宮腔粘連組織中miR-22、TGFβR1 表達(dá)與三維能量超聲參數(shù)的相關(guān)性及臨床意義

張友 王琮 楊燕

宮腔粘連（intrauterine adhesion，IUA）是子宮內(nèi)膜基底層破壞后出現(xiàn)的子宮壁之間的粘連，多見(jiàn)于人工流產(chǎn)、刮宮等宮腔操作后，會(huì)導(dǎo)致月經(jīng)異常以及不孕。IUA 的常用治療手段是宮腔鏡下IUA 松解術(shù)或切除術(shù)，雖然手術(shù)操作的技術(shù)不斷進(jìn)步，但手術(shù)操作仍不可避免會(huì)造成子宮內(nèi)膜損傷并導(dǎo)致術(shù)后再次發(fā)生IUA［1-2］。細(xì)胞外基質(zhì)沉積是IUA 發(fā)生發(fā)展的重要生物學(xué)特征，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)代謝的關(guān)鍵細(xì)胞因子，其與TGF-β 受體1（TGF-β receptor 1，TGFβR1）結(jié)合后能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的水解和異常沉積，進(jìn)而促進(jìn)組織纖維化及粘連［3］。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)研究證實(shí)，微小RNA（microRNA，miR）-22 是TGFβR1的上游調(diào)控分子，過(guò)表達(dá)miR-22能夠抑制TGFβR1并改善IUA大鼠的組織粘連［4］。為了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)miR-22靶向調(diào)控TGFβR1在IUA 發(fā)病中的作用，本研究將以IUA 患者為對(duì)象，通過(guò)三維能量超聲評(píng)價(jià)組織粘連程度，分析IUA 組織中miR-22、TGFβR1表達(dá)與三維能量超聲參數(shù)的相關(guān)性及臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2018 年1 月至2020 年12 月于安徽理工大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受IUA 分離術(shù)的48 例IUA患者作為IUA 組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合指南中IUA 的診斷［5］；②存在月經(jīng)異常和周期性腹痛；③接受宮腔鏡手術(shù)；④有妊娠需求。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并生殖系統(tǒng)先天畸形；②合并多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥等婦科疾??；③合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病等。選擇54 例接受宮腔鏡檢查的輸卵管性不孕患者作為對(duì)照組。IUA 組患者年齡21～44 歲、平均（31.25±5.49）歲，體質(zhì)量指數(shù)（23.12±6.23）kg/m2；對(duì)照組患者年齡21～42 歲、平均（28.71±5.33）歲，體質(zhì)量指數(shù)（22.89±6.82）kg/m2。兩組間一般資料的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究取得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，獲得入組患者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1miR-22、TGFβR1表達(dá)水平的檢測(cè)

取IUA 組和對(duì)照組的子宮內(nèi)膜組織，采用總RNA 提取試劑盒提取組織中的RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量檢測(cè)試劑盒對(duì)cDNA 中的miR-22、TGFβR1進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)。檢測(cè)的反應(yīng)體系如下：cDNA 1 μL、試劑盒內(nèi)反應(yīng)混合液10 μL、上下游引物各0.6 μL、去離子水7.8 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min 后95℃15 s、特異性退火溫度25 s、72℃30 s，重復(fù)40次。所用基因的引物序列及特異性退火溫度見(jiàn)表1。完成反應(yīng)后得到循環(huán)曲線及循環(huán)閾值（Cycle threshold，Ct），以β-ɑctin為內(nèi)參、按照公式2-ΔΔCt計(jì)算miR-22、TGFβR1的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 miR-22、TGFβR1、β-ɑctin 的引物序列及退火溫度Table 1 Primer sequence and annealing temperature of miR-22，TGFβR1，β-ɑctin

1.2.2 子宮內(nèi)膜三維能量超聲檢查

采用三維多普勒超聲儀對(duì)兩組患者進(jìn)行三維能量超聲檢查，探頭頻率3～9 MHz，首先進(jìn)行常規(guī)超聲探查，顯示子宮最大縱切面后固定該平面，啟動(dòng)能量多普勒模式，取樣框比子宮略大、將子宮完全包繞，啟動(dòng)三維功能鍵并勾勒子宮內(nèi)膜輪廓，檢測(cè)體積（Volume，V）、血管指數(shù)（vascular index，VI）、血流指數(shù)（flow index，F(xiàn)I）、血管血流指數(shù)（vascular flow index，VFI）。

1.2.3 IUA 嚴(yán)重程度及預(yù)后的評(píng)估

參照指南［5］中Nasr 宮腔粘連分級(jí)評(píng)估IUA 嚴(yán)重程度，從峽部粘連、膜狀粘連、致密粘連、輸卵管開(kāi)口、管狀宮腔、月經(jīng)類型、孕產(chǎn)史進(jìn)行評(píng)分，計(jì)算總得分，0～4 分為輕度、5～10 分為中度、11～22 分為重度。根據(jù)妊娠情況評(píng)價(jià)IUA 患者的預(yù)后，共隨訪2 年。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，采用Pearson 檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析，采用K-M 曲線及l(fā)og rank 檢驗(yàn)分析累積妊娠率的差異。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IUA 組與對(duì)照組miR-22、TGFβR1 表達(dá)水平的比較

IUA 組局部組織中miR-22的相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組，TGFβR1的相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 IUA組與對(duì)照組miR-22、TGFβR1表達(dá)水平的比較（±s）Table 2 Comparison of miR-22 and TGFβR1 expression levels between IUA group and control group（±s）

表2 IUA組與對(duì)照組miR-22、TGFβR1表達(dá)水平的比較（±s）Table 2 Comparison of miR-22 and TGFβR1 expression levels between IUA group and control group（±s）

組別IUA 組對(duì)照組t 值P 值n 48 54 miR-22 0.66±0.17 1.00±0.22 5.489 0.000 TGFβR1 1.29±0.25 1.00±0.28 8.653 0.000

2.2 IUA 組miR-22、TGFβR1 表達(dá)水平的相關(guān)性

IUA 組局部組織中miR-22的相對(duì)表達(dá)水平與TGFβR1的相對(duì)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.4146。見(jiàn)圖1。

圖1 IUA 組miR-22、TGFβR1 表達(dá)水平的相關(guān)性Figure 1 Correlation of miR-22 and TGFβR1 expression level in IUA group

2.3 IUA 組中不同嚴(yán)重程度患者miR-22、TGFβR1表達(dá)水平的比較

IUA 組中中重度患者局部組織中miR-22的相對(duì)表達(dá)水平低于輕度患者，TGFβR1的相對(duì)表達(dá)水平高于輕度患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 IUA 組中不同嚴(yán)重程度患者miR-22、TGFβR1 表達(dá)水平的比較（±s）Table 3 Comparison of miR-22 and TGFβR1 expression levels among patients with different severity（±s）

表3 IUA 組中不同嚴(yán)重程度患者miR-22、TGFβR1 表達(dá)水平的比較（±s）Table 3 Comparison of miR-22 and TGFβR1 expression levels among patients with different severity（±s）

嚴(yán)重程度輕度中重度t 值P 值n 26 22 miR-22 0.75±0.22 0.55±0.19 3.171 0.003 TGFβR1 1.10±0.24 1.52±0.32 4.640 0.000

2.4 IUA 組與對(duì)照組三維能量超聲參數(shù)的比較

IUA 組患者子宮內(nèi)膜的三維能量超聲參數(shù)V、VI、FI、VFI 均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表4。

圖2 宮腔粘連的超聲圖像Figure 2 ultrasonic image of intrauterine adhesion

表4 IUA 組與對(duì)照組三維能量超聲參數(shù)的比較（±s）Table 4 Comparison of three-dimensional energy ultrasonic parameters between IUA group and control group（±s）

表4 IUA 組與對(duì)照組三維能量超聲參數(shù)的比較（±s）Table 4 Comparison of three-dimensional energy ultrasonic parameters between IUA group and control group（±s）

組別IUA 組對(duì)照組t 值P 值n 48 54 V（cm3）3.41±0.62 4.49±0.77 7.739 0.000 VI（%）3.74±0.89 4.71±0.94 5.333 0.000 FI 23.09±4.51 26.65±6.44 3.195 0.000 VFI 1.16±0.25 1.49±0.31 5.870 0.000

2.5 IUA 組miR-22、TGFβR1 表達(dá)水平與三維能量超聲參數(shù)的相關(guān)性

IUA 組患者局部組織中miR-22的相對(duì)表達(dá)水平與V、VI、FI、VFI 呈正相關(guān)，TGFβR1的相對(duì)表達(dá)水平與V、VI、FI、VFI 呈負(fù)相關(guān)。見(jiàn)表5。

表5 IUA 組miR-22、TGFβR1 表達(dá)水平與三維能量超聲參數(shù)的相關(guān)性Table 5 Correlation between miR-22，TGFvR1 expression level and three-dimensional energy ultrasonic parameters in IUA group

2.6 IUA 組miR-22、TGFβR1 表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系

IUA 組中不同miR-22、TGFβR1表達(dá)水平的患者累積妊娠率的K-M 曲線見(jiàn)圖3。經(jīng)log-rank 檢驗(yàn)：IUA 組中miR-22表達(dá)≥中位數(shù)患者的2 年累積妊娠率高于miR-22表達(dá)＜中位數(shù)患者，TGFβR1表達(dá)≥中位數(shù)患者的2 年累積妊娠率低于TGFβR1表達(dá)＜中位數(shù)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 K-M 曲線Figure 3 K-M curve

3 討論

IUA 分離術(shù)及切除術(shù)是治療IUA 的常用手段，能夠有效分離或清除粘連的宮腔組織，但手術(shù)操作也不可避免會(huì)造成子宮內(nèi)膜損害，術(shù)后IUA復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較高［6-7］。

成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖、纖維結(jié)締組織異常增生是與IUA 發(fā)生密切相關(guān)的生物學(xué)環(huán)節(jié)，參與該環(huán)節(jié)的關(guān)鍵調(diào)控分子是TGF-β。TGFβR1是介導(dǎo)TGF-β 生物學(xué)效應(yīng)的膜受體，能夠招募下游Smad3 并促進(jìn)膠原蛋白、層黏連蛋白合成，進(jìn)而導(dǎo)致組織纖維化的發(fā)生［8-10］。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)刮宮術(shù)建立了IUA 大鼠模型，IUA 大鼠內(nèi)膜組織中TGFβR1的表達(dá)水平明顯增加［4］，提示TGFβR1的高表達(dá)與IUA 的發(fā)生有關(guān)。本研究對(duì)IUA 患者進(jìn)行了檢測(cè)，與正常子宮內(nèi)膜組織比較，IUA 子宮內(nèi)膜組織中TGFβR1的表達(dá)水平增加，與上述研究結(jié)果一致。進(jìn)一步通過(guò)Nasr 宮腔粘連分級(jí)評(píng)估IUA 嚴(yán)重程度并分析可知：中重度IUA 患者子宮內(nèi)膜組織中TGFβR1的表達(dá)水平高于輕度IUA 患者，結(jié)果表明TGFβR1表達(dá)增加與IUA 的發(fā)生及粘連程度的加重有關(guān)。

TGFβR1表達(dá)的上游調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，其中miRs能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)［11］，多項(xiàng)研究證實(shí)TGFβR1是miR-22的下游靶基因之一［12-13］。本研究對(duì)IUA 患者進(jìn)行了檢測(cè)，與正常子宮內(nèi)膜組織比較，IUA 子宮內(nèi)膜組織中miR-22的表達(dá)水平降低，與IUA 大鼠中miR-22減輕粘連的生物學(xué)作用吻合；同時(shí)，miR-22的表達(dá)與TGFβR1呈負(fù)相關(guān)，中重度IUA患者子宮內(nèi)膜組織中miR-22的表達(dá)水平低于輕度IUA 患者。以上結(jié)果表明miR-22表達(dá)降低與IUA 的發(fā)生及粘連程度的加重有關(guān)，并且miR-22可能通過(guò)靶向調(diào)控TGFβR1的參與IUA 的發(fā)病。

超聲檢查是臨床診斷IUA 并評(píng)估病情的常用手段，三維能量超聲是新的超聲檢查技術(shù)，相關(guān)的超聲特征包括宮腔縮小、子宮內(nèi)膜容積減小以及粘連組織中血流灌注不足［14］。隨著IUA 病情加重，上述超聲變化更加顯著。本研究對(duì)IUA 患者進(jìn)行了三維能量超聲檢查，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，IUA 患者子宮內(nèi)膜的V、VI、FI、VFI 均降低，符合IUA 發(fā)病過(guò)程中子宮內(nèi)膜容積減小以及血流灌注不足的特征［14］。進(jìn)一步在IUA 患者中進(jìn)行相關(guān)性分析可知：miR-22的表達(dá)水平與超聲參數(shù)V、VI、FI、VFI 呈負(fù)相關(guān)，TGFβR1的表達(dá)水平與超聲參數(shù)V、VI、FI、VFI 呈正相關(guān)，表明IUA 發(fā)病過(guò)程中miR-22及TGFβR1表達(dá)的變化會(huì)加重子宮內(nèi)膜容積減小以及血流灌注不足。

miR-22及其靶向調(diào)控的TGFβR1參與成纖維細(xì)胞增殖及組織纖維化的調(diào)控，兩者異常表達(dá)可能在術(shù)后促進(jìn)子宮內(nèi)膜纖維化的發(fā)生、嚴(yán)重者出現(xiàn)IUA 復(fù)發(fā)，進(jìn)而影響妊娠。本研究對(duì)IUA 患者的妊娠情況進(jìn)行了隨訪，分析其與miR-22、TGFβR1表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果顯示，miR-22表達(dá)降低、TGFβR1表達(dá)增加會(huì)導(dǎo)致累積妊娠率顯著降低。

綜上所述，IUA 組織中miR-22低表達(dá)、TGFβR1高表達(dá)存在相關(guān)性，同時(shí)兩者表達(dá)的變化與粘連加重、子宮內(nèi)膜體積縮小及血流灌注減少、妊娠預(yù)后不良有關(guān)。