冠心病氣虛血瘀證模型大鼠與臨床患者舌象特征的比對研究

王瑾茜雷詩卉李 薇楊 蕙楊 益劉 侃藺曉源胡國恒郭 純陳 亞*

(1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,長沙 410007;2.湖南中醫(yī)藥大學,長沙 410208)

冠心病(coro nary heart disease,CHD)是一種復雜的慢性炎癥性疾病,其原因多因向心臟供氧的冠狀動脈發(fā)生狹窄和重塑所致[1]。 中醫(yī)將CHD 歸屬于“胸痹”、“心痛”和“厥心痛”等范疇,氣虛血瘀作為本病的主要病機,是中醫(yī)界研究的熱點[2]。 病證結(jié)合動物模型作為從中醫(yī)臨床走向基礎研究的樞紐,對于揭示中醫(yī)證候的本質(zhì)具有重要意義[3]。 本課題組前期建立了CHD 氣虛血瘀證病證動物模型,并且對模型大鼠的舌質(zhì)、舌色進行了定性、定量分析,但對模型舌圖像的判定缺乏與臨床患者之間的擬合校對,模型的可靠度有待進一步認證[4]。 因此,探討CHD 氣虛血瘀證動物模型與臨床患者的舌象特征是否吻合,是本課題組需要重點研究的內(nèi)容。 基于隨機森林(random forest,RF)算法的圖像分類識別系統(tǒng)具有抗噪聲能力強、訓練速度快等優(yōu)勢,滿足動物模型與臨床患者舌圖像復雜的識別要求[5]。 針對本課題組前期研究工作的不足,本研究建立了一種CHD 氣虛血瘀證大鼠模型與臨床患者之間舌圖像的校對方法,首先運用matlab 軟件將CHD 氣虛血瘀證臨床患者舌體進行分割,提取舌質(zhì)顏色、舌苔顏色、裂紋比例和齒痕圓形度等舌圖像特征,篩選出證型的特異性指標,運用RF 模型分類識別臨床全樣本,通過制作受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)以評估模型的預測價值,并計算ROC 曲線下方的面積(area under curve,AUC)以判定各指標的診斷價值。隨后通過并評估模型的預測價值及各指標的診斷價值以驗證在CHD 氣虛血瘀證患者舌象提取的特異性指標在模型大鼠舌象中是否存在意義。 本研究旨在尋求CHD 氣虛血瘀證模型大鼠與臨床患者的舌圖像之間是否存在共通的特異性指標,以期為病證結(jié)合動物模型的可靠性提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

16 周齡清潔級雄性SD 大鼠50 只,體重在(280±20)g 之間,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2019-0004],飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院SPF 級動物房[SYXK(湘)2020-0010]。 實驗動物飼養(yǎng)條件為:18℃～21℃,濕度保持40%～70%,環(huán)境空氣控制為每分鐘換氣10 次;保持每天12 h 光照和12 h 黑暗環(huán)境。 本文涉及的實驗動物,均經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學倫理委員會監(jiān)管和批準實施(IACUC20201010-3),實驗過程遵循3R 原則。

1.1.2 臨床樣本

模型訓練與測試過程中,采用的臨床樣本由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院老年病科陳亞主治醫(yī)師提供。 共包含99 個實例樣本。 本文涉及的臨床樣本,均經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學倫理委員會監(jiān)管和批準實施(IACUC2020605C)。

1.2 主要試劑與儀器

注射用青霉素鈉(華北制藥,86347);異氟烷(瑞沃德,03121)。 ALC-V10 型小動物呼吸機購自中國奧爾科特公司;BL-420 型心電圖機購自中國泰盟公司;NikonZ50 型微單相機購自日本尼康公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 臨床診斷標準

(1)CHD 診斷:參照1979 國際心臟病學會和協(xié)會及世界衛(wèi)生組織(WHO)臨床命名標準化聯(lián)合專題報告關(guān)于CHD 命名及診斷標準的建議。 (2)氣虛血瘀證辨證:參照《中華人民共和國中醫(yī)藥行業(yè)標準·中醫(yī)病證診斷療效標準》所制定的標準。(3)健康人確定:排除各類心腦血管疾病、各項檢查均證實為健康人。

1.3.2 臨床樣本拍攝標準

患病組49 例,健康組50 例。 規(guī)定早上8:00 為統(tǒng)一觀察時間點,于實驗室固定點拍攝,被測者采取坐位,面對自然光線,伸舌時將舌體伸出口外,舌體放松,舌尖自然下垂。

1.3.3 動物分組及實驗干預

大鼠隨機分為2 組:正常組、模型組。 每組各25 只。 正常組大鼠正常飼養(yǎng),模型組于實驗第1～21 天采用“力竭+控食”制備氣虛血瘀證證候模型,如圖1A。 于實驗第22 天采用“冠狀動脈左前降支結(jié)扎法”制備冠心病病理模型,如圖1B。 造模結(jié)束后,模型組大鼠恢復正常飲食、作息,期間不采用任何造模手段,模型組大鼠狀態(tài)及心電圖變化如圖1C、圖1D。 以第25 天上午8:00 為統(tǒng)一觀察時間點,麻醉后即刻暴露大鼠舌體,面對自然光線進行拍攝。

圖1 冠心病氣虛血瘀證動物模型制備方法Figure 1 Preparation method of animal model of CHD with Qi deficiency and blood stasis syndrome

1.3.4 舌圖像分割

包括舌體分割、舌質(zhì)舌苔分離兩個階段。

(1)舌體分割

運用I 分量和Cb 分量的運算處理,得到舌體初始輪廓;采用otsu 方法計算圖像最佳閾值。 按閾值進行二值化,計算公式為I/10+CB×7/10,提取出舌體區(qū)域,獲得二值化后舌體輪廓。

(2)舌質(zhì)舌苔分離

將原始圖片進行濾波降噪處理,并進行填充,采用快速K 均值聚類方法灰度化圖片,將RGB 圖像顏色實現(xiàn)量化線性轉(zhuǎn)換,將原始圖片進行濾波降噪處理,并進行填充,采用K-均值聚類方法,最后將聚類結(jié)果展示出來。

1.3.5 特征提取

對舌質(zhì)顏色、舌苔顏色、裂紋、齒痕特征進行提取。

(1)顏色特征提取

舌圖像顏色包括兩部分:舌質(zhì)顏色和舌苔顏色。 在提取過程中選用HSI 顏色空間作為顏色特征空間。 完成對舌質(zhì)色調(diào)分量(H)、飽和度(S)分量及舌苔色調(diào)分量(H)的提取,并將舌質(zhì)顏色的色調(diào)分量(H)和飽和度(S)分別賦值給M1、M2,舌苔顏色的色調(diào)分量(H)賦值給M3。

(2)裂紋特征提取

裂紋一般出現(xiàn)在舌中區(qū)域。 將舌體切割為九份,取正中的一份,對黑色部分占總體的占比進行計算,并賦值給M4。

(3)齒痕特征提取

通過舌體的圓形度特征檢測舌體邊緣是否存在齒痕情況,計算區(qū)域圓度(circularity),并賦值給M5。

1.3.6 RF 分類及預測價值

將每樣本篩選后得到的特異性指標作為集合賦值給XX,采用遞歸分割思想,將XX 分割成兩份子樣本集,根據(jù)訓練集數(shù)據(jù)訓練分類模型和根據(jù)分類模型識別測試集(predX)類別。 將隨機性分類(YY)設置為1、2 兩類,其中1 代表CHD 氣虛血瘀證,2 代表正常。 運用對數(shù)據(jù)進行自舉的方式分別抽取總樣本的80%例樣本作為訓練集,將RF 決策樹數(shù)目設置成500,對樣本集進行抽樣訓練。 得出RF 模型的預測結(jié)果與實際結(jié)果對比,計算RF 模型判別的最佳界值、敏感度、特異性、準確率、圓周卷積、AUC。 并得出各特異性指標的ROC。 具體流程如圖2 所示。

圖2 臨床樣本與動物模型的比對分析Figure 2 Comparative analysis of clinical samples and animal models

1.4 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件prism 9.3.1 和matlab 分析實驗數(shù)據(jù),根據(jù)不同的數(shù)據(jù)特點采用不同的檢驗法:計數(shù)資料采用χ2檢驗;計量資料以平均數(shù)±標準差(±s)表示,如果滿足正態(tài)及方差齊性,采用成組t檢驗,不滿足者采用秩和檢驗,P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。 matlab 負責數(shù)字森林法數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 冠心病氣虛血瘀證臨床樣本舌圖像識別

2.1.1 舌圖像分割

(1)舌體分割

在舌圖像色差校正階段,統(tǒng)一色差值為7.05。在舌圖像分割和苔質(zhì)分離階段,設定聚類區(qū)域數(shù)目為2,得到舌體分割結(jié)果如圖3 所示。

圖3 臨床樣本舌質(zhì)分離Figure 3 Tongue separation of clinical samples

(2)舌質(zhì)特征提取與分析

分別提取出舌苔區(qū)域、舌質(zhì)區(qū)域、裂紋區(qū)域、齒痕區(qū)域,如圖4A 所示。 通過對舌質(zhì)H 分量(M1)、舌質(zhì)S 分量(M2)、舌苔H 分量(M3)、裂紋特征(M4)、齒痕特征(M5)指標的對比,發(fā)現(xiàn)兩組間M1、M2、M3、M5特征值均存在顯著性差異(P<0.01),M4不存在統(tǒng)計學差異(P=0.4909>0.05)。 如圖4B所示。

圖4 臨床樣本舌質(zhì)特征提取與分析Note. A, Feature separation of tongue image. B, Comparison of M1～M5 eigenvalues of tongue images. Compared with the eigenvalues of the normal group,**P<0.01.Figure 4 Tongue feature extraction and analysis of clinical samples

(3)構(gòu)建模型的參數(shù)

篩選出表中的4 個指標作為構(gòu)建RF 預后模型的特異性參數(shù)。 如表1 所示。

表1 篩選后得到的特異性指標Table 1 Specific indexes obtained after screening

2.1.2 RF 模型預測的結(jié)果

運用四格表及ROC 確定RF 模型判別FPR 為15.2%,TPR 為83.3%,判別CHD 氣虛血瘀證患者的最佳界值為0.5,敏感度為81.4%,特異性為76%,準確率為85.7%,圓周卷積為0.6991,AUC 為0.8151。 如表2、表3 所示。 RF 在給出預測結(jié)果的同時,同樣計算出各變量AUC 曲線下面積,得出各變量均具有診斷價值,其中M1、M2、M5的AUC 值均在0.9 以上,提示診斷價值較高,M3的AUC 值在0.7～0.9 之間,提示診斷價值中等。 如圖5 所示。

圖5 RF 預測變量的ROC 曲線Note. RF, Random forest model. a, M1 characteristic value. b, M2 characteristic value. c, M3 characteristic value. d, M5 characteristic value. AUC, Area under curve.Figure 5 ROC curve of RF predictive variables

表2 RF 模型的預測結(jié)果與實際結(jié)果對比Table 2 Comparison between prediction results of random forest model and actual results

表3 RF 法模型的預測價值Table 3 Prediction value of random forest method model

2.2 RF 法預測動物模型

2.2.1 舌圖像分割

(1)舌體分割

在舌圖像色差校正階段,統(tǒng)一色差值為7.05。在舌圖像分割和苔質(zhì)分離階段,設定聚類區(qū)域數(shù)目為2,得到舌體分割結(jié)果。 如圖6 所示。

圖6 大鼠樣本舌質(zhì)分離Figure 6 Separation of tongue substance

(2)舌質(zhì)特征提取

分別提取正常大鼠與冠心病氣虛血瘀證病證結(jié)合模型大鼠舌質(zhì)H 分量(M1)、舌質(zhì)S 分量(M2)、舌苔H 分量(M3)及齒痕特征(M5),如圖7A 所示。兩組間M1、M2、M3特征值存在顯著性差異(P<0.01),M5特征值存在統(tǒng)計學差異(P<0.05),如圖7B 所示。

圖7 舌質(zhì)特征提取與分析Note. A, Tongue image feature separation. B, Compared with the eigenvalues of the normal group,**P<0.01.Figure 7 Tongue feature extraction and analysis

2.2.2 RF 法模型的預測價值

運用RF 法得出AUC 曲線下面積、敏感性、特異性、準確率及圓周卷積如下表。 運用四格表及受試者工作曲線(ROC 曲線)確定RF 模型判別FPR為14.8%,TPR 為83.1%,判別CHD 氣虛血瘀證模型的最佳界值為0.5,敏感度為81.8%,特異性為75.6%,準確率為83.1%,圓周卷積為0.6451。 如表4、表5 所示。 RF 在給出預測結(jié)果的同時,同樣計算出各變量AUC 曲線下面積,得出各變量均具有診斷價值,其中M1、M2、M5的診斷價值較高,M3的診斷價值中等。 如圖8 所示。

圖8 RF 預測變量的ROC 曲線Note. RF, Random forest model. a, M1 characteristic value. b, M2 characteristic value. c, M3 characteristic value. d, M5 characteristic value. AUC, Area under curve.Figure 8 ROC curve of RF predictive variables

表4 RF 模型的預測結(jié)果與實際結(jié)果對比Table 4 Comparison between prediction results of random forest model and actual results

表5 RF 法模型的預測價值Table 5 Prediction value of random forest method model

3 討論

在中國,CHD 是導致死亡的主要原因之一[6],最近一項研究報告表明,從2010 年到2030 年,CHD患者復發(fā)和死亡的風險將增加3.3 倍[7]。 中醫(yī)藥被廣泛用于預防和治療CHD,并在我國臨床實踐中已顯示出良好的療效[8]。 流行病學調(diào)查表明,氣虛血瘀證是CHD 患者中最突出的證候[9]。 然而目前關(guān)于CHD 氣虛血瘀證的客觀化研究甚少。 動物模型作為實驗假說和臨床假說的基礎,是生物醫(yī)學科學研究中所建立的具有人類疾病模擬性表現(xiàn)的觀察對象和材料。 病證結(jié)合動物模型作為目前而言最適合中醫(yī)藥研究的模型,是中醫(yī)從臨床走向基礎研究的樞紐。

課題組前期建立了CHD 氣虛血瘀證病證結(jié)合大鼠模型,參照“舌質(zhì)RGB 數(shù)據(jù)分布范圍表”對舌色RGB 值評估,發(fā)現(xiàn)該模型大鼠較正常大鼠舌面R、G、B 值下降且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);采用HE 染色發(fā)現(xiàn)模型大鼠較正常大鼠舌面絲狀乳頭的角化層、上皮層高度降低、固有層微血管數(shù)量增加,且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 上述結(jié)果均符合2002 年版《中藥、天然藥物治療冠心病心絞痛的臨床研究指導原則》CHD 氣虛血瘀證“舌淡紫、苔薄白”的舌象特征。 此外,前期研究采用免疫組織化學法發(fā)現(xiàn)模型大鼠舌尖組織絲狀乳頭固有層PGI2水平下降、TXA2水平上升,且與正常組比較,TXA2、T/P 比值變化明顯(P<0.05),提示該模型具備氣虛血瘀證的分子學特點。 但由于動物與人之間的差異性(包括大鼠本身舌的結(jié)構(gòu)、色彩特點),我們很難切實從單純的色彩維度完成模型與臨床患者之間的比對[10],如何在兩組數(shù)據(jù)中提取出潛在信息和特征指標,并將不同生物體中的生物學特征通過信息化處理的方式相互關(guān)聯(lián),進而分析CHD 氣虛血瘀證模型大鼠與臨床患者舌象特征指標間的吻合程度,是目前課題組亟待解決的問題。 RF 作為新興起的、高度靈活的一種機器學習算法,可通過捕捉圖像中的信息,建立數(shù)據(jù)與生物特征之間的關(guān)系,最終實現(xiàn)判別定性,目前已被廣泛應用于生物醫(yī)學領域[11-14]。 秉承“從臨床中來,到臨床中去”的研究理念,本研究運用RF 從CHD 氣虛血瘀證患者及CHD 氣虛血瘀證模型大鼠舌圖像中的舌質(zhì)顏色特征、舌苔顏色特征、裂紋特征、齒痕特征等舌診客觀化參數(shù)中尋求共同的特異性指標,以期通過信息化處理的方式判斷CHD 氣虛血瘀證模型與臨床患者舌象特征的吻合程度,進一步確定模型的可靠性。

本研究從臨床患者的舌診圖像出發(fā),運用matlab 軟件對舌圖像做舌體分割及苔質(zhì)分離,提取出舌質(zhì)顏色特征、舌苔顏色特征、齒痕特征、裂紋特征,并分別將參數(shù)賦值給M1～M5,使用t檢驗和卡方檢驗對二分類指標進行了初步篩選,得到了與CHD 氣虛血瘀證診斷密切相關(guān)的相關(guān)參數(shù)4 個,分別是M1、M2、M3和M5,隨后將臨床樣本集的所有舌診圖像的M1、M2、M3、M5作為集合賦值給X,用RF構(gòu)建分類模型并完成模型的訓練識別,得出假陽性率(false positive rate,FPR)為15.20%,真陽性率(true positive rate,TPR)為83.30%,AUC 為0.8151,最佳界值為0.5,敏感度為81.80%,特異性為75.60%,準確率為83.10%,圓周卷積為0.6451。本研究通過計算出各變量AUC,得出各變量均具有診斷價值,其中M1、M2、M5的診斷價值較高(0.9 以上),M3的診斷價值中等(0.7～0.9)。 RF 法不僅確保了操作規(guī)程的質(zhì)量控制與結(jié)果的真實性,且操作相對簡單,可以提高篩選參數(shù)的效率,并且可以充分體現(xiàn)在matlab 軟件運算環(huán)境下RF 法的運算速度及精度[15]。 隨后本研究對冠心病氣虛血瘀證大鼠模型的舌圖像做了進一步分析,使用t檢驗和卡方檢驗驗證了M1、M2、M3、M5特征值在大鼠模型上亦存在顯著性差異(P<0.05,P<0.01),采用特異性指標M1、M2、M3、M5建立數(shù)據(jù)集。 完成冠心病氣虛血瘀證動物模型的分類識別,驗證隨機森林識別法準確率為85.69%, 敏感度為81.8%, 特異性為75.60%,說明RF 預測模型的可靠性。 再結(jié)合預測結(jié)果發(fā)現(xiàn),M1、M2、M5的診斷價值較高(0.9 以上),M3的診斷價值中等(0.7～0.9)。 得出M1、M2、M3、M5特征值作為CHD 氣虛血瘀證臨床樣本和動物模型的特異性指標的可行性。 揭示了CHD 氣虛血瘀證大鼠模型與臨床患者在舌象特征方面的相似度高,可為今后藥效評價提供模型的診斷支持。