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    阿克蘇地區(qū)部分規(guī)?;i場(chǎng)豬圓環(huán)病毒3型的感染情況調(diào)查

    2022-12-24 08:49:22莫紹江孫鵬亮李虎劉祥杰李蓮瑞
    關(guān)鍵詞:繁育場(chǎng)阿克蘇地區(qū)豬場(chǎng)

    莫紹江 ,孫鵬亮 ,李虎,劉祥杰,李蓮瑞 *

    (1塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300)

    (2塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 阿拉爾 843300)

    豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV),是已知最小的動(dòng)物病毒之一,為單鏈環(huán)狀DNA病毒,長(zhǎng)度2 000 bp,粒子大小在17~20 nm之間。有二十面體的對(duì)稱結(jié)構(gòu),無(wú)囊膜,對(duì)外界的理化環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗能力[1-4]。PCV按其基因型的差異分為四種類型,即 PCV1、PCV2、PCV3和 PCV4,其中 PCV2和PCV3是最具感染力和致病力的兩型[5]。據(jù)報(bào)道PCV3比PCV2對(duì)仔豬的致病力更強(qiáng)[6]。PCV3感染豬群可引起豬群全系統(tǒng)的炎癥反應(yīng),嚴(yán)重者可導(dǎo)致母豬流產(chǎn)[7]。由于PCV2病毒已被廣泛研究,國(guó)內(nèi)關(guān)于PCV2的疫苗早已普遍應(yīng)用于各個(gè)豬場(chǎng),使用之后大大降低了PCV2的感染率[8],因此本次研究以PCV3為主。任敏等[9]通過(guò)對(duì)新疆PCV3的全基因組進(jìn)行測(cè)序并分析,發(fā)現(xiàn)所得的PCV3分離毒株與美國(guó)報(bào)告的毒株同屬于3b亞群,首次證實(shí)了新疆規(guī)?;i場(chǎng)中已經(jīng)存在PCV3感染的情況。魏其[10]通過(guò)對(duì)新疆最具代表性的13個(gè)地區(qū)進(jìn)行牛PCV3的分子流行病學(xué)調(diào)查和基因特征分析,發(fā)現(xiàn)PCV3已在新疆地區(qū)牛養(yǎng)殖場(chǎng)中廣泛存在。前人對(duì)新疆株P(guān)CV3Cap基因序列研究雖然相對(duì)較多,但關(guān)于阿克蘇地區(qū)PCV3感染情況的研究鮮有報(bào)道,所以本研究對(duì)新疆阿克蘇4個(gè)規(guī)?;i場(chǎng)的能繁母豬、仔豬和育肥豬的采樣樣本進(jìn)行PCV3檢測(cè),以期知曉新疆阿克蘇地區(qū)PCV3感染與流行情況,為該地區(qū)PCV3感染防控工作打下理論基礎(chǔ)。

    1 試驗(yàn)材料

    1.1 樣品來(lái)源

    2020—2021年對(duì)新疆阿克蘇地區(qū)4個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)的能繁母豬、仔豬和育肥豬共采584份全血樣本,詳情見表1。

    表1 樣本列表

    1.2 試驗(yàn)試劑

    表2 試驗(yàn)試劑

    1.3 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

    表3 儀器與設(shè)備

    2 試驗(yàn)方法

    2.1 樣品的預(yù)處理

    吸取抗凝管中的全血樣品1 000μL加入到1.5 mL無(wú)菌離心管中,編號(hào)后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2 豬圓環(huán)病毒3型DNA提取

    按照EasyPure?Viral DNA/RNA Kit試劑盒說(shuō)明書對(duì)全血樣本總DNA進(jìn)行提取,并將提取到的DNA放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.3 豬圓環(huán)病毒3型PCR擴(kuò)增檢測(cè)

    引物選取參照王雪濤等[11]研究結(jié)果,由上海生工生物股份有限公司合成,引物序列和反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件見表4、表5。

    表4 PCV3 PCR引物序列

    表5 PCV3 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件

    2.4 瓊脂糖凝膠電泳

    配制1%的瓊脂糖凝膠,用PCV3(Cap)-F/R PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣,設(shè)置電壓(120 V)、電流(110 mA)、時(shí)間(25~30 min),使用凝膠成像系統(tǒng)于電泳后拍照保存。

    2.5 PCR產(chǎn)物回收與純化

    將PCV3(Cap)-F/R PCR擴(kuò)增基因片段的凝膠,按照普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒使用說(shuō)明操作,對(duì)擴(kuò)增基因片段的凝膠進(jìn)行切膠回收,將回收的目的基因置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.6 PCV3 Cap基因序列測(cè)定及同源性分析

    使用純化后的PCR產(chǎn)物送上海生工測(cè)序,利用DNAStar軟件,將PCR產(chǎn)物測(cè)得的序列與GenBank選取的國(guó)內(nèi)15株P(guān)CV3Cap基因參考序列進(jìn)行同源性比對(duì),參考序列見表6。

    表6 PCV3 Cap基因參考序列

    3 結(jié)果

    3.1 臨床樣品中PCV3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

    以新疆阿克蘇地區(qū)4家規(guī)?;i場(chǎng)采集的584份豬全血樣本的DNA為模板,采用PCV3Cap基因的特異性引物,利用PCR進(jìn)行PCV3Cap基因的擴(kuò)增,共測(cè)出44份陽(yáng)性樣本,擴(kuò)增的目的條帶與預(yù)期大小一致,部分電泳圖見圖1。

    圖1 部分樣本的PCV3 Cap基因PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

    3.2 PCV3 Cap基因序列同源性分析

    在NCBI上對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析,將44份陽(yáng)性樣本PCR產(chǎn)物測(cè)序后進(jìn)行同源性比對(duì),獲得2種PCV3Cap基因序列,分別命名為AKesuCap-1(育肥場(chǎng))和AKesuCap-2(繁育場(chǎng))。通過(guò)DNAStar軟件對(duì)2種檢測(cè)出的PCV3Cap基因序列與15株國(guó)內(nèi)流行株Cap基因序列進(jìn)行同源性比較,并制作PCV3Cap基因同源性表(圖2)及基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖3)。

    圖2 PCV3 Cap基因序列與國(guó)內(nèi)毒株核苷酸同源性分析

    圖3 PCV3 Cap基因序列與國(guó)內(nèi)毒株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析

    將AKesuCap-1(育肥場(chǎng))、AKesuCap-2(繁育場(chǎng))和15株中國(guó)PCV3Cap基因參考序列構(gòu)建同源性表及基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),AKesuCap-1和15株中國(guó)PCV3Cap基因參考序列的同源性在98.9%~100%之間,且與CN/Xinjiang-AK16/2018株同源性達(dá)到了100%,反映了該育肥場(chǎng)存在CN/Xinjiang-AK16/2018毒株感染的情況。同時(shí),AKesuCap-2和15株中國(guó)PCV3Cap基因參考序列的同源性介于98.5%~99.6%之間,與NWHEB21、PCV3-CN-ZJ-QZ-2-2017同源性為99.6%。而且,AKesuCap-1和AKesuCap-2同源性為98.5%。由此可知,2株P(guān)CV3Cap基因核苷酸序列與國(guó)內(nèi)15株P(guān)CV3Cap基因參考核苷酸序列具有高度同源性。而基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹則揭示了AKesuCap-1(育肥場(chǎng))和AKesuCap-2(繁育場(chǎng))具有明顯的遺傳距離,AKesuCap-1與CN/Xinjiang-AK16/2018(MK562412.1)屬于同一分支,AKesuCap-2與 NWHEB21(MG564174.1)在同一分支上。

    3.3 PCV3感染情況調(diào)查

    3.3.1 2020—2021年樣品中PCV3感染情況

    經(jīng)過(guò)對(duì)2020—2021年新疆阿克蘇地區(qū)4個(gè)規(guī)?;i場(chǎng)的584份樣本進(jìn)行PCV3檢測(cè),共檢出PCV3陽(yáng)性樣品44份,總陽(yáng)性檢出率為7.53%。

    3.3.2 不同類型豬場(chǎng)PCV3感染情況

    通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)來(lái)自不同豬場(chǎng)的共584份樣品進(jìn)行PCV3檢測(cè),結(jié)果顯示,繁育場(chǎng)PCV3平均陽(yáng)性率為14.07%(19/135),而育肥場(chǎng)(1、2和3)平均陽(yáng)性率為5.57%(25/449)。經(jīng)過(guò)對(duì)比可以發(fā)現(xiàn),繁育場(chǎng)的PCV3檢出率較育肥場(chǎng)要高,詳情見表7。

    表7 不同類型豬場(chǎng)PCV3檢測(cè)情況

    3.3.3 不同生長(zhǎng)階段的豬群PCV3感染情況

    不同生長(zhǎng)階段的豬群對(duì)PCV3的感染情況不同,能繁母豬和仔豬的感染陽(yáng)性率分別為9.09%和17.50%,而育肥豬(1、2、3)的感染陽(yáng)性率分別為3.33%、5.14%和7.79%。由此可知仔豬的PCV3感染陽(yáng)性率最高,其次是能繁母豬,育肥豬最低,詳見表8。

    表8 不同生長(zhǎng)階段的豬群PCV3 PCR抗原檢測(cè)情況

    4 討論

    PCV3是近些年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類豬圓環(huán)病毒,自2016年在美國(guó)報(bào)道后,其逐漸在世界范圍內(nèi)傳播開來(lái)[12-13]。中國(guó)作為全球最大的豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)也有PCV3的相關(guān)報(bào)道[14]。阿克蘇地處我國(guó)西部邊陲,通過(guò)對(duì)該地區(qū)四個(gè)規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)展開調(diào)查,發(fā)現(xiàn)PCV3各豬場(chǎng)陽(yáng)性發(fā)生率為100%,平均陽(yáng)性率達(dá)7.53%,表明該地區(qū)的養(yǎng)豬場(chǎng)已經(jīng)普遍存在PCV3感染。

    通過(guò)數(shù)據(jù)分析可知,阿克蘇地區(qū)部分豬場(chǎng)PCV3陽(yáng)性率結(jié)果與李靜等[15]研究結(jié)果相比要更低,推測(cè)可能與樣品來(lái)源的差異有關(guān)。所有陽(yáng)性數(shù)據(jù)中,仔豬陽(yáng)性率最高,育肥豬陽(yáng)性率最低,且能繁母豬和仔豬的PCV3陽(yáng)性率要高于育肥豬群。這與黃翠琴等[16]研究結(jié)果一致。

    通過(guò)對(duì)44份陽(yáng)性樣本PCR產(chǎn)物測(cè)序進(jìn)行同源性比對(duì)分析,得到2種PCV3Cap基因序列。測(cè)序結(jié)果表明,AKesuCap-1、AKesuCap-2和15株中國(guó)PCV3Cap基因參考序列同源性較高,且與2018年QIAO M F等[17]在新疆阿克蘇地區(qū)商品豬場(chǎng)所發(fā)現(xiàn)的PCV3毒株相一致,推測(cè)可能PCV3的Cap基因在當(dāng)?shù)剡M(jìn)化具有相對(duì)穩(wěn)定性,要想進(jìn)一步證實(shí),還需要開展更廣泛的針對(duì)PCV3的研究。

    5 結(jié)論

    新疆阿克蘇地區(qū)部分規(guī)?;i場(chǎng)存在PCV3感染,繁育場(chǎng)豬比育肥場(chǎng)豬感染率更高。

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