海藻酸鹽基胃黏膜保護膠的理化性能研究

王涵 何牧野 曾行,2 楊敏一 孟珠 楊柳 王春仁

0 引言

胃癌作為胃黏膜上皮病變引起的惡性腫瘤，是嚴重威脅人類健康的疾病之一。根據(jù)國際癌癥研究中心(International Agency for Research on Cancer,IARC)發(fā)表的研究結(jié)果：2018年全球胃癌新發(fā)病例約103萬例，排在全球惡性腫瘤第6位[1]；死亡病例約78萬例，排在全球惡性腫瘤第2位[2]。在我國，胃癌的防控形勢更為嚴峻。我國胃癌的發(fā)病率目前在所有惡性腫瘤中占第2位，死亡率高居第3位，我國每年胃癌約占全球胃癌新發(fā)病例的一半，居全球首位[3-4]。內(nèi)窺鏡下胃黏膜切除手術(shù)(endoscopic mucosal resection,EMR)和胃黏膜剝離術(shù)(endoscopic submucosal dissection,ESD)是早期胃癌和胃良性腫瘤切除的微創(chuàng)手術(shù)，不僅可達到根治早期胃癌的目的，且具有創(chuàng)傷小、對患者生存質(zhì)量影響小等優(yōu)點，已逐漸取代部分傳統(tǒng)外科手術(shù)。但是采用這兩種方式，尤其是ESD術(shù)后產(chǎn)生的胃潰瘍較普通潰瘍更大更深，術(shù)后易出血及穿孔，裸露的創(chuàng)面在胃酸和胃蛋白酶的作用下，愈合時間也較長，容易形成疤痕組織[5-8]，如何在ESD術(shù)后快速修復胃黏膜也是臨床關(guān)注的熱點。

海藻酸鹽是由(1-4)-β-交聯(lián)的D-甘露糖醛酸和(1-4)-α-交聯(lián)的古洛糖醛酸組成的長鏈聚合物，是最具代表性的海洋多糖材料。它作為一種天然的生物材料，具有良好的生物相容性，已廣泛用作皮膚燒傷涂敷料、醫(yī)用黏合劑、組織工程支架等[12-14]。在消化系統(tǒng)領(lǐng)域，海藻酸鈉溶液被用作治療胃潰瘍消化道出血的止血劑，0.6%的海藻酸鈉稀釋液也被注射用于ESD手術(shù)中的黏膜抬舉[15]。但是到目前為止，海藻酸鹽基凝膠劑型還從未被用作ESD術(shù)后胃黏膜創(chuàng)面的修復及再生材料。

本研究中新型的海藻酸鹽基胃黏膜保護膠包括膠體液及固定液兩部分。其中，膠體液以海藻酸鹽為主要成分，添加多聚賴氨酸及葡聚糖；固定液為水溶性鈣溶液。該保護膠通過胃窺鏡噴涂后兩種組分可在生理條件下形成固體凝膠膜，作為胃黏膜的保護膠覆蓋到胃黏膜表面。作為在胃這一特殊環(huán)境下使用的醫(yī)療器械，胃黏膜保護膠需要適用于胃的酸性環(huán)境，在酸性條件依舊能保持其形態(tài)完整且力學強度滿足要求，因此本研究將對該材料進行在同一pH值不同固化時間和不同pH值同一時間固化后的最大拉伸力測試，通過其力學性能的變化反映其所成的膠體的強度；通過抗酶解性能、組織黏附力、酸屏障實驗對其耐胃蛋白酶消化能力、對胃黏膜組織的黏附力及對胃酸的抵御能力進行考察；并通過觸變性能實驗考察其通過胃窺鏡直接噴涂的可能性。該研究將為這一產(chǎn)品的臨床使用提供參考。

1 研究方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

胃黏膜保護膠(杭州英健生物科技有限公司，中國)；新鮮豬胃(河北奧博牧業(yè)有限公司，中國)。

1.1.2 試劑

鹽酸(國藥集團化學試劑有限公司，中國)；無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司，中國)；胃蛋白酶(北京酷來搏科技有限公司，中國)；生理鹽水(恒寧醫(yī)療器械有限公司，中國)；DMEM培養(yǎng)基(Corning，美國)。

1.2 儀器

干燥箱(GRX-9023A，上海一恒科學儀器有限公司，中國)；電子天平(XSE205DU，梅特勒-托利多集團，瑞士)；恒溫培養(yǎng)箱[ZHWY-103B，賽默飛世爾科技(中國)有限公司，美國]；紫外分光光度計(U-3310，日立，日本)；蠕動泵(BT100-1L，保定蘭格恒流泵有限公司，中國)；旋轉(zhuǎn)黏度計(VT-550，德國哈克公司，德國)；萬能材料試驗機(3382，ITW 集團英斯特朗公司，美國)；pH計(FE28-standard，梅特勒-托利多集團，瑞士)。

1.3 實驗方法及步驟

1.3.1 酸敏感性實驗

(1) 不同pH值鹽酸溶液固定同一時間最大拉伸力。將9 mL膠體液倒入直徑9 cm的無菌培養(yǎng)皿中，加入固定液10 mL固化2～3 min成膜，倒掉固化液；再加入pH為1.0、2.0、3.0、4.0的鹽酸溶液10 mL繼續(xù)固化30 min，倒掉多余液體，將樣品裁成2 cm×2 cm片材，不同pH值條件下取5片片材采用萬能材料試驗機測定片材斷裂時的拉伸力。

(2) pH=1.0鹽酸溶液固定不同時間最大拉伸力。參照(1)的方法用固定液固化膠體成膜，再加入pH為1.0的鹽酸溶液10 mL分別固化15 min、30 min、60 min、120 min和180 min。將樣品裁成2 cm×2 cm片材，每個時間點取5片片材測定膜斷裂時的拉伸力。

1.3.2 抗酶降解實驗

參照中國藥典方法[9]，準備含胃蛋白酶及不含胃蛋白酶的人工胃液。將在pH為1.2的鹽酸溶液中固化30 min的膠體膜制成直徑為16 mm的圓片樣品。37℃在上述溶液中分別浸泡5片測試樣品，每隔兩天換液。分別測定3 d、1周、2周時材料的剩余質(zhì)量百分比，計算降解率。以SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。若兩組樣本方差齊性且符合正態(tài)分布，選擇兩獨立樣本t檢驗；若方差不齊選用兩樣本秩和檢驗。P<0.05表示兩組間差異有統(tǒng)計學意義；P>0.05表示兩組間差異無統(tǒng)計學意義。

1.3.3 組織黏附力實驗

取市售新鮮豬胃[10]置37 ℃生理鹽水中切開并將胃內(nèi)壁清洗干凈，清洗的胃在2 h內(nèi)使用。剪取5 cm×5 cm面積的胃組織，固定于聚乙烯薄膜上，切除胃的黏膜層形成1 cm×1 cm的創(chuàng)面。將0.5 mL胃黏膜保護膠膠體液均勻涂布于胃黏膜創(chuàng)面及附近正常黏膜上，然后噴灑固定液，5 min后用15 mL生理鹽水沖洗掉多余的固定液。胃組織在恒溫培養(yǎng)箱(相對濕度92.5%，溫度37℃)中放置20 min后固定于角度為60°的沖洗斜槽上，調(diào)節(jié)蠕動泵流速為20 mL/min，用0.1 mol/L鹽酸沖洗5 min，沖洗液收集于已知質(zhì)量的蒸發(fā)皿中；另取相同面積的胃組織同法操作并收集沖洗液。在70 ℃烘干，稱重。組織黏附力用黏附百分率表示，平行測試8個樣品。計算方法如下:

胃組織黏附百分率(%) ={[M-(G-g-m)]/

M}×100%

式中：M為胃黏膜保護膠的質(zhì)量；g為空蒸發(fā)皿質(zhì)量；G為蒸發(fā)皿與烘干后殘渣總質(zhì)量；m為同體積沖洗液所含固體物質(zhì)的質(zhì)量(空白對照)。

1.3.4 觸變性能實驗

在旋轉(zhuǎn)黏度計中加入40 mL的樣品或?qū)φ掌凡⒃?0 r/min和200 r/min 轉(zhuǎn)速下的黏度進行計算。假塑比值=高轉(zhuǎn)速下的黏度/低轉(zhuǎn)速下的黏度。其中樣品組為胃黏膜保護膠，對照組為2%的羧甲基纖維素。

1.3.5 酸屏障作用實驗

配制濃度為37.0%、18.5%、9.3%、4.6%的鹽酸溶液。如圖1所示，在24孔板中加入1 mL無血清培養(yǎng)基；樣品組的Transwell小室中加入0.2 mL的胃黏膜保護膠，對照組不做處理，然后每組中加入25 μL不同濃度的鹽酸溶液，每組做3個復孔，用pH計測量培養(yǎng)基的pH值變化。

圖1 酸屏障作用實驗示意圖Figure 1 Schematic diagram of acid barrier test

2 結(jié)果

2.1 酸敏感性實驗

不同pH值(pH=1.0、2.0、3.0、4.0)條件下固定30 min，pH值為1.0時最大拉伸力最大，隨pH值的升高拉伸力呈現(xiàn)下降趨勢，結(jié)果見表1；當pH=1.0時，隨著固定時間延長，膠體膜的最大拉伸力升高，力學性能改善，結(jié)果見表2。

表1 不同pH值鹽酸溶液固定同一時間最大拉伸力變化(n=5)Table 1 The maximum tensile force of HCl solutions fixed at different pH values changes at the same time(n=5)

表2 pH 為1.0的鹽酸溶液固定不同時間最大拉伸力變化(n=5)Table 2 The maximum tensile force of HCl solution with pH 1.0 fixed at different time(n=5)

2.2 抗酶降解實驗

以SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，兩組樣本方差齊性且符合正態(tài)分布，選擇兩獨立樣本t檢驗。3 d、1周、2周時兩組間的降解率無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。說明該胃黏膜保護膠具有抗酶解性能，結(jié)果見表3。

表3 抗酶降解實驗結(jié)果(n=5)Table 3 Results of anti-enzyme degradation test(n=5)

2.3 組織黏附力實驗

胃黏膜保護膠的黏附率在90%以上，具有較好的組織黏附性，結(jié)果見表4。

表4 組織黏附率實驗結(jié)果(n=8)Table 4 Results of tissue adhesion rate test(n=8)

2.4 觸變性能實驗

胃黏膜保護膠在50 r/min的黏度為0.98 Pa·s；在200 r/min的黏度為0.38 Pa·s，假塑比值為0.39；2%羧甲基纖維素在50 r/min及200 r/min的黏度分別為0.41 Pa·s及0.24 Pa·s；假塑比值為0.58。因此，胃黏膜保護膠假塑比值低于2%羧甲基纖維素，說明胃黏膜保護膠具有更好的觸變性。

2.5 酸屏障作用實驗

胃黏膜保護膠對不同濃度的鹽酸溶液均有一定的隔離屏蔽作用，實驗結(jié)果如表5所示。

表5 胃黏膜保護膠的酸屏障作用研究結(jié)果(n=3)Table 5 Acid barrier effect results of gastric mucosal protective gel(n=3)

3 討論

目前臨床上對EMR及ESD術(shù)后黏膜創(chuàng)面的修復途徑主要有內(nèi)鏡下閉合、藥物治療、生物材料修復等。內(nèi)鏡下閉合主要利用止血夾、消化道閉合裝置等；術(shù)后應用藥物主要有黏膜保護劑及抑酸藥物等；目前報道的生物材料有聚乙醇酸膜狀材料、新生羊膜等。這些方法相對來說操作或使用復雜且效果有限。生物材料學科的發(fā)展為這一問題的解決帶來了新的契機。理想胃黏膜保護及修復材料需具有以下特點：能夠在術(shù)中通過管道抵達創(chuàng)面并迅速粘附；能適應胃內(nèi)的特殊環(huán)境，抵御胃酸(pH值為0.9～1.5)腐蝕及胃蛋白酶的消化；能夠牢固覆蓋于創(chuàng)口表面，促進創(chuàng)面修復，但又不能過于堅硬，須順應胃部蠕動特性；好的生物相容性[11]。

本研究進行了一種新型的海藻酸鹽基胃黏膜保護膠的理化性能研究。一是針對胃黏膜保護膠主要應用于胃ESD術(shù)后，需要耐酸耐消化酶降解，測試了在同一pH值不同固化時間和不同pH值同一時間固化后的拉伸強度，發(fā)現(xiàn)固化時間越長、酸度越高時最大拉伸力越大；證明了該材料具有酸敏感性，即該材料遇酸發(fā)生相變由液體轉(zhuǎn)化為膠體，并有一定的力學強度。二是由于手術(shù)中胃內(nèi)特殊的環(huán)境，需要測試保護膠在該環(huán)境下的黏附率。針對這一問題設計了黏附實驗，實驗結(jié)果顯示胃黏膜保護膠的黏附率較高，具有良好黏附性能。三是研究了胃黏膜保護膠對在胃蛋白酶條件下降解進行實驗研究，發(fā)現(xiàn)在有和無胃蛋白酶的條件下該保護膠的降解率無顯著性差異，該膠體具有抗酶解的性能。四是通過觸變性能實驗發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)品在較高轉(zhuǎn)速下可以降低黏度，在較低轉(zhuǎn)速下黏度增高，具有觸變性，可避免樣品在注射部位的流動性。五是研究了該保護膠的酸屏障作用，利用Transwell小室設計酸屏障模型，證明該保護膠可以抵御酸的侵襲，對未愈合創(chuàng)面起到保護作用。本研究結(jié)果顯示該保護膠有一定的臨床應用價值，但還需充分對其生物相容性及有效性[16-18]進行研究，證明其安全性和有效性。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，海藻酸鹽基胃黏膜保護膠具有抗酸解及酶解的特性，可在體內(nèi)保持良好的形態(tài)；具有較好的組織黏附性及酸屏障隔離作用，可保護胃黏膜免受胃酸的刺激；具有良好的觸變性，使其具有可注射性，且保持穩(wěn)定的形態(tài)不易流動擴散。本實驗的研究結(jié)果證明該胃黏膜保護膠是一種具有臨床應用可能性的醫(yī)療器械產(chǎn)品。同時，本次研究針對的海藻酸鹽基生物材料是在胃黏膜創(chuàng)面修復領(lǐng)域的首次應用，針對該材料凝膠劑型的研究也為胃黏膜創(chuàng)面保護及修復打開了新的思路。