菜用大豆炭疽病病原菌的分離鑒定與防治

劉 娜，范翹楚，周 佳，宋雅靜，張古文，馮志娟，卜遠鵬，王 斌，龔亞明

(農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室，浙江省農(nóng)業(yè)科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

菜用大豆，又稱鮮食大豆，俗稱毛豆，指在豆莢呈綠色、籽粒尚未達到完全成熟、生理上處于鼓粒盛期采收用作蔬菜食用的大豆，是一種重要的傳統(tǒng)豆類蔬菜[1-4]。菜用大豆因口感好且營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛。隨著人們飲食觀念的更新，健康意識的不斷增強，菜用大豆又被作為一種健康食品和保健蔬菜，愈加受到大眾喜愛，市場前景十分廣闊。目前，我國菜用大豆年種植面積40萬hm2左右，總產(chǎn)量超過400萬t，年產(chǎn)值約100億元，是世界上最大的菜用大豆生產(chǎn)國和速凍加工出口國。在我國東南沿海各省，菜用大豆是農(nóng)業(yè)出口創(chuàng)匯的重要新興產(chǎn)業(yè)。浙江省由于獨特的氣候優(yōu)勢和區(qū)位優(yōu)勢，成為優(yōu)質(zhì)菜用大豆生產(chǎn)的主要區(qū)域。近年來，浙江省菜用大豆年種植面積在8萬hm2左右，年產(chǎn)值20億元以上，產(chǎn)業(yè)規(guī)模穩(wěn)居全國首位。菜用大豆產(chǎn)業(yè)已成為目前我國大豆產(chǎn)業(yè)新的經(jīng)濟增長點，亦是搶占國際大豆產(chǎn)業(yè)制高點的新突破口。近年來，隨著菜用大豆產(chǎn)業(yè)規(guī)模化、區(qū)域化、集約化生產(chǎn)體系形成，突顯了一系列問題，制約了產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展，主要表現(xiàn)在主栽品種單一、老化、復種指數(shù)高和輪作困難，菜用大豆生產(chǎn)中各種病害威脅日益嚴重，特別是炭疽病，破壞力強，發(fā)病時在豆莢表面形成黑色斑點，嚴重影響鮮莢外觀商品性和品質(zhì)，已成為我國菜用大豆生產(chǎn)面臨的主要問題之一，危害巨大[5-6]。

植物炭疽病是世界性病害之一，主要由炭疽病屬(Colletotrichum)真菌引起，可侵染植物的所有部位，尤其是地上部位。菜用大豆炭疽病在整個生育期都可發(fā)生，尤其是在結(jié)莢至釆收期發(fā)生最為嚴重，致其產(chǎn)量和品質(zhì)大大降低。在高溫高濕條件下病菌生長迅速，隨著豆莢的長大，病斑會慢慢地擴大，最終呈條狀或不規(guī)則形狀，病斑的顏色由褐色變?yōu)辄S褐色或紅銹色，與銹狀斑極為相似，因此在許多地方被誤認為是菜用大豆銹病[5]。據(jù)前人報道，引起菜用大豆炭疽病的病原菌主要有平頭炭疽菌(Colletotrichumtruncatum)、毀滅炭疽菌(C.destructivum)、毛核炭疽菌(C.coccodes)、膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)及禾谷炭疽菌(C.graminicola)等[7-9]。可見引起菜用大豆炭疽病的病原菌種類較多且復雜，準確鑒定病原菌種類對于致害機制研究及精準防控極為重要。炭疽病防治非常困難，生產(chǎn)上存在濫用化學農(nóng)藥、病原菌出現(xiàn)嚴重的抗藥性、環(huán)境污染等一系列問題[10-11]。本文以浙江省內(nèi)發(fā)現(xiàn)的炭疽病病株為材料，進行病原菌的分離、純化、形態(tài)學特征觀察和分子生物學鑒定，以明確病原真菌的種類，并測定了多菌靈和戊唑醇的化學防治效果，為生產(chǎn)上防治菜用大豆炭疽病的科學用藥提供重要指導。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集、病原菌的分離與純化

菜用大豆病株采自浙江省農(nóng)業(yè)科學院海寧楊渡科研創(chuàng)新基地，共采集10份樣品，帶回實驗室后置于4 ℃冰箱備用。采用組織分離法分離病原菌，將疑似菜用大豆炭疽病的新鮮發(fā)病組織清洗干凈，用解剖刀從病健交界處分出0.5 cm×0.5 cm的數(shù)塊小塊。依次用70%乙醇浸泡10 s、4%次氯酸鈉溶液浸泡6 min、滅菌水漂洗3次后，將發(fā)病組織表面水分用吸水紙吸干，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后，根據(jù)形成的菌落特征初步判定病菌的種類。查閱相關(guān)資料對比菌落的形態(tài)特征，將疑似炭疽菌的菌落用解剖刀劃出0.5 cm×0.5 cm的菌塊，然后接到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。純化好的病菌接種PDA斜面培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)后，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌的鑒定

1.2.1 病原菌菌絲體的培養(yǎng)

把保存的菌株接種在PDA平板上，放在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，每天觀察菌落形態(tài)以及顏色特征。

1.2.2 病原菌致病性測定

依據(jù)柯赫氏法則對分離得到的純培養(yǎng)物進行致病性檢測。選取健康的菜用大豆葉片，用大量的無菌水清洗后置于鋪有吸水紙的保鮮盒內(nèi)，用無菌刀片切取菌碟(5 mm×5 mm)，菌絲面朝下，接種到葉片上，重復3次，空白對照為無菌PDA菌碟，接種后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 病原菌菌絲DNA的提取

用滅菌刀片從PDA培養(yǎng)基上收集足夠量的菌絲體，放到研缽里，加入適量的液氮進行充分研磨后，采用生工生物工程(上海)股份有限公司的真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取DNA，經(jīng)電泳檢測和濃度測定后，將DNA保存至-20 ℃的冰箱中備用。

1.2.4 PCR反應(yīng)

以DNA為模板，PCR擴增所用到的引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)的總體積設(shè)置為50 μL，具體包括2×TaqPCR MasterMix 25 μL、模板DNA 1 μL、引物ITS1和ITS4各2 μL、ddH2O補足體積。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)上進行檢測。將PCR擴增產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進行測序。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

從NCBI中選取幾個不同種類的炭疽病菌的rDNA-ITS序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹方法采用鄰接法(neighbor-joining)，自舉檢測(bootstarp)1 000次。

1.3 不同殺菌劑對病原菌的室內(nèi)毒力測定

1.3.1 菌株的準備

PDA培養(yǎng)平板上接入已活化的待測菌株，25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后，用內(nèi)徑5 mm的打孔器沿著菌落邊緣打孔一周，制成菌碟。

1.3.2 測定EC50

采用生長速率測定法測定EC50，所用藥劑為80%多菌靈可濕性粉劑和43%戊唑醇懸浮劑。多菌靈的濃度設(shè)置為：0(對照)、5、10、15、20、25 μg·mL-1，戊唑醇濃度設(shè)置為：0(對照)、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg·mL-1，重復3次。把不同濃度的多菌靈藥液和戊唑醇藥液分別加到60 ℃左右的滅菌PDA培養(yǎng)基中，混勻制成含藥培養(yǎng)基。待平板凝固后把提前準備好的菌碟放入其中，氣生菌絲朝上，每個皿接一個菌碟，進行編號。接好的菌株置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后，用十字交叉測量法測量菌落的大小，取其平均值，與空白組對照比較得到菌落生長抑制率，用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)處理[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

菜用大豆炭疽病在整個生長周期均可發(fā)病，豆莢感病初期病斑呈褐色不規(guī)則點狀，后期逐漸長大，一般病斑中心形成凹陷，凹陷部位呈黑色；葉片感病主要在葉脈上，發(fā)病部位初期變黃，后期擴大成黑褐色不規(guī)則型病斑(圖1)。

圖1 菜用大豆炭疽病發(fā)病植株和不同發(fā)病程度豆莢

2.2 病原菌的菌落形態(tài)鑒定

通過組織分離法從所采集的疑似菜用大豆炭疽病病株上共分離出23個真菌分離物。對病株進行病原菌的分離純化后，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)后可觀察到兩種不同形態(tài)的菌落。第一種菌落是以Cts18為代表的圓形灰白色菌落，邊緣整齊，菌絲為灰白色，菌絲比較集中且呈絮狀(圖2-A)。第二種菌落是以Cts22為代表的菌落，邊緣不規(guī)則，氣生菌絲為白色絨毛狀，較密集，菌落周圍呈棕色(圖2-B)。

A，Cts18的菌落形態(tài)；B，Cts22的菌落形態(tài)。

2.3 病原菌的致病性

病原菌回接實驗結(jié)果顯示，葉片接種后的發(fā)病率為100%。葉片接種培養(yǎng)7 d后，接種病原菌部位葉片呈黑褐色，發(fā)病情況與自然條件下一致；對照組葉片沒有觀察到病斑(圖3)。

A，對照；B，接種Cts18的葉片；C，接種Cts22的葉片。

2.4 病原菌的分子生物學鑒定

以提取的病原菌DNA為模板，用引物ITS1/ITS4進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后均得到一條大小為600 bp左右的清晰條帶(圖4)。將PCR產(chǎn)物測序獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，比對結(jié)果顯示，Cts18與平頭炭疽菌(C.truncatum)的同源性為100%，Cts22與膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的同源性為100%。

圖4 菌株Cts18 和Cts22的ITS區(qū)域PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

從GenBank里挑選出10種其他種類炭疽病病原菌的rDNA-ITS同源序列，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖5可知，Cts18與平頭炭疽菌(C.truncatum)的親緣關(guān)系最近，Cts22與膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的親緣關(guān)系最近，結(jié)合對病原菌菌落形態(tài)的觀測以及在NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST比對結(jié)果，可以確定Cts18是半知菌亞門黑盤孢目炭疽菌屬的平頭炭疽菌(C.truncatum)；Cts22是半知菌亞門黑盤孢目炭疽菌屬的膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)。

圖5 基于ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 不同殺菌劑對病原菌的室內(nèi)毒力測定

為了篩選可以用于防控由平頭炭疽菌Cts18和膠孢炭疽菌Cts22引起的菜用大豆炭疽病的殺菌劑，室內(nèi)試驗測定了這兩個菌株對常用殺菌劑多菌靈和戊唑醇的藥劑敏感性。結(jié)果如表2所示，平頭炭疽菌Cts18和膠孢炭疽菌Cts22對多菌靈的敏感性有顯著差異，Cts18的EC50為2.13 μg·mL-1，而Cts22的EC50為96.12 μg·mL-1。兩株菌對戊唑醇都很敏感，Cts18和Cts22的EC50分別為0.27 μg·mL-1和0.63 μg·mL-1。可見，戊唑醇的抑菌效果優(yōu)于多菌靈。

表2 不同藥劑對Cts18、Cts22的室內(nèi)毒力測定

3 結(jié)論與討論

炭疽菌屬真菌分布廣泛，危害多種栽培植物，如黃瓜、西瓜、火龍果、番木瓜、核桃等[13-17]。

表1 用于系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的炭疽菌菌株的背景及其ITS序列長度

菜用大豆是一種重要的豆類蔬菜，生產(chǎn)上受到炭疽病危害巨大，主要發(fā)病時期為結(jié)莢期和鮮莢采收期，在豆莢表面形成不規(guī)則的黑褐色斑點，嚴重影響其外觀商品性和產(chǎn)量。前人研究表明，引起菜用大豆炭疽病的病原菌種類眾多，而且每一株炭疽病菌在形態(tài)特征、致病性、侵染規(guī)律、抗藥性等方面都不盡相同[7-9]。因此，準確鑒定菜用大豆炭疽病病原菌種類對于其有效防控和致病機理研究以及抗性品種培育至關(guān)重要。本研究對在浙江地區(qū)采集到的疑似菜用大豆炭疽病病株進行病原菌的分離純化鑒定，通過形態(tài)觀察和序列比對，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果鑒定出所采集的炭疽病致病菌為平頭炭疽菌(C.truncatum)和膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)。

生產(chǎn)上炭疽病的防治主要還是依賴化學防治。多菌靈和戊唑醇是目前生產(chǎn)上最常用的殺菌劑，但多菌靈和戊唑醇在國內(nèi)尚未登記用于菜用大豆炭疽病的防治。本文研究了這兩種藥劑對平頭炭疽菌Cts18和膠孢炭炭疽菌Cts22的防治效果。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多菌靈對平頭炭疽菌Cts18和膠孢炭疽菌Cts22的EC50分別為2.13 μg·mL-1和96.12 μg·mL-1，該結(jié)果與霍建飛等[18]用多菌靈處理平頭炭疽菌的毒力測定結(jié)果以及李丹丹等[19]用多菌靈處理膠孢炭疽菌的毒力測定結(jié)果有一定差異，推測可能是不同地區(qū)的菌株對同種藥劑存在抗性差異。戊唑醇對平頭炭疽菌Cts18和膠孢炭疽菌Cts22的EC50分別為0.27 μg·mL-1和0.63 μg·mL-1，與孫行杰等[20]在研究6種殺菌劑對葡萄炭疽病菌的毒力測定中得出的結(jié)論相似。在本研究中平頭炭疽菌Cts18比膠孢炭疽菌Cts22對藥劑更加敏感，且戊唑醇的抑菌效果優(yōu)于多菌靈。本文研究結(jié)果為菜用大豆炭疽病的化學防治和進一步致病機理研究和抗性品種培育奠定了一定基礎(chǔ)。