MC1R c.676A>G與山羊皮膚色素沉積的關(guān)系及其對(duì)黑色素合成的影響

蔣 婧，任航行，周 鵬，孫曉燕，李 杰，付 琳，張 麗，劉良佳，王高富，*

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2.重慶市山羊工程技術(shù)研究中心，重慶 榮昌 402460)

黑色素是一種生物多聚體，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。動(dòng)物的毛發(fā)、皮膚和眼睛的顏色均由黑色素的相對(duì)數(shù)量、性質(zhì)和分布決定。色素合成涉及復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中，黑色素的合成是由多個(gè)基因位點(diǎn)編碼產(chǎn)物共同調(diào)控的結(jié)果，現(xiàn)有研究已經(jīng)揭示的主要有5大信號(hào)通路，其中，腺苷酸環(huán)化酶/cAMP信號(hào)通路在黑色素合成中起關(guān)鍵作用[1-4]。黑素皮質(zhì)素受體1(MC1R)蛋白含有7個(gè)跨膜功能域，屬于G蛋白耦聯(lián)受體超家族。當(dāng)MC1R分別與其天然配體——促黑素細(xì)胞激素(α-MSH)和拮抗劑——Agouti位點(diǎn)編碼蛋白(ASIP)結(jié)合時(shí)，可分別增加和減少胞內(nèi)第二信使——環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游蛋白激酶A(PKA)、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)、酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TYRP1)和多巴色素互變異構(gòu)酶(DCT)等基因的表達(dá)和酶的活性，最終導(dǎo)致真黑素、褐黑素的合成[5-6]。一直以來(lái)，關(guān)于MC1R基因的研究主要集中在動(dòng)物毛色上。研究發(fā)現(xiàn)，深色毛發(fā)的山羊[7-8]、水牛[9]、羊駝[10]和雞[11-12]皮膚中MC1R基因的表達(dá)均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于淺色毛發(fā)群體。大量研究表明，MC1R基因的多態(tài)性與動(dòng)物毛色和人類頭發(fā)顏色變異相關(guān)[13-16]。然而，關(guān)于MC1R基因多態(tài)性與膚色變異相關(guān)性的研究報(bào)道，目前僅限于小鼠膚色[17]和人類膚色[18]、雀斑[19]、色痣[20]等方面。

酉州烏羊是迄今為止人們發(fā)現(xiàn)的唯一一種具有白毛烏皮表型的山羊品種，主要分布于武陵山區(qū)腹地的酉陽(yáng)土家族苗族自治縣，其肉質(zhì)細(xì)嫩，富含必需氨基酸、鮮味氨基酸，以及硒、鋅等微量元素[21]。除皮膚外，酉州烏羊的眼、鼻、嘴、角、肛門、陰門等處的可視黏膜也為烏色，其肉、骨可入藥，當(dāng)?shù)厝朔Q之為“藥羊”[22]。酉州烏羊與渝東白山羊雜交的后代可出現(xiàn)烏、淺烏、部分烏、部分淺烏和不烏等5種膚色表型，其中，部分烏表型與人類皮膚黑變病的表型相似。酉州烏羊的皮膚與人類黑變后的皮膚在組織學(xué)上極為相似，均在真皮層內(nèi)可見(jiàn)大量黑色素細(xì)胞和黑色素[23-24]。因此，酉州烏羊既是一個(gè)食藥兼用的家畜良種，又是研究人類多種黑變病的很好的自然突變模型。作者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，酉州烏羊皮膚組織的MC1R基因存在c.676A>G突變，導(dǎo)致226位的氨基酸殘基由賴氨酸變成谷氨酸(p.K226E)，該位點(diǎn)位于受光刺激和G蛋白配體結(jié)合的保守結(jié)構(gòu)域上，會(huì)造成酉州烏羊MC1R蛋白空間構(gòu)象的差異[25]。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步分析MC1R基因c.676A>G突變與皮膚色素沉積的關(guān)系，檢測(cè)過(guò)表達(dá)MC1R基因野生型(MC1Rc.676A)和突變型(MC1Rc.676G)真核表達(dá)載體的各組細(xì)胞中MITF、TYR、TYRP1、DCT等基因相對(duì)表達(dá)量和黑色素含量的差異，探討MC1R基因c.676A>G突變對(duì)黑色素合成的影響，旨在為揭示MC1R基因在皮膚色素沉積方面的分子機(jī)制等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源于重慶市酉州烏羊資源保護(hù)場(chǎng)。隨機(jī)選擇成年酉州烏羊17只(公羊3只，母羊14只)，及其與渝東白山羊雜交的后代成年羊103只(公羊51只，母羊52只)。所有羊只的皮膚表型包括烏、淺烏和不烏共3種。頸靜脈取血3～5 mL，裝入試管后放入保溫箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

小鼠皮膚黑色素瘤細(xì)胞(B16-F10)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。PCR擴(kuò)增試劑盒[T5 Direct PCR Kit(Blood)]，購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?3000，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM?Ⅰ減血清培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、馬血清(horse serum，HS)，均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。青鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液，均購(gòu)自新西蘭HyClone公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser)和實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增試劑盒[SYBR PremixExTaqTM(Tli RNaseH Plus)]，均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。Trizol試劑，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 皮膚色度測(cè)定與血液PCR擴(kuò)增

前期研究發(fā)現(xiàn)，烏色皮膚和不烏皮膚的黑色素含量和黑色素細(xì)胞數(shù)量有明顯差異[23]。由此可知，皮膚膚色是一個(gè)能有效反映體內(nèi)黑色素含量的性狀。用剪毛剪剪掉酉州烏羊及其雜交后代的腹毛，用刀片刮干凈毛根后，應(yīng)用色差儀(OPTO-STAR型肉色測(cè)定儀，德國(guó)Matthaus)測(cè)量皮膚色度值，每個(gè)個(gè)體重復(fù)測(cè)量3次。根據(jù)前期所得的酉州烏羊皮膚MC1R基因序列，設(shè)計(jì)PCR引物(表1的Goat-K-MC1R)，按照PCR擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書的要求和步驟擴(kuò)增酉州烏羊及其雜交后代的MC1R基因。擴(kuò)增體系如下：2×T5 Direct PCR Mix(Blood)15 μL，上、下游引物各1.2 μL，全血3 μL，Nuclease-Free Water 9.6 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)用引物的基本參數(shù)

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

使用化學(xué)合成法合成山羊MC1R基因野生型和突變型序列，將序列連接到GV230載體的多克隆位點(diǎn)上構(gòu)建野生型重組質(zhì)粒GV230-MC1R-A(c.676A)和突變型重組質(zhì)粒GV230-MC1R-G(c.676G)，并通過(guò)酶切和基因測(cè)序2種方法進(jìn)行鑒定。質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程委托上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成，對(duì)照質(zhì)?？蛰d體GV230也購(gòu)自該公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與MC1R基因轉(zhuǎn)染

在無(wú)菌條件下，用含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基復(fù)蘇B16-F10細(xì)胞，加入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到90%融合時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心，按照1.0×105mL-1鋪板于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后更換新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到70%～80%融合時(shí)，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MC1R重組質(zhì)粒入B16-F10細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)共設(shè)定4組：MC1R野生組，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒GV230-MC1R-A，即MC1Rc.676A過(guò)表達(dá)組，以下簡(jiǎn)記為MC1R-A；MC1R突變組，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒GV230-MC1R-G，即MC1Rc.676G過(guò)表達(dá)組，以下簡(jiǎn)記為MC1R-G；陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒GV230，以下簡(jiǎn)記為NC；空白對(duì)照組，不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，以下簡(jiǎn)記為BC。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

轉(zhuǎn)染步驟簡(jiǎn)述如下：除空白對(duì)照組外，每孔分別按照Opti-MEM?Ⅰ減血清培養(yǎng)基25 μL+轉(zhuǎn)染試劑5 μL和Opti-MEM?Ⅰ減血清培養(yǎng)基250 μL+質(zhì)粒2.5 μg+轉(zhuǎn)染試劑5 μL配置混合液A和B，吹勻并瞬時(shí)離心，室溫靜置5 min后，將混合液A、B混合均勻，室溫靜置15 min，然后加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，與孔內(nèi)的培養(yǎng)基混合均勻，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。含空白對(duì)照組的所有實(shí)驗(yàn)組均棄培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗后，更換分化培養(yǎng)基(含2% HS的DMEM培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)72 h，棄培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗2遍。其中：3孔加1 mL Trizol，待細(xì)胞全部裂解后，將混合液轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，用于后續(xù)色素相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)；剩余3孔，每孔加入500 μL 0.25%胰蛋白酶消化，消化終止后收集細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用于后續(xù)細(xì)胞黑色素含量的測(cè)定。

1.5 細(xì)胞黑色素含量測(cè)定

參照熊渺等[26]、趙益文等[27]的方法測(cè)定細(xì)胞黑色素含量，概述如下：在收集的每孔細(xì)胞中加入1 mL 1 mol·L-1NaOH，37 ℃孵育1 h，振蕩5 min。按每孔100 μL的規(guī)格加入非透明96孔酶標(biāo)板中，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。在400 nm波長(zhǎng)下，于Synergy H1型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)上檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組的吸光值。黑色素含量采用相對(duì)值表示，即黑色素含量(合成率，%)=處理組的D400/對(duì)照組的D400×100。

1.6 色素相關(guān)基因檢測(cè)

將保存于Trizol中的細(xì)胞用Trizol法提取總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，用LD2000A plus型超微量分光光度計(jì)(北京領(lǐng)宇科技有限公司)檢測(cè)RNA濃度和純度。將經(jīng)檢測(cè)的提取完整的總RNA溶液稀釋至500 ng·μL-1，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的cDNA。利用qRT-PCR(實(shí)時(shí)熒光定量PCR)方法檢測(cè)MC1R、MITF、TYR、TYRP1、DCT基因的mRNA表達(dá)情況。應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)各基因引物，除Goat-MC1R基因序列參考實(shí)驗(yàn)室前期所得外，其他基因均參考NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)應(yīng)基因的序列設(shè)計(jì)，其中，Mouse-ACTB為內(nèi)參基因。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的blast功能檢測(cè)各對(duì)引物的特異性，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)體系(10 μL)如下：SYBR PremixExTaqTM5 μL，上、下游引物各0.2 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.2 μL，cDNA模板1 μL，RNase ddH2O 3.4 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在ABI Stepone型熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)上進(jìn)行。相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果采用2-△△CT法進(jìn)行計(jì)算。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 2007軟件統(tǒng)計(jì)各種基因型在酉州烏羊及其雜交后代群體中的分布情況，計(jì)算遺傳純合度、雜合度、有效等位基因含量和多態(tài)信息含量，并檢驗(yàn)群體內(nèi)的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。

考慮性別、種群、基因型的效應(yīng)，采用固定模型分析基因型效應(yīng)對(duì)皮膚色度值的影響：

Yi，j，k=μi，j，k+Si+Bj+Gk+ei，j，k。

(1)

式(1)中：Yi，j，k為皮膚色度值，μi，j，k為群體均值，Si為性別效應(yīng)，Bj為種群效應(yīng)，Gk為基因型效應(yīng)，ei，j，k為隨機(jī)誤差。運(yùn)用SAS v9.4軟件包的PROC GLM過(guò)程分析性別、種群、基因型效應(yīng)對(duì)皮膚色度值的影響，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示。

運(yùn)用IBM SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行單因素方差分析，對(duì)有顯著(P<0.05)差異的，用LSD法進(jìn)行多重比較。利用GraphPad Prism 5軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型(基因)頻率的分布、遺傳特性及其與皮膚色度值的關(guān)聯(lián)

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，分別計(jì)算酉州烏羊及其雜交后代2個(gè)群體的基因型頻率和等位基因頻率，以及相關(guān)遺傳特性指標(biāo)(表2)。酉州烏羊及其雜交后代群體中，c.676A>G位點(diǎn)均以GG基因型占優(yōu)勢(shì)。在酉州烏羊群體中，該位點(diǎn)的遺傳純合度為0.709，雜合度為0.291，有效等位基因數(shù)為1.410，χ2檢驗(yàn)該位點(diǎn)在不同組合中的基因頻率處于Hardy-Weinberg平衡(P>0.01)，該位點(diǎn)的多肽信息含量為0.248，為低度多態(tài)[多態(tài)信息含量(PIC)<0.25]；在雜交后代群體中，該位點(diǎn)的遺傳純合度為0.751，雜合度為0.248，有效等位基因數(shù)為1.331，χ2檢驗(yàn)該位點(diǎn)在不同組合中的基因頻率處于Hardy-Weinberg平衡(P>0.01)，該位點(diǎn)的多肽信息含量為0.217，為低度多態(tài)。

表2 酉州烏羊及其雜交后代MC1R基因c.676A>G位點(diǎn)的基因型(等位基因)頻率與遺傳特性

對(duì)120只酉州烏羊及其雜交后代群體中c.676A>G位點(diǎn)的基因型與相應(yīng)個(gè)體的皮膚色度值進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示，性別效應(yīng)對(duì)酉州烏羊及其雜交后代皮膚色度值的影響不顯著(P>0.05)，種群效應(yīng)對(duì)皮膚色度值的影響極顯著(P<0.01)。據(jù)此，分別在酉州烏羊和雜交后代2個(gè)群體中就該位點(diǎn)的基因型與相應(yīng)個(gè)體的皮膚色度值進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示，無(wú)論是在酉州烏羊群體中，還是在雜交后代群體中，不同基因型群體間皮膚色度值的差異均不顯著(表3)。

表3 MC1R基因c.676A>G位點(diǎn)多態(tài)性下酉州烏羊及其雜交后代的皮膚色度值

2.2 細(xì)胞形態(tài)與轉(zhuǎn)染結(jié)果

轉(zhuǎn)染前，MC1R野生組(MC1R-A)、MC1R突變組(MC1R-G)、陰性對(duì)照組(NC)和空白對(duì)照組(BC)的細(xì)胞數(shù)量、狀態(tài)差異不大；轉(zhuǎn)染24 h時(shí)，空白對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)量明顯比其他3組增多；分化72 h后，各組細(xì)胞數(shù)量均有所減少，突觸增多、變長(zhǎng)，細(xì)胞間的突觸相互交聯(lián)(圖1)。

A、B、C、D分別對(duì)應(yīng)于空白對(duì)照組(BC)、陰性對(duì)照組(NC)、MC1R野生組(MC1R-A)和突變組(MC1R-G)細(xì)胞。1、2、3分別代表轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染24 h和分化72 h。

無(wú)論是在轉(zhuǎn)染24 h，還是在分化72 h，空白對(duì)照組均未檢測(cè)到熒光，而陰性對(duì)照組、MC1R野生組和MC1R突變組均有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，表明轉(zhuǎn)染成功，且陰性對(duì)照組的熒光信號(hào)最強(qiáng)(圖2)。

A、B、C、D分別對(duì)應(yīng)于空白對(duì)照組(BC)、陰性對(duì)照組(NC)、MC1R野生組(MC1R-A)和突變組(MC1R-G)細(xì)胞。1、2分別表示轉(zhuǎn)染24 h和分化72 h。

檢測(cè)各組細(xì)胞中山羊MC1R基因的相對(duì)表達(dá)量(圖3)，結(jié)果顯示，MC1R野生組和MC1R突變組MC1R基因的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于陰性對(duì)照組，其中，MC1R野生組MC1R基因的相對(duì)表達(dá)量是陰性對(duì)照組的785倍，MC1R突變組MC1R

柱上無(wú)相同大寫字母的表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

基因的相對(duì)表達(dá)量是陰性對(duì)照組的2 322倍。上述結(jié)果證明，山羊MC1R基因被成功轉(zhuǎn)染進(jìn)B16-F10細(xì)胞中。

2.3 細(xì)胞黑色素含量

檢測(cè)分化72 h各組細(xì)胞的黑色素含量(合成率)，結(jié)果顯示，MC1R突變組的黑色素含量最高，極顯著高于MC1R野生組和陰性對(duì)照組，而MC1R野生組的黑色素含量顯著高于陰性對(duì)照組(圖4)。這說(shuō)明，轉(zhuǎn)染山羊MC1R基因?qū)16-F10細(xì)胞合成黑色素有促進(jìn)作用，且MC1Rc.676A>G對(duì)黑色素合成的促進(jìn)作用更大。

柱上無(wú)相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.4 下游色素相關(guān)基因的表達(dá)情況

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)腺苷酸環(huán)化酶/cAMP信號(hào)通路下游色素相關(guān)基因(MITF、TYR、TYRP1和DCT)的相對(duì)表達(dá)量(圖5)。結(jié)果顯示，MITF、TYR、TYRP1和DCT基因在各組細(xì)胞中的表達(dá)趨勢(shì)一致，均在MC1R突變組最高，且極顯著高于陰性對(duì)照組。除TYR基因在MC1R突變組細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量?jī)H顯著高于MC1R野生組外，其余基因的相對(duì)表達(dá)量均為MC1R突變組極顯著高于MC1R野生組。MC1R野生組細(xì)胞中的MITF基因和DCT基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于陰性對(duì)照組，TYR基因和TYRP1基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于陰性對(duì)照組。這說(shuō)明，MC1R基因能促進(jìn)下游通路中直接影響黑色素合成的相關(guān)基因的表達(dá)，且突變型的促進(jìn)作用更大。

圖5 各組細(xì)胞色素相關(guān)基因的表達(dá)水平

3 討論

膚色與肉色均屬于胴體外觀性狀。對(duì)膚色或肉色的評(píng)價(jià)，較常用的方法有3種——肉眼觀察法、比色卡(或肉色板)比對(duì)法和色差儀測(cè)定法[28-30]。無(wú)論是肉眼觀察法還是比色卡比對(duì)法，均受主觀因素影響較大。光學(xué)色差儀可將原始的國(guó)際照明委員會(huì)(CIE)規(guī)定的刺激值通過(guò)數(shù)學(xué)關(guān)系轉(zhuǎn)換成易于理解的顏色數(shù)值，具有數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高、客觀性強(qiáng)、操作方便等優(yōu)點(diǎn)[31]，現(xiàn)已成功應(yīng)用于豬肉肉色評(píng)定[32]、山羊肉色評(píng)定[33]、矮腳黃雞皮膚色度值評(píng)定[31]、鴨肉皮膚色澤[34]等研究中。本研究選用光學(xué)色差儀(OPTO-STAR型肉色測(cè)定儀)測(cè)量山羊皮膚膚色，測(cè)量數(shù)值與肉眼觀察結(jié)果一致，色度值越大，肉眼觀察到的皮膚顏色更烏。這說(shuō)明光學(xué)色差儀能夠準(zhǔn)確地反映動(dòng)物皮膚膚色的烏度，與前人研究結(jié)果一致[31，35]。

在實(shí)際生產(chǎn)中我們發(fā)現(xiàn)，酉州烏羊羔羊的皮膚色度一般比成年羊淺，這與略陽(yáng)烏雞膚色值隨周齡增長(zhǎng)的變化趨勢(shì)一致[36]。酉州烏羊與渝東白山羊的雜交后代中，會(huì)出現(xiàn)烏、淺烏、不烏、部分烏和部分淺烏5種表型，除了部分烏和部分淺烏2種表型外，其他個(gè)體腹部的皮膚色度與其他部位肉眼觀察無(wú)差異。為了避免年齡和表型的影響，本研究選擇皮膚為烏、淺烏或不烏表型的成年羊?yàn)檠芯繉?duì)象，選擇更方便操作的腹部作為測(cè)量部位，深入分析性別、種群、基因型效應(yīng)對(duì)皮膚色度值的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，種群效應(yīng)對(duì)皮膚色度值的影響極顯著，即酉州烏羊群體的皮膚色度值極顯著高于其雜交后代，而性別效應(yīng)的差異不顯著。這一結(jié)果說(shuō)明，山羊皮膚色度受到種群的影響，而不受性別的影響，與前人在雞上的研究結(jié)果一致[36]。

MC1R基因是黑色素合成重要通路之一的腺苷酸環(huán)化酶/cAMP信號(hào)通路中的關(guān)鍵成員，通過(guò)與α-MSH或ASIP結(jié)合，調(diào)節(jié)下游MITF、TYR、TYRP1和DCT等基因的表達(dá)和酶的活性，從而調(diào)控黑色素合成[3]。MC1R蛋白被證明具有較高的組成性活性，即在沒(méi)有激動(dòng)劑和拮抗劑的情況下，MC1R的組成性活性足以支持小鼠產(chǎn)生黑色素[37]。有研究報(bào)道，抑制B16細(xì)胞中MC1R基因的表達(dá)，其下游TYR基因的表達(dá)量下降，黑色素含量隨之降低[38]。本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染山羊MC1R基因重組質(zhì)粒到B16-F10細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑色素含量和下游MITF、TYR、TYRP1和DCT基因的相對(duì)表達(dá)量均極顯著或顯著高于陰性對(duì)照組，與前人研究結(jié)果相符，說(shuō)明山羊MC1R基因能在B16細(xì)胞中正常表達(dá)，且對(duì)通路下游基因的表達(dá)和黑色素合成均有促進(jìn)作用。

作者課題組前期在酉州烏羊群體中發(fā)現(xiàn)，c.676A>G(p.K226E)，與合川白山羊、巫溪白山羊、酉陽(yáng)本地白山羊共享，該位點(diǎn)位于受光刺激和G蛋白配體結(jié)合的保守結(jié)構(gòu)域上，會(huì)導(dǎo)致酉州烏羊MC1R蛋白空間構(gòu)象差異[25]。研究發(fā)現(xiàn)，用丙氨酸替代MC1R蛋白p.226K會(huì)導(dǎo)致信號(hào)幾乎完全喪失，表明p.226K對(duì)于MC1R耦聯(lián)刺激G蛋白是必不可少的[39]。后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，可能由于引入的殘基性質(zhì)不同，自然發(fā)生的p.K226E突變具有正常的配體結(jié)合和次級(jí)cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[37]。本研究轉(zhuǎn)染野生型(MC1Rc.676A)和突變型(MC1Rc.676G)真核表達(dá)載體到B16-F10細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是黑色素含量，還是cAMP信號(hào)通路下游色素相關(guān)基因的表達(dá)，MC1R突變組均極顯著或顯著高于野生組，說(shuō)明MC1R基因c.676G能促進(jìn)黑色素細(xì)胞合成黑色素，且這一過(guò)程可能是通過(guò)調(diào)節(jié)下游MITF、TYR、TYRP1和DCT等基因的表達(dá)來(lái)完成的。

Wu等[40]研究發(fā)現(xiàn)，MC1Rc.676A>G突變?cè)诖蟛糠直徽{(diào)查動(dòng)物(以全白為主)中，GG基因型頻率較高，而波爾山羊(紅頭白山羊)的c.676A>G突變?yōu)锳A基因型。Javanmard等[41]發(fā)現(xiàn)，AA基因型在深色毛色山羊品種中頻率較高。本研究發(fā)現(xiàn)，酉州烏羊及其雜交后代群體中均以GG基因型為主，這可能跟它們的被毛顏色為白色有關(guān)。毛發(fā)的色素沉積機(jī)制與皮膚色素沉積機(jī)制存在較大差異：毛發(fā)中的色素是由毛囊中的黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的，毛色只受黑色素含量的影響，但膚色受黑色素含量和黑色素細(xì)胞數(shù)量的共同影響[17]。真黑素和褐黑素在毛囊中的合成是反向耦合的，即當(dāng)一個(gè)上升時(shí)，另一個(gè)下降；但在皮膚中，真黑素和褐黑素不存在這樣的反向耦合關(guān)系[17]。皮膚中的黑素皮質(zhì)素信號(hào)通路并不像在毛囊中那樣，將真黑素和褐黑素的合成結(jié)合起來(lái)，即使是通過(guò)共享的信號(hào)通路，頭發(fā)和皮膚的黑色素細(xì)胞也受到相對(duì)獨(dú)立的調(diào)控，因此MC1R對(duì)皮膚和毛發(fā)顏色的調(diào)控機(jī)制是不一樣的[17]。相較于毛發(fā)的色素沉積，皮膚的色素沉積過(guò)程更為復(fù)雜，且膚色和毛色的調(diào)控機(jī)制相對(duì)獨(dú)立。這可能正是導(dǎo)致酉州烏羊被毛為白色但皮膚是烏色的主要原因。

黑色素的合成受多條信號(hào)通路的調(diào)控，不同信號(hào)通路之間發(fā)生交叉調(diào)控，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[42]。MC1R基因可與其拮抗劑ASIP基因互作來(lái)調(diào)控皮膚色素的沉積。Ren等[43]對(duì)不同膚色山羊的100 d 胎兒皮膚在轉(zhuǎn)錄組水平進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，發(fā)現(xiàn)ASIP-MC1R的相互作用可能在山羊胎兒皮膚色素沉積中發(fā)揮重要作用。Steiner等[44]研究發(fā)現(xiàn)，MC1R和ASIP共同負(fù)責(zé)大多數(shù)沙灘鼠亞種之間的色素沉著差異，MC1R編碼區(qū)的衍生突變和ASIP基因mRNA的表達(dá)增加，均有助于淺色色素沉積。Hepp等[45]在對(duì)巴西克里奧爾羊品種進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，MC1R和ASIP基因型的上位互作是導(dǎo)致顏色發(fā)生顯著變化的原因。Van Raamsdonk等[17]發(fā)現(xiàn)，Agouti和MC1R野生型小鼠的毛發(fā)經(jīng)歷了一種叫作色素類型轉(zhuǎn)換的現(xiàn)象，當(dāng)每根頭發(fā)開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)，它就會(huì)被染成真黑素，在頭發(fā)生長(zhǎng)的中途，有一段短暫的Agouti表達(dá)，會(huì)暫時(shí)阻止MC1R信號(hào)，并將真黑素的生產(chǎn)轉(zhuǎn)換為褐黑素，由此導(dǎo)致黑色頭發(fā)中間產(chǎn)生一圈黃色。本研究發(fā)現(xiàn)，MC1Rc.676A>G突變野生型在小鼠B16-F10細(xì)胞中能促進(jìn)黑色素的合成，但該突變?cè)谟现轂跹蚣捌潆s交后代中與膚色色度的變化無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。這可能是因?yàn)椋谏窖蚱つw中，MC1R基因調(diào)控的黑色素合成會(huì)受到其拮抗劑ASIP基因的調(diào)控。

綜上所述，MC1R基因c.676A>G在酉州烏羊及其雜交后代中以GG基因型為主，各基因型群體中皮膚色度值差異不顯著，說(shuō)明c.676A>G不直接影響山羊皮膚色素沉積。山羊MC1R基因能在B16-F10細(xì)胞中正常表達(dá)，且能促進(jìn)B16-F10細(xì)胞中cAMP信號(hào)通路下游色素相關(guān)基因(MITF、TYR、TYRP1和DCT)的表達(dá)，以及黑色素的合成，且突變型(MC1Rc.676G)的促進(jìn)作用比野生型(MC1Rc.676A)更大，說(shuō)明MC1Rc.676A>G與黑色素合成密切相關(guān)。MC1R基因c.676A>G能直接影響B(tài)16-F10細(xì)胞中cAMP信號(hào)通路下游色素相關(guān)基因表達(dá)和黑色素合成，但不直接影響山羊膚色的變異，其具體原因還有待進(jìn)一步研究。