Ca2+對(duì)‘伏脆蜜’裂果調(diào)控生理的研究

張晶晶，宋璐瑤，王振磊 ，吳翠云 ，林敏娟*

（1塔里木大學(xué)園藝與林學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

（2南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

鮮食棗‘伏脆蜜’具有早熟豐產(chǎn)、耐旱、含糖量高且口味酸甜等特點(diǎn)，深受廣大消費(fèi)者喜愛［1］。但因成熟期‘伏脆蜜’裂果率較高，因而嚴(yán)重影響果實(shí)品質(zhì)與產(chǎn)量。

分布在纖維素和半纖維素微絲中的果膠質(zhì)與木質(zhì)素、蛋白質(zhì)及礦物質(zhì)共同構(gòu)成植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)物質(zhì)變化與裂果的發(fā)生密切相關(guān)，有關(guān)學(xué)者對(duì)龍眼［2］、番茄［3］及錦橙［4］研究發(fā)現(xiàn)，裂果果皮中纖維素及果膠含量顯著低于正常果果皮。Ca2+在維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮著重要作用，缺鈣是導(dǎo)致果實(shí)裂果的重要原因之一［5］。通過噴施鈣制劑可補(bǔ)充果實(shí)的Ca2+含量，高活性鈣與果膠質(zhì)結(jié)合形成果膠酸鈣，果膠酸鈣可以連接相鄰細(xì)胞，增加表皮層厚度和細(xì)胞間韌性。郭紅彥等［6］研究發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期噴施CaCl2可提高‘壺瓶棗’果皮中原果膠及纖維素含量，降低棗果實(shí)裂果率。因此Ca2+可通過影響植物細(xì)胞壁中物質(zhì)的含量影響裂果的發(fā)生［7-9］。

有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞壁代謝相關(guān)酶對(duì)細(xì)胞壁網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成起主要作用，細(xì)胞壁代謝酶可通過降解細(xì)胞壁物質(zhì)含量而降低果皮強(qiáng)度，導(dǎo)致裂果率增加［8］。易裂荔枝品種‘糯米糍’中的果膠酶、纖維素酶和果膠甲酯酶活性顯著高于耐裂荔枝品種‘淮枝’［10］。噴施鈣制劑可明顯降低植物細(xì)胞壁降解酶活性，使細(xì)胞壁物質(zhì)不易發(fā)生水解，有利于維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，增加果皮抗裂能力，不易裂果［7,11］。噴施外源鈣素可顯著降低‘寒富’［12］蘋果及臍橙［13］中果膠甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶的活性，減少細(xì)胞壁物質(zhì)的水解，提高果實(shí)硬度從而降低果實(shí)裂果率。果皮解剖結(jié)構(gòu)也是引起裂果的重要因素，不同品種果實(shí)之間由于果皮組織解剖結(jié)構(gòu)不同會(huì)導(dǎo)致果皮延展性及抗張強(qiáng)度不同，致使裂果率不同［14］，果實(shí)表皮層厚度、表皮細(xì)胞大小與形狀、細(xì)胞排列疏松程度和果肉空腔大小都與果實(shí)抗裂相關(guān)［15-16］。

目前關(guān)于棗裂果的研究多集中于同一品種不同部位或者不同品種相同部位的激素含量、礦物質(zhì)元素、果皮解剖結(jié)構(gòu)等方面。關(guān)于噴施外源Ca素對(duì)棗裂果部位及非裂果部位細(xì)胞壁物質(zhì)含量、細(xì)胞壁代謝酶活性、果皮解剖結(jié)構(gòu)等方面的研究報(bào)道較少。因此本研究以易裂鮮食棗品種‘伏脆蜜’為試驗(yàn)材料，測(cè)定噴施CaCl2、噴施清水、自然條件處理后的‘伏脆蜜’棗裂果及非裂果部位細(xì)胞壁物質(zhì)含量、細(xì)胞壁代謝酶活性，觀察果皮解剖結(jié)構(gòu)，以期通過研究噴施CaCl2對(duì)棗裂果及相關(guān)生理指標(biāo)的影響，探討Ca2+對(duì)棗裂果的作用機(jī)理，為棗裂果防治提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為易裂鮮食棗品種‘伏脆蜜’，來自于塔里木大學(xué)園藝試驗(yàn)站棗種質(zhì)資源圃，樹齡10年，常規(guī)田間管理，水肥條件一致。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理方法

于2021年棗樹盛花期，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致、開花較多的果樹進(jìn)行掛牌標(biāo)記。盛花期后30～65 d對(duì)棗樹進(jìn)行噴施清水以及噴施CaCl2（200倍液）處理，以自然條件對(duì)照。每個(gè)處理選取10棵棗樹，每隔7 d在傍晚黃昏時(shí)分從棗樹不同方向分別噴施CaCl2、噴施清水，至葉面、果面自然滴水為止，共噴施5次。在棗裂果中期（盛花期后80 d）采摘100個(gè)裂果果實(shí)，蒸餾水清洗干凈，取裂果部位和非裂果部位果皮，液氮冷凍后裝入自封袋，做好標(biāo)記，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 棗裂果方式及裂果率調(diào)查

盛花期后80 d（棗裂果中期），分別調(diào)查統(tǒng)計(jì)噴施CaCl2、噴施清水以及自然條件下100個(gè)棗裂果的裂果方式（縱裂、環(huán)裂、不規(guī)則裂），每個(gè)處理重復(fù)3次。分別調(diào)查統(tǒng)計(jì)噴施CaCl2、噴施清水及自然條件下3棵棗樹總果數(shù)以及裂果數(shù)，并計(jì)算裂果率［17］。

1.4 細(xì)胞壁代謝酶活性測(cè)定

纖維素酶(cellulase，CE)和多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)活性采用DNS終止反應(yīng)法［18］，果膠甲酯酶(pectin methylesterase，PME)活性及β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-Gal)活性測(cè)定采用果膠甲酯化程度試劑盒及β-半乳糖苷酶試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）。

纖維素酶及多聚半乳糖醛酸酶液提?。悍Q取0.2 g果皮于預(yù)冷的研缽中，加入1 mL 0.04 mol/L，pH為6.0的醋酸鈉溶液研磨，將研磨過后的勻漿倒入10 mL離心管，用醋酸鈉緩沖液沖洗研缽3遍，每次加1mL，將樣液置于4℃冰箱中保存1h后，4℃，5000 r/min離心30 min，上清液即為兩種酶的粗提取液，將提取液置于0℃碎冰上待測(cè)。

纖維素酶：吸取2 mL 1%甲基纖維素和0.5 mL粗酶液于試管中，40℃水浴保溫1 h后立即加入2.5 mL DNS終止反應(yīng)，置于沸水中顯色5 min，待冷卻后于540 nm下比色。

多聚半乳糖醛酸酶：吸取0.2 mL 0.04 mol/L，pH為4.6的醋酸鈉緩沖液于玻璃試管中，加入0.3 mL 1%多聚半乳糖醛酸溶液，吸取0.1 mL酶液于試管中，加入0.4 mL蒸餾水于37℃水浴保溫1 h，立即加入1 mL DNS終止反應(yīng)，置于沸水中顯色5 min，待冷卻后于540 nm下比色。

果膠甲酯酶：取適量棗果皮組織，液氮研磨，取約0.1 g組織，加入1 mL蒸餾水，冰浴震蕩2 min，4℃9 500 r/min高速離心10 min，棄去上清液，留沉淀。沉淀中加入1 mL提取液，混勻后90℃水浴2 h，冷卻后4℃9 500 r/min離心10 min，上清液即為果膠酯酶待測(cè)液。

β-半乳糖苷酶：取0.1 g棗果皮組織于研缽中，液氮迅速研磨，加入1 mL提取液，冰浴震蕩2 min，4℃11 500 r/min離心10 min，上清液即為β-Gal提取液，放置0℃冰上待測(cè)。

1.5 細(xì)胞壁物質(zhì)含量測(cè)定

纖維素和半纖維素的含量測(cè)定采用蒽酮比色法，水溶性果膠、離子結(jié)合型果膠及共價(jià)結(jié)合型果膠的含量測(cè)定采用咔唑硫酸比色法［18］。

稱取1.0 g果皮，加入2.5 mL 80%的乙醇溶液，將勻漿倒入15 mL離心管中再依次加入2.5 mL 80%的乙醇提取液沖洗3次，于90℃水浴20 min，冷卻后6 000 r/min離心15 min，棄去上清液（重復(fù)5～6次），加入10 mL 90%的二甲基亞砜于4℃冰箱靜置15 h，6 000 r/min離心，棄上清液，加入10 mL氯仿∶甲醇為1∶1的混合液沖洗濾渣，離心棄上清液，加10 mL丙酮，洗滌沉淀（重復(fù)2遍），棄去上清液，將沉淀置于45℃恒溫箱中烘干至恒重，得到粗細(xì)胞壁。

粗細(xì)胞壁用50 mmol/L的乙酸鈉溶液(pH為6.5)震蕩3 h提取得到水溶性果膠，5 000 r/min離心后取出水溶性果膠溶液，在沉淀中加入50 mmol/L EDTA溶液（含50 mmol/L的乙酸鈉）震蕩3 h得到離子結(jié)合型果膠，5 000 r/min離心后取出離子結(jié)合型果膠溶液，在沉淀中加入50 mmol/L碳酸鈉溶液（含2 mmol/L EDTA）得到共價(jià)結(jié)合型果膠，剩余沉淀用4 mmol/L氫氧化鉀溶液提取12 h，洗滌沉淀1次，合并2次上清液，得到半纖維素提取液，剩余沉淀再用ddH2O洗滌2次，離心棄上清液，沉淀即為纖維素，加入10 mL 60%濃硫酸置于4℃冰箱水解12 h，以測(cè)定纖維素含量。

1.6 石蠟切片制作與解剖結(jié)構(gòu)觀察

石蠟切片制作在參考高秋玲等［19］研究方法的基礎(chǔ)上略有改動(dòng)。用不銹鋼刀片在噴施CaCl2處理、噴施清水處理、自然條件的裂果及非裂果部位分別切取5 mm×5 mm大的棗果皮組織，立即放入由50%乙醇∶醋酸∶38%甲醛配置比例為90∶5∶5的FAA固定液中，抽至真空，常溫保存?zhèn)溆?。FAA固定棗果實(shí)材料經(jīng)乙醇梯度脫水-二甲苯透明-浸蠟-包埋、修蠟-切片（5～10 μm）、粘片-二甲苯40 ℃脫蠟-染色（番紅，固綠）-封片。將噴施CaCl2、噴施清水、自然條件下的裂果及非裂果部位分別制作6張石蠟切片，在光學(xué)顯微鏡（10×），總放大倍率為6.3倍下觀測(cè)并拍照，每個(gè)切片觀察5個(gè)視野。測(cè)量果皮蠟質(zhì)層厚度、表皮層厚度、內(nèi)表皮層厚度及果肉空腔大小。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 7.55軟件和Microsoft Office Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并作圖，采用Duncan新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)‘伏脆蜜’裂果方式及裂果率的影響

由表1分析可知，縱裂是‘伏脆蜜’主要的裂果方式，縱裂率為77.00%～81.00%，環(huán)裂率為9.00%～15.33%，不規(guī)則裂變化范圍為7.67%～10.00%；噴施CaCl2可顯著降低棗裂果率，噴施CaCl2后棗裂果率分別比自然條件及噴施清水處理低10.61%、24.29%。

表1 不同處理對(duì)‘伏脆蜜’裂果方式及裂果率的影響 %

2.2 不同處理對(duì)‘伏脆蜜’果皮細(xì)胞壁代謝酶活性的影響

由表2分析可知，噴施CaCl2、噴施清水及自然條件下棗果皮不同部位細(xì)胞壁代謝酶活性存在顯著差異，噴施CaCl2后非裂果部位CE及β-Gal活性高達(dá)2 678.63 U/g、25.35 U/g，高于自然條件及噴施清水處理裂果及非裂果部位酶活性；噴施CaCl2后的‘伏脆蜜’PG活性顯著降低，非裂果部位PG值最低為2 149.29 U/g，分別比自然條件及噴施清水處理非裂果部位酶活性低74.34 U/g、258.70 U/g；自然條件及噴施清水處理裂果及非裂果部位PME活性顯著高于噴施CaCl2處理，噴施CaCl2后非裂果部位酶活性相比自然條件及噴施清水處理降低12.29%、20.15%。

表2 不同處理對(duì)‘伏脆蜜’果皮細(xì)胞壁代謝酶活性的影響 U/g

2.3 不同處理對(duì)‘伏脆蜜’果皮細(xì)胞壁物質(zhì)含量的影響

由表3分析可知，噴施CaCl2、噴施清水及自然條件下棗果皮裂果及非裂果部位細(xì)胞壁物質(zhì)含量差異顯著，噴施CaCl2和噴施清水處理及自然條件非裂果部位的水溶性果膠、離子結(jié)合型果膠、共價(jià)結(jié)合型果膠、半纖維素及纖維素含量顯著高于裂果部位。噴施CaCl2后非裂果部位水溶性果膠、離子結(jié)合型果膠、共價(jià)結(jié)合型果膠、半纖維素及纖維素含量分別為2.75%、1.00%、1.86%、1.45%、2.65%，顯著高于噴施清水處理及自然條件裂果及非裂果部位酶活性。

表3 不同處理對(duì)‘伏脆蜜’果皮細(xì)胞壁物質(zhì)含量的影響 %

2.4 不同處理對(duì)‘伏脆蜜’果皮解剖結(jié)構(gòu)的影響

由表4分析可知，噴施CaCl2、噴施清水及自然條件下非裂果部位蠟質(zhì)層、表皮層及內(nèi)表皮層厚度均顯著高于裂果部位，3個(gè)處理非裂果部位棗果皮蠟質(zhì)層、表皮層、內(nèi)表皮層厚度均表現(xiàn)為噴施CaCl2>自然條件>噴施清水，噴施CaCl2處理后非裂果部位蠟質(zhì)層厚度相比自然條件及噴施清水非裂果部位高22.38%及25.73%；自然條件及噴施CaCl2、噴施清水后非裂果部位表皮層厚度差異不顯著；噴施CaCl2處理下非裂果部位內(nèi)表皮層厚度分別是自然條件及噴施清水非裂果部位的1.05倍及1.14倍；噴施CaCl2處理后非裂果部位果肉空腔最小值為100.13μm。

表4 不同處理對(duì)‘伏脆蜜’果皮細(xì)胞壁解剖結(jié)構(gòu)的影響 μm

由圖1可知，非裂果部位相比裂果部位表皮層及內(nèi)表皮層細(xì)胞排列緊密且整齊，噴施CaCl2后棗果皮細(xì)胞相比自然條件及噴施清水處理后裂果和非裂果部位棗果皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，表皮細(xì)胞排列整齊；噴施清水后裂果部位表皮層有明顯龜裂現(xiàn)象，噴施CaCl2后裂果部位和非裂果棗果肉空腔相比自然條件和清水處理后的小且少。

圖1 不同處理后‘伏脆蜜’果皮不同部位細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化

3 討論

3.1 噴施CaCl2處理細(xì)胞壁代謝酶與裂果的關(guān)系

果膠酶分為多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲酯酶、原果膠酶及果膠裂解酶，這四種酶可協(xié)同作用將復(fù)雜的果膠分解為小分子物質(zhì)致使植物細(xì)胞壁被破壞，從而導(dǎo)致果皮細(xì)胞壁延展性降低，果實(shí)裂果率增加［20-21］。錦橙果皮中Ca2+含量較低會(huì)導(dǎo)致PG活性升高，裂果率升高，噴施CaCl2可顯著降低錦橙裂果率［4］。丁改秀等［22］研究結(jié)果表明降低PME活性可降低‘壺瓶棗’裂果率。β-Gal是一種存在于植物、動(dòng)物、微生物的糖苷鍵水解酶［23］，β-Gal水解以后，抑制番茄中β-半乳糖苷酶基因TBG6的表達(dá)，導(dǎo)致裂果率上升［24］。CE可將不溶性纖維素轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)，降低果皮機(jī)械強(qiáng)度［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，噴施CaCl2后非裂果部位PG及PME活性顯著低于自然條件及噴施清水處理裂果及非裂果部位酶活性，β-Gal活性及CE活性高于自然條件及噴施清水處理裂果及非裂果部位酶活性，與王建宇等［18］對(duì)‘伏脆蜜’非裂果部位CE活性顯著高于裂果部位CE活性研究結(jié)果一致，郭紅彥等［6］認(rèn)為噴施CaCl2可降低‘壺瓶棗’的CE活性，關(guān)于Ca2+對(duì)棗果CE活性的影響仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

3.2 噴施CaCl2處理細(xì)胞壁物質(zhì)與裂果的關(guān)系

棗果皮細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)由果膠質(zhì)、纖維素及半纖維素等多糖物質(zhì)組成，細(xì)胞壁物質(zhì)含量的變化及纖維素分子在細(xì)胞壁內(nèi)的排列方式與裂果緊密相關(guān)［26］。當(dāng)番荔枝果實(shí)中原果膠合成被抑制時(shí)，果皮容易開裂［27］?！笾Α?8］及‘壺瓶棗’［6］果皮中鈣含量較高時(shí)，纖維素、半纖維素及果膠質(zhì)含量也高，與裂果率呈負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，噴施CaCl2處理非裂果部位果膠類物質(zhì)、纖維素及半纖維素含量都顯著高于噴施清水處理及自然條件裂果及非裂果部位細(xì)胞壁物質(zhì)含量。王建宇等［18］研究也發(fā)現(xiàn)非裂果部位果膠質(zhì)含量顯著高于裂果部位?？赡苁且?yàn)镃a素抑制了細(xì)胞壁代謝酶的活性，降低了纖維素及果膠類物質(zhì)分解速度，最終導(dǎo)致裂果率下降。

3.3 噴施CaCl2處理細(xì)胞壁解剖結(jié)構(gòu)與裂果的關(guān)系

果實(shí)的外表皮由角質(zhì)層、表皮細(xì)胞和亞表皮細(xì)胞組成。棗果果皮角質(zhì)層厚度、表皮層厚度及細(xì)胞排列的致密及均勻度與棗果的抗裂性密切相關(guān)［29-30］。角質(zhì)層是植物與外界的第一接觸面，角質(zhì)層蠟質(zhì)是由位于角質(zhì)層外的外層蠟質(zhì)和深嵌在角質(zhì)層中的內(nèi)層蠟質(zhì)兩部分構(gòu)成［31］?！`武長(zhǎng)棗’‘贊皇大棗’及其他鮮棗品種的果皮表皮層厚度、亞表皮層厚度、表皮層數(shù)均與裂果率呈負(fù)相關(guān)［32-34］。郗鑫等［35］通過對(duì)棗果表皮細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，耐裂品種及正常果皮細(xì)胞排列緊密，易裂品種棗果皮呈長(zhǎng)圓形或卵圓形且排列疏松無(wú)規(guī)則。本研究結(jié)果表明，噴施CaCl2處理非裂果部位蠟質(zhì)層、表皮層、內(nèi)表皮層厚度顯著高于自然條件及噴施清水處理，噴施CaCl2處理后棗果皮表皮細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯龜裂現(xiàn)象，且果肉空腔較小，這與郭紅彥等［6］對(duì)噴施CaCl2后可使棗果角質(zhì)層保存完整、表皮細(xì)胞排列緊實(shí)規(guī)整、不發(fā)生龜裂且果肉空腔較小研究一致，因此噴施CaCl2可增強(qiáng)棗果抗裂性。

4 結(jié)論

噴施外源Ca可以顯著降低棗果皮非裂果部位PG及PME活性，提高CE及β-Gal活性，顯著提高纖維素、半纖維素、水溶性果膠、離子結(jié)合型果膠及共價(jià)結(jié)合型果膠含量，從而使棗果皮蠟質(zhì)層、表皮層、內(nèi)表皮層的厚度增加，維持棗果皮較好的穩(wěn)定性及延展性。綜上所述，噴施CaCl2可顯著降低鮮食棗‘伏脆密’的裂果率。