內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞膠質(zhì)增生的作用及機(jī)制*

酆嘯， 龍秋雙， 甘詩泉， 沈祥春*， 陳妍*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 & 貴州省高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是一類嚴(yán)重的糖尿病微血管病變[1]。體內(nèi)長期高糖(high glucose,HG)環(huán)境下誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜膠質(zhì)增生，是DR的早期特征，其中Müller細(xì)胞作為視網(wǎng)膜中的主要支撐和營養(yǎng)細(xì)胞，在膠質(zhì)增生中扮演重要角色[2-4]。研究表明，HG誘導(dǎo)Müller細(xì)胞發(fā)生膠質(zhì)增生，表現(xiàn)為細(xì)胞異常增殖和膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP表達(dá)上調(diào)[5]，并且導(dǎo)致氧化應(yīng)激、炎癥介質(zhì)產(chǎn)生和分泌、以及視網(wǎng)膜內(nèi)環(huán)境破壞[6-7]。尋找調(diào)節(jié)Müller細(xì)胞膠質(zhì)增生的新機(jī)制，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行創(chuàng)新藥物的開發(fā)，成為DR防治的研究熱點(diǎn)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡引發(fā)的一種病理過程，表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白聚集[8]。細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變可中斷蛋白質(zhì)加工，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白質(zhì)的積累，并激活未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)，這種應(yīng)激反應(yīng)的觸發(fā)因素包括缺血、缺氧、HG和氧化應(yīng)激等[9-10]。UPR最初旨在恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能和促進(jìn)細(xì)胞存活，但當(dāng)持續(xù)發(fā)生ERS時(shí)，通過蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase RNA-like ER kinase ,PERK)途徑參與DR的發(fā)生，干擾視網(wǎng)膜細(xì)胞的生理代謝[11]。研究表明ERS與DR的病理過程密切相關(guān)，參與調(diào)節(jié)了DR中的氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡、血-視網(wǎng)膜屏障破壞和血管生成等[12-13]。HG同樣可誘導(dǎo)Müller細(xì)胞發(fā)生ERS，此時(shí)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)蛋白水平迅速上調(diào)，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)入內(nèi)腔，并通過作用轉(zhuǎn)錄激活因子4(activating transcription factor 4,ATF4)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白合成與分泌[14-15]，然而ERS與Müller細(xì)胞膠質(zhì)增生的關(guān)系尚不清楚。因此，本研究通過建立HG誘導(dǎo)的Müller細(xì)胞膠質(zhì)增生體外模型，使用ERS特異性抑制劑4-苯基丁酸(4-Phenylbutyric acid，4-PBA)進(jìn)行干預(yù)，探討ERS與Müller細(xì)胞膠質(zhì)增生的關(guān)系，為抑制ERS防治DR的創(chuàng)新藥物提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞株 視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)Müller細(xì)胞株購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司。

1.1.2主要藥物及試劑 低糖培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM；美國Gibco公司)和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS；美國Gibco公司)，4-PBA(美國MedChemExpress)，抗GRP78、PERK、eukaryotic translation initiation factor 2 alpha(eIF2α)、ATF4和glial fibrillary acidic protein(GFAP)單克隆一抗(武漢Proteintech)，抗磷酸化-eIF2α(p-eIF2α)、磷酸化-PERK(p-PERK，江蘇Affinity公司)，抗VEGF-A(美國Abcam公司)，單克隆一抗羊抗兔和羊抗鼠抗體(美國Bioword公司)。

1.1.3主要儀器 DMIL型倒置顯微鏡(德國LEICA公司)，NovoCyte流式細(xì)胞儀(艾森生物)，3020-426多功能全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)，超凈工作臺(tái)SW-CJ-1型(中國蘇州凈化設(shè)備有限公司)，Heal force型細(xì)胞培養(yǎng)箱(中國上海力申科學(xué)儀器有限公司)，Microfuge20R型冷凍離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 Müller細(xì)胞置于含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基中37 ℃的5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液至長滿。實(shí)驗(yàn)分為Control組(5.5 mmol/L葡萄糖)、Mannitol組(34.5 mmol/L甘露醇+5.5 mmol/L/L葡萄糖)、HG組(40 mmol/L葡萄糖)、4-PBA-L組(1 mmol/L4-PBA+40 mmol/L葡萄糖)及4-PBA-H組(5 mmol/L 4-PBA+40 mmol/L葡萄糖)，4-PBA給藥組及Mannitol組給予相應(yīng)藥物預(yù)處理1 h，再加40 mmol/L葡萄糖繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2Giemsa染色 取對(duì)數(shù)增長期Müller細(xì)胞按1.2.1項(xiàng)下分組接種于24孔板中，待給藥預(yù)保護(hù)1 h，40 mmol/L 葡萄糖繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)48 h，棄原培養(yǎng)液，每孔加PBS洗3次，加4%多聚甲醛靜置固定細(xì)胞15 min；每孔加PBS搖洗3次；Giemsa染色液(濃縮液 ∶PBS=1 ∶5)沿壁加入，靜置染色5 min，PBS沖洗干凈，倒置顯微鏡下采集照片(100×)。

1.2.3二苯基四氮唑溴[3-(4,5-dimethyl-2- thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT]法檢測4-PBA對(duì)HG誘導(dǎo)Müller細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長期Müller細(xì)胞以密度為5 ×106個(gè)/L，接種于96孔板中，給予0、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、7.5、10mmol/L 的4-PBA預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用 MTT法檢測Müller細(xì)胞存活率；同樣取對(duì)數(shù)生長期Müller細(xì)胞，以密度為5 ×106個(gè)/L，接種于96孔板中，按1.2.1項(xiàng)下分組培養(yǎng)2 d， MTT法檢測5組細(xì)胞的增殖，計(jì)算細(xì)胞存活率(細(xì)胞存活率= OD給藥組/OD對(duì)照組×100%)。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 取“1.2.1”項(xiàng)下密度為1×109個(gè)/L的各組細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液1 mL，1 500 r/min離心5 min，棄上清，70%乙醇500 μL預(yù)冷，于4 ℃固定過夜；加RNA Nase(終濃度50 mg/L)100 μL于37 ℃水浴30 min；避光加碘化丙啶(propidium，PI；終濃度50 mg/L)400 μL ，室溫避光染色30 min；上機(jī)檢測，激發(fā)波長為488 nm，收集細(xì)胞10 000個(gè)以上。

1.2.5Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)增長期的Müller細(xì)胞按“1.2.1”項(xiàng)下分組接種于培養(yǎng)皿中，待給藥預(yù)保護(hù)1 h，40 mmol/L 葡萄糖繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄原培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗2次，加含1%蛋白酶抑制劑苯甲磺酰氟(phenylmethyl sulfonyl fluoride,PMSF)細(xì)胞裂解液(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解細(xì)胞、提取各組細(xì)胞總蛋白，采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BSA)蛋白定量；將蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳分離，電泳時(shí)間1.5 h，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%BSA溶液封閉1 h；加配制好相應(yīng)濃度的一抗GRP78(1 ∶1 000)、ATF4(1 ∶1 000)、GFAP(1 ∶1 000)、PERK(1 ∶1 000)、p-PERK(1 ∶500)、eIf2α(1 ∶1 000)、p-eIf2α(1 ∶500)、VEGF-A(1 ∶1 000)及β-actin(1 ∶10 000)于4 ℃孵育過夜，洗膜3次，加入兔二抗(1 ∶10 000)室溫孵育1.5 h；采用Bio-Rad顯影成像系統(tǒng)獲取圖像，Image J分析軟件統(tǒng)計(jì)各蛋白印跡灰度值進(jìn)行分析比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

Giemsa 染色結(jié)果顯示(圖1)，Control組Müller細(xì)胞間隙明顯，分散均勻；HG組Müller細(xì)胞數(shù)目急劇增多，形狀變?yōu)閳A，細(xì)胞間隙變小；1 mmol/L和5 mmol/L 4-PBA干預(yù)后，4-PBA-L組和4-PBA-H組Müller的細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)有所恢復(fù)。表明4-PBA可減少HG誘導(dǎo)Müller數(shù)目和病理形態(tài)改變。

圖1 各組視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征(Giemsa染色，×100)Fig.1 Morphological characteristics of retinal Müller cells in each group (Giemsa staining，×100)

2.2 細(xì)胞增殖活性及4-PBA濃度的確定

經(jīng)0、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、7.5及10 mmol/L 4-PBA進(jìn)行給藥處理1 h，MTT法檢測結(jié)果顯示(圖2)，與Control組相比，Müller細(xì)胞在0～5 mmol/L 4-PBA干預(yù)下細(xì)胞存活率無明顯影響(P>0.05)；當(dāng)4-PBA 濃度>5 mmol/L后，Müller細(xì)胞存活率下降(P<0.05)。此外，與Control組相比，HG組Müller細(xì)胞存活率升高(P<0.05)；給予1mmol/L和5 mmol/L 4-PBA預(yù)保護(hù) 1 h，與HG組相比，4-PBA-L組和4-PBA-H組 Müller細(xì)胞存活率下降(P<0.05)，Mannitol組無明顯差異(P>0.05)。

注：A、B為不同培養(yǎng)條件下Müller細(xì)胞增殖活性統(tǒng)計(jì)結(jié)果；(1)與同濃度24 h組比較，P<0.05；(2)與Control組比較，P<0.05；(3)與HG組比較，P<0.05。圖2 各組視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的增殖活性(MTT)Fig.2 Proliferative activity of the retinal Müller cells in each group(MTT)

2.3 細(xì)胞周期

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示(圖3)，與Control組相比，HG作用Müller細(xì)胞 48 h后，HG組Müller細(xì)胞S期所占比例增加(P<0.05)；而給予不同濃度4-PBA預(yù)處理1 h后，與HG組相比，4-PBA-L組和4-PBA-H組 Müller細(xì)胞S期所占比例減少(P<0.05)，Mannitol組無明顯差異(P>0.05)。

2.4 ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)

結(jié)果如圖4所示，與Control組比較，HG作用Müller細(xì)胞 48 h后HG組Müller細(xì)胞ERS未折疊蛋白反應(yīng)蛋白GRP78、p-PERK、p-eIf2α和ATF4 蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；而給予不同濃度4-PBA(1 mmol/L、5 mmol/L)預(yù)處理1 h，與HG組相比，4-PBA-L組和4-PBA-H組 Müller細(xì)胞GRP78、p-PERK、p-eIf2α和ATF4 蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，Mannitol組無明顯差異(P>0.05)。

注：A為流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果，B為流式細(xì)胞術(shù)檢測的定量結(jié)果；(1)與Control組比較，P<0.05；(2)與HG組比較，P<0.05。圖3 各組視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的細(xì)胞周期變化(流式細(xì)胞術(shù))Fig.3 Cell cycle changes in retina Müller cells in each group(flow cytometry)

注：A、B分別為Western blot電泳圖和蛋白定量結(jié)果；(1)與Control組比較，P<0.05；(2)與HG組比較，P<0.05。圖4 各組視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GRP78、p-PERK、p-eIf2α及ATF4 蛋白的表達(dá)Fig.4 Levels of GRP78, p-PERK, p-eIf2α, and ATF4 protein expression in retinal Müller cells in each group

2.5 細(xì)胞膠質(zhì)增生

Western blot結(jié)果表示(圖4)，與Control組比較，HG作用48 h后，HG組Müller細(xì)胞中GFAP和VEGF-A蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；給予不同濃度4-PBA預(yù)處理1 h，與HG組相比，4-PBA-L組和4-PBA-H組 中Müller細(xì)胞GFAP、VEGF-A蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，Mannitol組無明顯差異(P>0.05)。

注：A、B為VEGF-A和GFAP的Western blot電泳結(jié)果和蛋白定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果；(1)與Control組相比，P<0.05；(2)與HG組相比，P<0.05。圖5 各組視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的GFAP和VEGF-A蛋白表達(dá)Fig.5 Levels of GFAP and VEGF-A protein expression in retinal Müller cells in each group

3 討論

DR是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，也是糖尿病人視力下降的主要原因[16]。有研究認(rèn)為，當(dāng)糖尿病患者視網(wǎng)膜出現(xiàn)損傷時(shí)，早于血管病變和其他膠質(zhì)細(xì)胞受損，視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞就已經(jīng)發(fā)生形態(tài)和功能性病變[8]。Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜中維持視網(wǎng)膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)的主要膠質(zhì)細(xì)胞，能夠表達(dá)生長因子以滋養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)元和毛細(xì)血管細(xì)胞[17]。糖尿病長期存在的高血糖可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞增殖活化，這是Müller細(xì)胞膠質(zhì)增生的一種形式，也是導(dǎo)致DR發(fā)生的主要原因[18-19]。鑒于Müller細(xì)胞在維持視網(wǎng)膜神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)和功能方面的重要性，糖尿病患者M(jìn)üller細(xì)胞的功能障礙及隨之發(fā)生的膠質(zhì)增生被認(rèn)為是導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變的主要因素[20-21]。因此，抑制或逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)增生過程可能是防治DR的重要策略。本研究結(jié)果表明，4-PBA能抑制HG誘導(dǎo)Müller細(xì)胞的異常增殖，并且可有效地改善HG誘導(dǎo)Müller細(xì)胞形態(tài)的異常改變。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成和加工的主要細(xì)胞器，其蛋白質(zhì)折疊可受各種生理和病理?xiàng)l件干擾，導(dǎo)致ERS的發(fā)生[22]。ERS的3個(gè)跨膜傳感器PERK、IRE1和ATF6負(fù)責(zé)激活介導(dǎo)UPR和后續(xù)反應(yīng)的下游信號(hào)通路[22-24]。據(jù)報(bào)道，UPR反應(yīng)經(jīng)典通路PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路與DR密切相關(guān)[25]。越來越多的證據(jù)表明，ERS通過增加Müller的膠質(zhì)增生促進(jìn)DR的進(jìn)展[26-27]；ERS抑制劑則可以改善視網(wǎng)膜神經(jīng)病變[28]。GRP78是一種ERS蛋白，參與蛋白質(zhì)的折疊和運(yùn)輸，其表達(dá)與ERS呈正相關(guān)[29]。本研究結(jié)果顯示，與Control組相比，HG組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78水平上調(diào)，表明Müller細(xì)胞在40 mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)48h后發(fā)生ERS。此外，與Control組相比，HG組p-PERK、p-eIF2α、ATF4蛋白表達(dá)增加，表明HG組Müller細(xì)胞PERK-eIF2α-ATF4通路被激活，可能是糖尿病視網(wǎng)膜膠質(zhì)增生發(fā)病機(jī)制中的主要信號(hào)通路。

研究表明，GFAP和VEGF-A的表達(dá)異常上調(diào)是DR中Müller膠質(zhì)增生的顯著標(biāo)志[30-31]；在HG處理的視網(wǎng)膜細(xì)胞中，緩解ERS或者抑制 ATF4 活性將減少細(xì)胞中VEGFA 及GFAP的表達(dá)，改善視網(wǎng)膜病變[31-32]。因此，本研究通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)探討4-PBA對(duì)HG誘導(dǎo)的Müller細(xì)胞中GFAP和VEGF-A表達(dá)的影響，結(jié)果表明，與HG組相比，4-PBA預(yù)處理1h后可顯著抑制HG誘導(dǎo)的Müller細(xì)胞中GFAP和VEGF-A蛋白表達(dá)增加。這些結(jié)果進(jìn)一步表明了4-PBA可以通過下調(diào)HG誘導(dǎo)Müller中GFAP和VEGF-A的表達(dá)來抑制視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的膠質(zhì)增生。

綜上所述，4-PBA可抑制HG誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞膠質(zhì)增生過程，恢復(fù)Müller細(xì)胞形態(tài)與功能，其作用與抑制ERSPERK-eIF2α-ATF4通路有關(guān)，但是4-PBA在體內(nèi)的藥效作用仍待進(jìn)一步的驗(yàn)證。本研究為4-PBA藥物開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)，也為臨床治療DR提供了新思路。