一種基于深度學(xué)習(xí)的蛋白質(zhì)組分析方法

劉扣龍 鄭浩然

0 引言

近年來(lái)隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，以及儀器精度的提高，主要采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)對(duì)大規(guī)模蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析[1]。蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)采集策略主要有兩種，一種是數(shù)據(jù)依賴(lài)性采集(data dependent acquisition,DDA)[2]，另一種是數(shù)據(jù)非依賴(lài)性采集(data independent acquisition,DIA)[3]。在DIA中，將質(zhì)譜整個(gè)掃描范圍分為若干個(gè)窗口，循環(huán)地對(duì)每個(gè)窗口中的所有離子進(jìn)行碎裂，而不是選擇具有特定質(zhì)荷比的離子，具有高通量、可重復(fù)性高的優(yōu)點(diǎn)[4]。但采用DIA方法進(jìn)行碎裂，會(huì)導(dǎo)致二級(jí)質(zhì)譜是由多個(gè)母離子同時(shí)碎裂產(chǎn)生的混合質(zhì)譜，母離子與碎裂子離子之間不存在對(duì)應(yīng)關(guān)系，顯著增加了肽段定性和定量的復(fù)雜度。

目前在DIA數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)組分析中，主要都是基于提取離子色譜圖(extracted ion chromatogram,XIC)的方法[5]。例如，OpenSWATH[6]通過(guò)集成各種軟件工具來(lái)輔助DIA分析，提取目標(biāo)肽的色譜圖，對(duì)碎片離子的共洗脫峰進(jìn)行評(píng)分，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其在數(shù)據(jù)處理方面較繁瑣。Wang等[7-8]計(jì)算了實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜與理論質(zhì)譜之間的余弦相似度，針對(duì)兩個(gè)肽段構(gòu)成的混合質(zhì)譜的情況進(jìn)行求解，并給出非混合質(zhì)譜與混合質(zhì)譜的區(qū)分方法，提高了搜索質(zhì)譜庫(kù)的靈敏度。MSPLIT-DIA[9]計(jì)算歸一化點(diǎn)積，作為圖譜之間的相似度，結(jié)合色譜峰形、保留時(shí)間等相關(guān)特征來(lái)鑒定肽段。Specter[10]是在上述工作上進(jìn)行了擴(kuò)展，將DIA中混合二級(jí)質(zhì)譜的強(qiáng)度看作是不同肽段碎片離子強(qiáng)度的線性疊加，將混合二級(jí)質(zhì)譜和匹配到的肽段質(zhì)譜進(jìn)行線性擬合，再將求解的肽段系數(shù)構(gòu)建色譜峰，提取峰特征，可以準(zhǔn)確地鑒定出相應(yīng)的肽段并進(jìn)行定量分析，但線性求解過(guò)程中并不能完全擬合，存在很多誤差。使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)提高定性效果的研究，例如DIA-NN[11]在定性時(shí)先構(gòu)建色譜峰，提取色譜峰相關(guān)的特征，用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)迭代尋找最佳的洗脫峰，從而獲取定性結(jié)果；定量時(shí)使用洗脫峰的積分結(jié)果，再進(jìn)行校正處理，增加了定性和定量的肽段數(shù)量。但該方法在定性和定量時(shí)依然基于離子色譜圖的方式，流程復(fù)雜，結(jié)果會(huì)受到色譜圖復(fù)雜度和色譜時(shí)間的影響。FIGS[12]利用不同肽段質(zhì)譜中特有的峰對(duì)混合二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行線性擬合，迭代求解每個(gè)肽段的系數(shù)，再構(gòu)建色譜峰，進(jìn)行定性和定量，顯著提高了肽段定性和定量的準(zhǔn)確度，但該方法同樣存在求解時(shí)不能完全擬合，以及構(gòu)建色譜峰時(shí)存在誤差等問(wèn)題。

這些基于離子色譜圖的方法都需要構(gòu)建離子色譜峰，經(jīng)過(guò)特征提取、積分等操作，會(huì)受到色譜維度的影響。色譜復(fù)雜度不同會(huì)對(duì)離子匹配和構(gòu)建出的色譜峰形產(chǎn)生影響；而色譜時(shí)間的長(zhǎng)度和偏移會(huì)對(duì)離子間的色譜峰相關(guān)性產(chǎn)生影響，這些復(fù)雜流程中存在很多誤差，導(dǎo)致定性和定量結(jié)果不準(zhǔn)確。針對(duì)該方法存在的問(wèn)題，課題組沒(méi)有使用色譜維度的信息，不需要構(gòu)建離子色譜峰，結(jié)合深度學(xué)習(xí)在分類(lèi)和預(yù)測(cè)問(wèn)題上的優(yōu)勢(shì)，提出了基于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(convolutional neural network,CNN)的定性和定量模型，通過(guò)二分類(lèi)和回歸預(yù)測(cè)的方式，直接獲取肽段的定性和定量結(jié)果，從而在減少色譜維度信息影響的同時(shí)，有效地進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。

1 方法

1.1 預(yù)處理

混合二級(jí)質(zhì)譜和肽段的質(zhì)譜數(shù)據(jù)特征如圖1所示，橫軸為m/z，縱軸為峰強(qiáng)度。將肽段對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰強(qiáng)度，轉(zhuǎn)換成一維向量形式，同時(shí)將肽段和多個(gè)混合二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行峰匹配，將匹配后的峰強(qiáng)度轉(zhuǎn)換成多個(gè)一維向量形式，然后，經(jīng)過(guò)預(yù)處理和特征提取后輸入到CNN中。

圖1 質(zhì)譜數(shù)據(jù)示意圖Figure 1 Schematic diagram of mass spectrometry data

對(duì)于質(zhì)譜庫(kù)中的每個(gè)肽段母離子，記為L(zhǎng)ibi，在不同掃描時(shí)間點(diǎn)，都可能參與構(gòu)成其所在掃描窗口對(duì)應(yīng)的每個(gè)混合二級(jí)質(zhì)譜，為了找到和Libi最相關(guān)的混合二級(jí)質(zhì)譜，采用兩個(gè)條件進(jìn)行過(guò)濾。

(1) 對(duì)于Libi的每個(gè)峰對(duì)應(yīng)的m/z值，匹配掃描窗口內(nèi)的每個(gè)混合二級(jí)質(zhì)譜，找到有峰重合的，并且重合數(shù)量大于5個(gè)的混合二級(jí)質(zhì)譜，僅保留混合二級(jí)質(zhì)譜中與Libi重合的峰。

(2) 將過(guò)濾后的每個(gè)混合二級(jí)質(zhì)譜，計(jì)算其和Libi的相關(guān)度，保留相關(guān)度最高的s個(gè)混合二級(jí)質(zhì)譜(不夠s個(gè)則用0填充)。使用2個(gè)信息進(jìn)行相關(guān)度計(jì)算。

第1個(gè)信息：計(jì)算Libi和匹配到的混合二級(jí)質(zhì)譜的相似度。每個(gè)肽段母離子對(duì)應(yīng)質(zhì)譜的峰強(qiáng)度經(jīng)過(guò)歸一化(強(qiáng)度和為1)，先對(duì)匹配到的混合二級(jí)質(zhì)譜的峰強(qiáng)度做同樣的歸一化，記為MS2k。這樣二者的峰強(qiáng)度就都處于0到1之間了。理論上，對(duì)于其中一個(gè)混合二級(jí)質(zhì)譜MS2k，如果完全由肽段母離子Libi碎裂形成，即沒(méi)有其他肽段母離子的成分，則MS2k和Libi對(duì)應(yīng)m/z位置的歸一化后的峰強(qiáng)度應(yīng)該相同。所以計(jì)算Libi和MS2k的質(zhì)譜峰強(qiáng)度差的絕對(duì)值，然后求和作為二者間的距離，即：

(1)

第2個(gè)信息：肽段母離子Libi和匹配到的混合二級(jí)質(zhì)譜MS2k，理論上二者越相關(guān)，即如果該混合二級(jí)質(zhì)譜MS2k完全由肽段母離子Libi碎裂形成，則MS2k中和Libi對(duì)應(yīng)的峰的強(qiáng)度之和應(yīng)該越大。所以計(jì)算MS2k中和Libi對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰的強(qiáng)度之和，作為二者間的距離，即：

(2)

為了同時(shí)使用這2個(gè)信息，對(duì)第2個(gè)信息進(jìn)行處理，把Libi匹配到的混合二級(jí)質(zhì)譜計(jì)算得到的PeakSum，除以其中的最大值，這樣范圍處于0到1之間，與第1個(gè)信息的量級(jí)一樣，然后取負(fù)值和第1個(gè)信息相加。這樣得到的值越小，說(shuō)明肽段母離子Libi和混合二級(jí)質(zhì)譜MS2k越相關(guān)。最后選擇最相關(guān)的s個(gè)混合二級(jí)質(zhì)譜保留下來(lái)。

1.2 定性模型

肽段定性需要使用前面預(yù)處理后的數(shù)據(jù)，利用肽段母離子的質(zhì)譜和該肽段匹配到的混合二級(jí)質(zhì)譜來(lái)判定該肽段母離子是否在實(shí)驗(yàn)樣品中。設(shè)計(jì)1個(gè)基于CNN的二分類(lèi)模型，若肽段屬于該樣品，則模型輸出的分?jǐn)?shù)接近于1，否則接近于0。這里采用CNN模型，是考慮到輸入的質(zhì)譜數(shù)據(jù)類(lèi)似于彩色圖片的多通道，并且相鄰質(zhì)譜峰之間存在相關(guān)性。而傳統(tǒng)的機(jī)器學(xué)習(xí)模型需要提取大量相關(guān)的特征，并且會(huì)損失原始數(shù)據(jù)的信息，所以使用CNN，可以更好地提取深度特征。

利用前面預(yù)處理后的數(shù)據(jù)，進(jìn)行特征提取。主要提取了2個(gè)特征，與預(yù)處理的相似度類(lèi)似，但提取的是m/z維度的特征，沒(méi)有構(gòu)建色譜峰特征。

(1) 計(jì)算肽段匹配到的混合二級(jí)質(zhì)譜的m/z維度的峰強(qiáng)度的和，即將這些匹配到的混合二級(jí)質(zhì)譜合并為1個(gè)。

(3)

式中：s表示Libi匹配到的混合二級(jí)質(zhì)譜的個(gè)數(shù)；j表示Libi和MS2k對(duì)應(yīng)的第j個(gè)峰。

(2) 計(jì)算Libi和MS2k的質(zhì)譜峰強(qiáng)度差的絕對(duì)值。

(4)

模型結(jié)構(gòu)如圖2所示，首先將提取的特征輸入到CNN中去，再將提取的深度特征拼接到一起，然后經(jīng)過(guò)全連接層處理，最后經(jīng)過(guò)Sigmoid函數(shù)，獲取分類(lèi)屬于正樣本的概率。使用二元交叉熵作為損失函數(shù)：

Loss=-[ylog2p+(1-y)log2(1-p)]

(5)

式中：y為真實(shí)標(biāo)簽，值為0或1；p為預(yù)測(cè)值，范圍是(0,1)。

網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)參數(shù)如表1所示。卷積層的輸出維度為：[batch size，卷積核個(gè)數(shù)，峰個(gè)數(shù)]，卷積層的參數(shù)個(gè)數(shù)等于卷積核的個(gè)數(shù)乘以核的大小。使用Adam算法優(yōu)化網(wǎng)絡(luò)參數(shù)。

表1 定性模型網(wǎng)絡(luò)參數(shù)Table 1 Network parameters of qualitative model

1.3 定量模型

定量模型的流程和定性模型類(lèi)似，但是每一步的處理方式不同。肽段定量同樣利用前面預(yù)處理后的數(shù)據(jù)，這里不對(duì)該數(shù)據(jù)做其他處理，使用原始數(shù)據(jù)不會(huì)損失任何重要的信息，這樣能保證定量預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。設(shè)計(jì)一個(gè)基于CNN的回歸模型，直接預(yù)測(cè)輸出該肽段的定量值。

模型結(jié)構(gòu)如圖3所示，將肽段質(zhì)譜和預(yù)處理后匹配到的混合二級(jí)質(zhì)譜分別輸入到CNN中去，將提取的特征拼接到一起，再經(jīng)過(guò)第二層CNN和全連接層處理，最后輸出一個(gè)值，作為肽段的定量值。使用均方誤差作為損失函數(shù)，即：

(6)

圖2 深度學(xué)習(xí)定性模型結(jié)構(gòu)圖Figure 2 Structure diagram of deep learning qualitative model

圖3 深度學(xué)習(xí)定量模型結(jié)構(gòu)圖Figure 3 Structure diagram of deep learning quantitative model

式中：y為肽段的定量值；y′i為預(yù)測(cè)值。

網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)參數(shù)如表2所示，表示方法與前面的定性模型相同。

表2 定量模型網(wǎng)絡(luò)參數(shù)Table 2 Network parameters of quantitative model

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)集

在LFQbench[13]論文中提供了很多DIA質(zhì)譜數(shù)據(jù)集，是專(zhuān)門(mén)用來(lái)評(píng)估蛋白質(zhì)組定性和定量準(zhǔn)確度而做的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)集。質(zhì)譜數(shù)據(jù)由3個(gè)物種的蛋白質(zhì)酶解后的肽段，以2種比例分別混合后各進(jìn)行3次重復(fù)SWATH-DIA[14]實(shí)驗(yàn)采集得到(人類(lèi)：[1∶1];酵母:[2∶1];大腸桿菌:[1∶4])。在不同窗口和儀器上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到不同的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。選擇其中一個(gè)固定窗口的數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集，另一個(gè)可變窗口的數(shù)據(jù)作為測(cè)試集。

為了獲取訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的標(biāo)簽，使用蛋白質(zhì)組定性和定量準(zhǔn)確度比較高的方法FIGS[12]，在訓(xùn)練集上計(jì)算得到定性和定量結(jié)果。對(duì)于定性模型，將FIGS定性到的肽段作為正樣本，將生成的decoy庫(kù)中的肽段作為負(fù)樣本(decoy庫(kù)中的質(zhì)譜不真實(shí)存在，用來(lái)混淆target庫(kù)中的質(zhì)譜，采用母離子交換-離子峰偏移的方式生成decoy[15])。對(duì)于定量模型，將FIGS得到的定量結(jié)果，選擇比較可靠且準(zhǔn)確的定量值作為訓(xùn)練目標(biāo)。使用LFQbench[13]論文中采用的定量精度評(píng)估指標(biāo)進(jìn)行過(guò)濾，即先使用3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的定量值計(jì)算變異系數(shù)(coefficient of variation,cv)，再使用cv<0.1過(guò)濾，選擇A樣品和B樣品中肽段定量比值比較好的結(jié)果。

2.2 定性結(jié)果

在肽段定性研究中，為了獲取比較可靠的定性肽段，需要同時(shí)對(duì)decoy庫(kù)中的肽段進(jìn)行定性，通過(guò)控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)來(lái)獲取最終定性到的肽段。使用深度學(xué)習(xí)定性模型在訓(xùn)練集上優(yōu)化網(wǎng)絡(luò)參數(shù)后，對(duì)測(cè)試集進(jìn)行預(yù)測(cè)。target和decoy庫(kù)中的每個(gè)肽段都會(huì)預(yù)測(cè)得到一個(gè)概率分?jǐn)?shù)，然后計(jì)算FDR使其小于0.01。

為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，將模型最終定性到的肽段和FIGS定性到的肽段進(jìn)行對(duì)比，如圖4所示?？梢钥吹剑瑑煞N方法定性到的肽段的交集數(shù)量為27 788，占深度學(xué)習(xí)定性肽段的比例為27 788/28 354=98.00%。這說(shuō)明深度學(xué)習(xí)模型的定性結(jié)果比較可靠。

圖4 定性結(jié)果對(duì)比Figure 4 Comparison of qualitative results

同時(shí)，統(tǒng)計(jì)兩種方法在6個(gè)樣品中均定性到的肽段。FIGS定性交集為18 294個(gè)肽段，占總量的比例為18 294/40 978=44.64%；深度學(xué)習(xí)定性交集為13 680個(gè)肽段，占總量的比例為13 680/28 354=48.25%。統(tǒng)計(jì)FIGS在6個(gè)樣品中定性重復(fù)率均值為0.578 6；深度學(xué)習(xí)在6個(gè)樣品中定性重復(fù)率均值為0.662 9。說(shuō)明深度學(xué)習(xí)在定性上的重復(fù)性很好，因此定性準(zhǔn)確度較高。

2.3 定量結(jié)果

在肽段定量研究中，為了證明定量方法的準(zhǔn)確性和可靠性，通常對(duì)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)集和不同比例混合肽段進(jìn)行定量，查看比值結(jié)果。目前還沒(méi)有基于CNN利用DIA色譜信息直接進(jìn)行肽段定量的研究工作，而FIGS論文使用肽段特有的離子構(gòu)建色譜峰，該方法的定量準(zhǔn)確度很高。所以為了評(píng)估深度學(xué)習(xí)定量模型的效果，使用深度學(xué)習(xí)模型和FIGS在測(cè)試集上分別進(jìn)行定量。測(cè)試集一共有6個(gè)文件，包括A樣本和B樣本的3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。先獲取A樣本和B樣本3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)均定性到的肽段的定量值，計(jì)算cv，保留cv<0.1的肽段，然后取均值作為該肽段的定量值。再計(jì)算A樣本和B樣本中同時(shí)出現(xiàn)的肽段的定量值比值，然后與FIGS進(jìn)行對(duì)比，如圖5所示。

圖5 定量結(jié)果對(duì)比Figure 5 Comparison of quantitative results

FIGS在其論文中與主流DIA定量軟件進(jìn)行了準(zhǔn)確度對(duì)比，包括Skyline[16]、OpenSWATH[6]、Spectronaut[17]、DIA-Umpire[18]和 Specter[10]。采用計(jì)算絕對(duì)中位差(median absolute deviation,MAD)的方式對(duì)比準(zhǔn)確度，效果明顯優(yōu)于主流軟件。本文采用同樣的方式與FIGS進(jìn)行對(duì)比，將肽段在B樣品中的豐度等分為3部分，計(jì)算MAD。如圖5(a)所示，本文的深度學(xué)習(xí)模型與FIGS相比在定量準(zhǔn)確度上基本相當(dāng)。在圖5(b)和圖5(c)中繪制了肽段在A樣品和B樣品中的定量值的比值，虛線代表理論比值。從圖5(b)和圖5(c)中可以看到，深度學(xué)習(xí)模型定量準(zhǔn)確度高的肽段的數(shù)量比FIGS明顯增多，提高了19.33%[(5 290-4 433)/4 433]。說(shuō)明與FIGS相比，深度學(xué)習(xí)能夠提高不同豐度下的肽段定量數(shù)量。

3 討論與結(jié)論

由于DIA數(shù)據(jù)是多個(gè)肽段同時(shí)碎裂產(chǎn)生的混合二級(jí)質(zhì)譜，比較復(fù)雜，給肽段定性和定量帶來(lái)了困難。目前主要基于提取離子色譜圖的方法進(jìn)行定性和定量，但這種方法流程復(fù)雜，中間存在誤差，色譜圖復(fù)雜度和色譜時(shí)間的不同會(huì)導(dǎo)致定性和定量結(jié)果不準(zhǔn)確。針對(duì)該方法存在的問(wèn)題，本文提出了一種新的肽段定性和定量方法，沒(méi)有使用色譜維度的信息。利用兩個(gè)基于CNN的深度學(xué)習(xí)模型(一個(gè)通過(guò)二分類(lèi)的方式進(jìn)行定性，另一個(gè)通過(guò)回歸預(yù)測(cè)的方式進(jìn)行定量)，不需要構(gòu)建色譜峰，也沒(méi)有提取色譜峰相關(guān)的特征，從而減小復(fù)雜流程中存在的誤差，不受色譜相關(guān)因素的影響。本研究在公開(kāi)數(shù)據(jù)集上進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，與FIGS對(duì)比表明，本文的模型能夠提高定性的準(zhǔn)確度，經(jīng)過(guò)cv過(guò)濾后，絕對(duì)中位差指標(biāo)與FIGS相當(dāng)?shù)耐瑫r(shí)，能夠顯著提高肽段定量的數(shù)量，比FIGS提高了約19%，可以有效地對(duì)肽段進(jìn)行定性和定量。

本研究目前在公開(kāi)數(shù)據(jù)集上進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明了方法的有效性，但沒(méi)有在更廣泛的數(shù)據(jù)集上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因此本研究存在一定的局限性，需要對(duì)模型的泛化能力進(jìn)一步測(cè)試研究。

在未來(lái)的工作中，課題組將進(jìn)一步提高深度學(xué)習(xí)定性和定量模型的準(zhǔn)確度，同時(shí)擴(kuò)展模型的適用性場(chǎng)景，解決更廣泛的蛋白質(zhì)組定性和定量問(wèn)題。