獼猴桃果實軟化過程中細胞壁多糖物質(zhì)含量與果膠降解相關(guān)酶活性變化

陸玲鴻，馬媛媛，古咸彬，肖金平，宋根華，張慧琴

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，浙江 杭州310021)

果實成熟是一個非常復(fù)雜的遺傳調(diào)控過程，伴隨著生理、生化、物理和風(fēng)味的變化[1]。獼猴桃屬于呼吸躍變型果實，采后極易變軟腐爛，不耐貯藏[2]。獼猴桃果實后熟軟化分為軟化起始、快速軟化、可食和過熟4個階段[3]。研究表明，不同獼猴桃種或品種有相似的果實軟化進程，但是有不同的果實軟化速率[4-9]。美味獼猴桃一般較中華獼猴桃軟化速度慢，更耐貯藏；軟棗獼猴桃軟化最快，貨架期最短。軟棗獼猴桃營養(yǎng)豐富，即食性好，已經(jīng)開始規(guī)?；耘?，發(fā)展迅速[10]，但其低溫貯藏期僅為1～2個月；美味獼猴桃海沃德在0 ℃的貯藏期為4～6個月[11-12]。

細胞壁組分與結(jié)構(gòu)的變化是導(dǎo)致獼猴桃果實軟化的關(guān)鍵因素。細胞壁主要包含多種多糖組分，如果膠、纖維素和半纖維素[13]。果膠是結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的植物細胞壁多糖，在細胞與細胞的黏附中起重要作用。在番茄和許多其他肉質(zhì)水果中，一些與成熟相關(guān)的最顯著的變化發(fā)生在果膠多糖中[14]。研究表明，獼猴桃果實中果膠聚合物和半纖維素的解聚與降解可導(dǎo)致細胞間隙增大和細胞壁結(jié)構(gòu)松動，從而引起獼猴桃果實后熟軟化[15]。

果膠聚合物在果實成熟過程中的降解是幾種果膠代謝酶作用的結(jié)果，其中主要包括果膠甲酯酶(pectin methylesterase，PME)、內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶(endo-polygalacturonase，PG)、果膠酸裂解酶(pectate lyase，PL)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-Gal)和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase，α-AF)等[14，16]。研究表明，果實軟化是多種果膠降解酶綜合作用的結(jié)果，同種果膠降解酶在不同物種的果實軟化中具有不同作用?，F(xiàn)有的研究主要圍繞美味獼猴桃品種展開[17-21]，尚未有對不同貯藏條件、不同種獼猴桃果實細胞壁多糖物質(zhì)與果膠降解酶的相關(guān)研究。有研究表明，PL是影響番茄果實軟化的一個重要因素，但目前對獼猴桃果實PL活性的研究較少[22]。本研究以徐香、金麗、晚綠3個品種獼猴桃果實為試材，測定25 ℃和4 ℃貯藏過程中不同獼猴桃果實的硬度、細胞壁多糖物質(zhì)含量和果膠降解相關(guān)酶活性，并對其進行相關(guān)性分析，為獼猴桃果實采后軟化機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為商業(yè)采收期采摘的3個品種獼猴桃果實，即徐香、金麗和晚綠(圖1)。3個品種果實分別采自浙江仙居、麗水和新昌的實驗基地。徐香是市場上暢銷的美味獼猴桃(Actinidiadeliciosa)品種；金麗和晚綠分別是浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育出的中華獼猴桃(Actinidiachinensis)和軟棗獼猴桃(Actinidiaarguta)品種。果實采收當(dāng)天挑選大小均勻、成熟度一致、無病蟲害和機械損傷的果實，均勻地平鋪在紙箱中，用保鮮膜包裝后分別放置于25 ℃和4 ℃、相對濕度(90±5)%的環(huán)境中。貯藏期間，25 ℃貯藏組中徐香和金麗獼猴桃果實每3 d取樣1次，晚綠獼猴桃每2 d取樣1次；4 ℃貯藏組每周取樣1次；果實硬度低于0.35 kg·cm-2或晚綠獼猴桃果實表皮褐化率50%以上時停止取樣。獼猴桃果肉用液氮速凍后置-80 ℃冰箱保存待測，每個重復(fù)取用8個果實。

圖1 三個品種獼猴桃果實形態(tài)特征

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1 硬度測定

在果實赤道部位均勻取3個點，削去約1 cm2果皮，用FHM-1果實硬度計(竹村，日本)測定硬度，以kg·cm-2表示。每品種隨機測量6個果實，結(jié)果取平均值。

1.2.2 細胞壁物質(zhì)組分測定

細胞壁物質(zhì)的提取和分離參考Figueroa等[23]的方法。半纖維素含量測定用蒽酮法[24]，用葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，單位mg·g-1；用重量法測定纖維素含量，單位mg·g-1。不同溶解性果膠含量測定參考曹建康等[24]的方法，單位mg·g-1。以上數(shù)據(jù)都以鮮重計。

1.2.3 酶活性測定

用蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，并采用上?？婆d生物科技有限公司的ELISA試劑盒進行酶活性測定。每樣品重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以蛋白質(zhì)質(zhì)量計，單位U·g-1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft office 2019軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、分析與繪圖，利用SPSS 26.0軟件進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃果實采后硬度的變化

硬度是評價果實軟化的重要指標(biāo)。在25 ℃和4 ℃兩種貯藏溫度下，3個品種獼猴桃果實硬度都隨貯藏時間延長而下降(圖2)。25 ℃貯藏條件下，晚綠硬度下降最快，4 d時硬度已下降84.62%；其次是金麗，6 d時，硬度下降77.7%；徐香硬度變化最為緩慢，6 d時硬度僅下降45%，9 d時下降69.79%。4 ℃貯藏條件下，晚綠果實硬度呈直線型下降，金麗和徐香果實硬度均在前3周快速下降而后緩慢變化，而徐香硬度始終保持最高。4 ℃低溫貯藏延緩了獼猴桃果實的軟化，延長了貯藏期限。

圖2 獼猴桃果實軟化期間果肉硬度變化

2.2 獼猴桃果實采后細胞壁多糖物質(zhì)的降解

兩種貯藏條件下，獼猴桃果實細胞壁物質(zhì)含量呈不斷下降趨勢(圖3)。0 d時，3個品種獼猴桃細胞壁物質(zhì)含量從高到低依次為徐香、晚綠、金麗。25 ℃貯藏條件下，3個品種獼猴桃細胞壁物質(zhì)含量在貯藏前期下降速度不同，晚綠的細胞壁物質(zhì)含量下降最快，貯藏2 d時已下降38.44%，而金麗和徐香在貯藏3 d時分別下降32.11%和13.61%；徐香的細胞壁物質(zhì)含量始終高于其他兩個品種。4 ℃貯藏條件下，3個品種獼猴桃細胞壁物質(zhì)含量均在貯藏前期快速下降，貯藏3周時，晚綠、金麗和徐香獼猴桃細胞壁物質(zhì)含量分別下降39.01%、43.17%和38.12%。4 ℃低溫貯藏延緩了獼猴桃果實細胞壁物質(zhì)的降解。

數(shù)據(jù)以鮮重計。圖4、圖5同。

3個品種獼猴桃果實貯藏期間半纖維素含量呈不斷降低趨勢(圖4)。0 d時，3個品種半纖維素含量從高到低依次為徐香、金麗、晚綠。兩種貯藏溫度下，不同品種獼猴桃果實半纖維素含量均在貯藏前期快速下降，隨后緩慢降低。在整個貯藏過程中，徐香果實的半纖維素含量始終較高。25 ℃貯藏末期，徐香、金麗、晚綠的半纖維素含量分別為1.06、1.00、1.25 mg·g-1。4 ℃貯藏末期，金麗和晚綠的半纖維素含量較25 ℃貯藏末期分別增加43%和103.2%，徐香的半纖維素含量無明顯變化。纖維素含量與半纖維素含量變化趨勢較為一致(圖4)。4 ℃低溫貯藏延緩了獼猴桃果實半纖維素和纖維素含量的下降。

圖4 獼猴桃果實軟化期間半纖維素和纖維素含量的變化

如圖5所示，0 d時徐香、金麗、晚綠的水溶性果膠(water soluble pectin，WSP)含量分別為0.86、0.57、1.29 mg·g-1。25 ℃貯藏條件下，晚綠的WSP含量在貯藏前期快速增加，貯藏4 d達4.43 mg·g-1；金麗和徐香的WSP含量增加相對緩慢，貯藏末期其WSP值顯著低于晚綠。4 ℃貯藏條件下，晚綠WSP含量呈直線上升，金麗和徐香的WSP含量則在貯藏前2周迅速上升，隨后緩慢上升直至貯藏末期。不同品種獼猴桃果實貯藏期間離子結(jié)合型果膠(ionic soluble pectin，ISP)含量變化趨勢較為一致。0 d時，徐香的ISP含量最高，晚綠的ISP含量最低。25 ℃貯藏條件下，金麗和晚綠的ISP含量呈先升高后降低的趨勢，徐香的ISP含量相對穩(wěn)定，在貯藏后期有所降低。4 ℃貯藏條件下，3個品種獼猴桃的ISP含量均呈現(xiàn)先升高后降低再升高的波動變化趨勢，徐香的ISP含量始終保持最高。3個品種獼猴桃采后共價型果膠(covalent soluble pectin，CSP)含量均不斷減少。25 ℃貯藏條件下，晚綠的CSP降解最快，在貯藏2 d時已下降46.49%，而金麗和徐香在貯藏3 d時分別下降16.08%和31.97%；金麗的CSP含量在貯藏3 d后呈直線下降趨勢，而徐香呈緩慢下降趨勢。4 ℃貯藏條件下，3個品種獼猴桃的CSP含量均在貯藏前2周降低最多，徐香的CSP含量始終保持最高。4 ℃貯藏顯著減緩獼猴桃果實CSP含量的下降。

圖5 獼猴桃果實軟化期間果膠含量的變化

2.3 獼猴桃果實采后果膠降解相關(guān)酶活性

不同品種獼猴桃果實貯藏過程中PME活性變化趨勢不同(圖6)。25 ℃貯藏條件下，金麗和晚綠的PME活性呈先升高后降低趨勢，分別在貯藏3 d和4 d達到峰值；徐香的PME活性呈先穩(wěn)定后上升的趨勢。4 ℃貯藏條件下，晚綠的PME活性在整個貯藏過程中不斷增加；金麗和徐香的PME活性在貯藏1周時顯著增加，隨后呈波動變化趨勢。

如圖6所示，25 ℃貯藏條件下，金麗和晚綠的PG活性在采后呈先升高后降低趨勢，晚綠的PG活性相對較高，貯藏4 d已達峰值，是金麗活性峰值(6 d)的1.17倍；徐香的PG活性在貯藏前期保持穩(wěn)定，于12 d時達到最高值。4 ℃貯藏條件下，3個品種獼猴桃果實均在貯藏前期保持較低的PG活性，在貯藏后期活性升高，低溫抑制獼猴桃果實PG活性的上升。

不同品種獼猴桃貯藏期間PL活性變化趨勢差異較大(圖6)。0 d時，晚綠的PL活性顯著高于其他兩個品種。25 ℃貯藏條件下，晚綠的PL活性在采后2 d快速下降，隨后又上升，其活性高峰不明顯；金麗和徐香的PL活性總體呈先上升后下降的趨勢，分別在貯藏6 d和9 d達到峰值。4 ℃貯藏條件下，晚綠的PL活性呈不斷降低趨勢，而金麗和徐香的PL活性在貯藏前期較低，于貯藏后期上升；在貯藏前3周，徐香的PL活性顯著低于其他兩個品種。

數(shù)據(jù)以蛋白質(zhì)質(zhì)量計。下同。

25 ℃貯藏條件下，晚綠和金麗兩種糖苷酶活性均呈先上升后下降趨勢，分別在貯藏4 d和6 d達到高峰；徐香β-Gal活性在貯藏前期相對較低，隨后上升，酶活性高峰出現(xiàn)較晚(圖7)。4 ℃貯藏條件下，3個品種β-Gal活性均呈現(xiàn)上升-下降-上升的波浪式上升趨勢，α-AF活性在3個品種中表現(xiàn)不同；晚綠α-AF活性變化呈波浪趨勢，金麗α-AF活性在前期快速增加隨后保持穩(wěn)定，而徐香則是緩慢上升趨勢；在貯藏前3周，徐香α-AF活性顯著低于其他兩個品種。

圖7 獼猴桃果實軟化期間β-半乳糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性變化

2.4 獼猴桃果實硬度、細胞壁組分和果膠降解酶活性之間的相關(guān)性分析

表1相關(guān)性分析結(jié)果顯示，兩種貯藏條件下，3個品種獼猴桃果實硬度與WSP含量之間均呈顯著負(fù)相關(guān)，與CSP、半纖維素、纖維素含量之間呈顯著正相關(guān)，且相關(guān)性較強(0.868

表1 獼猴桃果實硬度、細胞壁組分和果膠降解酶活性之間的相關(guān)性

3 結(jié)論與討論

果實軟化是獼猴桃果實成熟的最主要特征之一，硬度則是評價果實軟化最直觀的生理指標(biāo)。本試驗中，3個品種獼猴桃果實軟化速率不同，其變化速率從大到小依次為晚綠、金麗、徐香。獼猴桃果實軟化過程中，細胞壁組分發(fā)生不同程度的降解。雙子葉植物細胞壁主要由半纖維素、纖維素和果膠組成，上述物質(zhì)降解是造成細胞壁結(jié)構(gòu)破壞的主要原因，細胞壁結(jié)構(gòu)變化進而導(dǎo)致果實質(zhì)地發(fā)生改變。在兩種貯藏溫度下，3個品種獼猴桃果實半纖維素、纖維素和CSP含量不斷降低，WSP含量不斷上升，ISP含量相對穩(wěn)定，與前人在獼猴桃中的研究結(jié)果一致[20，25]。此外，兩種貯藏溫度下，不同品種細胞壁組分降解速率不同，軟化最慢的徐香獼猴桃降解速率最小，軟化最快的晚綠獼猴桃降解速率最大，這與桃和番茄果實中的研究結(jié)果類似[26]。相關(guān)性分析結(jié)果表明，3個品種獼猴桃果實硬度與WSP含量之間均呈顯著負(fù)相關(guān)，與CSP、半纖維素、纖維素含量之間呈顯著正相關(guān)，說明獼猴桃果實軟化與細胞壁多糖物質(zhì)的降解緊密相關(guān)。

果膠物質(zhì)是植物細胞壁初生壁和中膠層的主要成分，也是對獼猴桃果實軟化影響較大的細胞壁多糖物質(zhì)。果膠結(jié)構(gòu)域主要包括同型半乳糖醛酸聚糖(homogalacturonan，HG)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖Ⅰ和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖Ⅱ[27]。果膠聚合物的溶解、解聚和去酯化是果實成熟最重要的特征，多種果膠降解酶參與其中。PME是一種水解酶，水解果膠分子HG中C-6甲酯化的羧基，形成果膠酸。PME為PG和PL提供去甲基果膠酸，促進其他果膠酶對果膠的去聚化；細胞壁中性糖尤其是β-Gal和α-AF分別催化的半乳糖和阿拉伯糖的釋放丟失也是獼猴桃果實成熟軟化過程中的一個重要事件。25 ℃貯藏時，金麗和晚綠PME活性分別在貯藏前期和后期達到峰值，徐香PME活性在貯藏前期活性最低，并呈現(xiàn)先穩(wěn)定再上升的趨勢。研究表明，金魁獼猴桃PME活性則在后期達到峰值，于貯藏末期有所下降[28]，而秦美獼猴桃的PME活性則一直處于下降狀態(tài)，沒有表現(xiàn)出階段活性高峰[18，25]。4 ℃貯藏條件下，本研究中3個品種獼猴桃果實PME活性呈上升趨勢，與海沃德獼猴桃[29]和秦美獼猴桃[19]中的研究結(jié)果一致，而與東紅獼猴桃[30]中的研究結(jié)果不同，說明PME活性在不同品種獼猴桃果實中變化趨勢不同。25 ℃貯藏時，PG和β-Gal活性與徐香獼猴桃軟化顯著相關(guān)。25 ℃貯藏前期，PG和β-Gal活性在軟化最快的晚綠果實中最高，而在軟化最慢的徐香果實中活性最低。4 ℃貯藏時，α-AF活性與徐香和金麗的果實軟化顯著相關(guān)，PL活性與晚綠果實軟化顯著相關(guān)。4 ℃貯藏前期，α-AF的活性在晚綠中最高，在徐香中最低，這與齊秀東等[31]對不同貯藏性梨果實和高萌等[7]對不同耐貯性獼猴桃果實中的研究結(jié)果一致。PL活性在獼猴桃中研究相對較少，有研究表明，PL在東紅果實軟化期間活性變化不明顯[30]。本試驗中，4 ℃貯藏前期，PL活性在晚綠中最高，在徐香中最低。

綜上所述，3個品種獼猴桃果實軟化與細胞壁多糖物質(zhì)的降解緊密相關(guān)。晚綠獼猴桃軟化最快，其細胞壁多糖物質(zhì)含量變化也最快；徐香獼猴桃軟化最慢，其細胞壁多糖物質(zhì)含量變化也最慢。25 ℃貯藏條件下，貯藏前期晚綠中PG、β-Gal的高活性和徐香中的低活性是導(dǎo)致其軟化速度差異的原因；4 ℃貯藏條件下，貯藏前期晚綠中PL、α-AF的高活性和徐香中的低活性是導(dǎo)致其軟化速度差異的原因。