?jǐn)?shù)下降到 40%[37-40]。Olorundare 等[41]和Beiranvand 等[42]研究中采用大鼠模型,腹腔注射曲妥珠單抗的用量為2.25 ～20 mg/kg,累積劑量在15.75～60 mg/kg 范圍內(nèi),在第7 天出現(xiàn)血清LDH 和肌鈣蛋白水平增高,心肌組織檢測(cè)能看到有明顯的血管充血和冠狀動(dòng)脈微血栓的形成。

5 其他化療藥動(dòng)物模型

腫瘤治療中,各種化療藥的應(yīng)用在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)損傷正常組織,心肌損傷是常見的副作用之一。 多篇研究中構(gòu)建了順鉑急性心臟毒性大鼠模型:腹腔注射單劑量順鉑7 mg/kg,第5 天與對(duì)照組比較可觀察到心肌標(biāo)志物升高,氧化應(yīng)激標(biāo)志物明顯增加,提示出現(xiàn)心肌損害[43-45]。 Zhao等[46]用小鼠建立慢性模型,腹腔注射3～6 mg/kg 的順鉑,每周1 次,累積劑量為9 或18 mg/kg,于第24天發(fā)現(xiàn)3 mg/(kg·d)的小鼠心肌未見明顯改變,而6 mg/(kg·d)的小鼠超聲發(fā)現(xiàn)有收縮和舒張功能受損。

烷基化劑環(huán)磷酰胺也是常用的化療藥物,臨床研究發(fā)現(xiàn),可誘發(fā)心肌病,心包炎甚至充血性心衰。Senthilkumar 等[47]和Viswanatha 等[48]均采用雄性Wistar 大鼠建模,分別腹腔注射150 或200 mg/kg環(huán)磷酰胺,于用藥的第10、12 天檢測(cè)到血清學(xué)心肌損傷指標(biāo)出現(xiàn)異常。

以上傳統(tǒng)化療藥及靶向藥物在臨床上引起心臟毒性的概率較蒽環(huán)類藥物低,動(dòng)物模型的研究相對(duì)較少。 需要結(jié)合臨床發(fā)病情況,包括發(fā)病患者的基礎(chǔ)疾病、用藥方案等,歸納其中的規(guī)律,尋找可能的影響因素。 在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)各種影響因素進(jìn)行考量,進(jìn)行更加細(xì)致的研究探索才能建立較穩(wěn)定的腫瘤心臟病模型。

6 放療動(dòng)物模型

放射治療在晚期乳腺癌和一些胸部腫瘤中起到不可或缺的作用,然而超過一半的患者會(huì)發(fā)生輻射誘發(fā)的心臟功能障礙包括心包炎、缺血性心臟病、心肌纖維化,及心臟瓣膜異常 。 放療模型一般選用嚙齒類動(dòng)物,10～12 周的成年雌性大鼠接受單劑量24 Gy 心臟輻射治療,CMR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在放療后10 周出現(xiàn)心肌應(yīng)變惡化,心肌水腫[49]。 Lee 等[50]采用小鼠連續(xù)5 d 接受每日2 Gy 的照射,10 Gy 為1個(gè)療程,5 個(gè)療程,總累積劑量為50 Gy,在照射后的18 個(gè)月小鼠心臟組織學(xué)顯示心肌纖維化。

7 小結(jié)與展望

腫瘤心臟病學(xué)作為新型交叉學(xué)科,近年來受到越來越多心血管和腫瘤學(xué)專家的關(guān)注,但學(xué)科發(fā)展仍處于起步階段,相關(guān)動(dòng)物模型的研究尚存在較多問題,不同研究團(tuán)隊(duì)采用的建模方式差異較大,不利于課題組間研究結(jié)果的相互比較。

當(dāng)前最常見腫瘤心臟病學(xué)動(dòng)物模型為嚙齒類動(dòng)物模型,但大部分研究采用的非荷瘤鼠建模,雖然取得了一定的研究成果,但與荷瘤鼠模型相比,后者具有以下優(yōu)勢(shì):更能真實(shí)反映臨床患者體內(nèi)的情況;荷瘤鼠模型考慮了腫瘤本身對(duì)心臟的影響和抗腫瘤藥代謝的影響,可同時(shí)評(píng)估藥物的抗腫瘤和心血管毒性作用,精確反映抗腫瘤藥在體內(nèi)的作用及分子機(jī)制;更有助于尋找理想的心血管保護(hù)藥物:具有心血管保護(hù)作用的同時(shí)與抗腫瘤藥物無(wú)拮抗作用。

嚙齒類腫瘤心臟病學(xué)動(dòng)物模型也存在部分不足:(1)動(dòng)物心臟的重量、心肌結(jié)構(gòu)、心率、心肌離子通道的狀態(tài)等方面與人類相比仍然有較大的差異。心血管表型的嚴(yán)重程度可能根據(jù)所使用的動(dòng)物品系的遺傳背景不同而不同,同樣動(dòng)物模型和人類患者的臨床觀察之間仍可能存在平移差距,例如,伊馬替尼在嚙齒類動(dòng)物中引起心肌病,但在患者中似乎沒有同樣的效果。 未來可采用豬、猴等大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來彌補(bǔ)這一不足。 (2)人類的一些基礎(chǔ)性疾病如高血壓,糖尿病等尚未在動(dòng)物模型中有很好的體現(xiàn)。 可在建立穩(wěn)定的荷瘤鼠心臟病模型的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步引入以上基礎(chǔ)性疾病,建立更精細(xì)的動(dòng)物模型。 同時(shí)在抗腫瘤藥的給藥方式、劑量,成瘤部位,心臟保護(hù)藥物的給藥時(shí)間點(diǎn)等方面進(jìn)行細(xì)致考量。

總之,對(duì)于新興學(xué)科腫瘤心臟病學(xué),未來發(fā)展?jié)摿薮?但由于相關(guān)研究相對(duì)較少,加之存在腫瘤、抗腫瘤方案、患者的基礎(chǔ)疾病等的復(fù)雜多樣的影響因素,建立穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型是任重而道遠(yuǎn),隨著各種實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展和檢測(cè)水平的提高,相信腫瘤心臟病學(xué)的動(dòng)物模型將會(huì)更加完善,更貼切地模擬臨床特征。