UGPase與USPase編碼基因在滇楊正、倒扦插苗中的組織特異性表達(dá)

姜輔瑞縱 丹吳治洋張曉琳余進(jìn)德 何承忠

（1.西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650233；2.西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)和草原重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650233）

植物生長(zhǎng)過(guò)程中，細(xì)胞壁可發(fā)生增厚、松弛、修飾、降解等，這些過(guò)程影響著植物生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞分化、防御等[1]，而細(xì)胞壁中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等組分的變化也對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育以及應(yīng)對(duì)脅迫等起到非常重要的作用[2]。尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）是細(xì)胞壁中纖維素、半纖維素、蔗糖的等物質(zhì)合成與代謝的前體[3]，而通過(guò)UDP-糖焦磷酸化酶催化生成UDPG是植物體中UDPG的主要合成途徑之一[4]。現(xiàn)有研究結(jié)果表明，UDP-糖焦磷酸化酶家族中，在植物UDPG代謝中起主要作用的為UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）和UDP-糖焦磷酸化酶（USPase）2種酶[5]。UGPase和USPase均能夠催化葡萄糖-1-磷酸（Glc-1-P）和UTP生成UDPG[6]，但UGPase僅對(duì)葡萄糖-1-磷酸具有底物特異性，而USPase可利用其他單糖-1-磷酸作為底物[7]。在許多植物中均存在UGPase和USPase這2種酶，Sowokinos等[8]在馬鈴薯（Solanumtuberosum）中發(fā)現(xiàn)UGPase基因位點(diǎn)存在等位基因的差異，分別命名為ugpA和ugpB，研究發(fā)現(xiàn)該基因與馬鈴薯在低溫條件下對(duì)甜味的產(chǎn)生有抵抗作用。在水稻（Oryza sativa）中存在2個(gè)UGPase基因成員（UGP1和UGP2），質(zhì) 膜 上 的OsLecRK5磷 酸化UGP1，并促進(jìn)其在胼胝質(zhì)合成中的活性[9]。在沙梨（Pyrus pyrifolia）中也存在2個(gè)UGPase基因成員，被命名為UGPase PA和PC，可能在花粉特異性糖代謝或多糖中起作用[10]。在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)美洲黑楊（Populusdeltoids）的PdUSPase可提高黃酮類糖苷綴合物的產(chǎn)量[11]。

滇 楊（Populus yunnanensis）是 楊 柳 科（Salicaceae）楊屬（Populus）青楊派（SectTacamahaca）樹(shù)種，又稱云南白楊、攀枝樹(shù)，是我國(guó)西南地區(qū)的特有樹(shù)種，可生長(zhǎng)于海拔1300～3200 m的地區(qū)，是我國(guó)稀有的低緯度高海拔楊樹(shù)，具有適應(yīng)能力強(qiáng)，易成活，生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)[12]。滇楊可通過(guò)扦插的方式得到新的植株，且正、倒扦插均可成活，但觀測(cè)發(fā)現(xiàn)倒扦插苗生長(zhǎng)速率低于正扦插苗[13]。對(duì)滇楊正、倒扦插苗的幼葉和樹(shù)皮進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)葉片中有39個(gè)DEGs關(guān)聯(lián)于USPase基因，且USPase基因在倒扦插苗中表現(xiàn)為下調(diào)[14]。在擬南芥中，USPase基因功能缺失突變使花粉缺乏果膠纖維內(nèi)層，細(xì)胞質(zhì)退化，完全破壞了雄性植株的生育能力[15]，而AtUGP1和AtUGP2雙突變體中，雄性植株不育但營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的大小與野生型并無(wú)差異[16]。在灰樹(shù)花（Grifolafrondosa）中，GfUGP啟動(dòng)子的沉默比保守序列具有更高的下調(diào)效率，且菌絲生長(zhǎng)減緩[17]。此外，UGPase基因在植物的不同組織中存在表達(dá)量差異，水稻Ugp1基因在整個(gè)植株中均有表達(dá)，但在花藥發(fā)育過(guò)程中尤其在花粉中表達(dá)量最高[18]；UGPase-A基因在雜交楊樹(shù)（P.tremula×P.tremuloides）和美洲黑楊（P.deltoides）的成熟葉、莖和根中具有較高的表達(dá)量，而UGPase-B基因則在美洲黑楊的嫩葉和根中表達(dá)量較高[19-20]。滇楊正、倒扦插苗的生長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)量存在一定差異[13]，但有關(guān)其PyUGPase和PyUSPase基因的組織特異性表達(dá)規(guī)律還未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究從前期組裝的染色體水平滇楊基因組數(shù)據(jù)中提取PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase基因序列，利用生物信息學(xué)軟件和在線網(wǎng)站對(duì)滇楊PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase基因編碼蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，同時(shí)以1年生滇楊正、倒扦插苗為材料，測(cè)量其主枝長(zhǎng)度和主枝粗度，并對(duì)3個(gè)目標(biāo)基因在莖尖、嫩葉、成熟葉、莖和根中表達(dá)量進(jìn)行RT-qPCR分析，揭示Py-UGPase和PyUSPase基因在滇楊正、倒扦插苗中的組織特異性表達(dá)規(guī)律，從而為闡明PyUGPase和PyUSPase基因調(diào)控細(xì)胞壁合成進(jìn)而調(diào)控滇楊生長(zhǎng)的機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以同屬于楊屬青楊派的毛果楊（P.tricho-carpa）UGPase-A、UGPase-B和USPase基因序列為參照，基于課題組前期測(cè)序并組裝的染色體水平滇楊基因組數(shù)據(jù)，經(jīng)過(guò)本地序列比對(duì)，提取獲得滇楊PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase基因序列。

從2019年春季扦插種植于相同環(huán)境條件下的滇楊3個(gè)無(wú)性系正、倒扦插苗中，每無(wú)性系正、倒扦插苗分別任選3株，于2020年8月采集莖尖（ST）、嫩葉（TL，頂端往下第2～3片）、成熟葉（ML，頂端往下第6～7片）、莖皮（SP）和根皮（RT），每無(wú)性系同類型3株苗木的相同組織樣本混合為1份，共計(jì)30份樣品，由液氮快速冷凍并研磨后放置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase基因的生物信息學(xué)分析

采用生物信息學(xué)軟件和網(wǎng)站分別對(duì)PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase基 因 編 碼 蛋白的氨基酸組成、理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、親水性/疏水性、亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽、蛋白結(jié)構(gòu)、同源性以及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建等方面進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。具體軟件和網(wǎng)站信息見(jiàn)表1。

表1 在線分析工具的名稱和網(wǎng)站Table1 Online analysis toolsname and URL

1.3 苗木生長(zhǎng)量統(tǒng)計(jì)

于2020年10月，使用卷尺和游標(biāo)卡尺對(duì)8月份采樣的正、倒扦插苗主枝長(zhǎng)度和主枝粗度進(jìn)行測(cè)量，主枝粗度測(cè)量部位距離基部2 cm處。正、倒扦插苗各測(cè)量9株，同一無(wú)性系相同類型3株苗木的數(shù)值平均值作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)代表值。

1.4 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase基因在不同組織中的表達(dá)

1.4.1 總RNA提取與cDNA合成

采用OMEGA植物RNA試劑盒（R6827-01）對(duì)正、倒扦插苗不同組織樣品進(jìn)行總RNA的提取。使用Thermo NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行RNA濃度和純度測(cè)定。應(yīng)用北京天根公司的試劑盒Fast King RT Kit（KR116)對(duì)不同組織總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并合成cDNA第1條鏈。

1.4.2 目的基因引物設(shè)計(jì)

以課題組前期篩選的PD-E1[21]作為內(nèi)參基因，通過(guò)Primer 5.0軟件[22]和NCBI Primer-BLAST對(duì)PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase三個(gè)基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，參數(shù)設(shè)置為擴(kuò)增長(zhǎng)度80～200 bp，引物序列長(zhǎng)度17～25 bp，GC含量45%～55%，F(xiàn)orward引物和Reverse引物Tm值的差值小于± 3℃。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并對(duì)合成的引物檢測(cè)其擴(kuò)增的特異性，引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

1.4.3 RT-qPCR分析

使用Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀和Vazyme公司的ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行基因表達(dá)的RT-qPCR分析。PCR反應(yīng)體積為20μL：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，正、反向引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，采集溶解曲線熒光信號(hào)。

1.5 數(shù)據(jù)整理與分析

在Excel 2019中對(duì)生長(zhǎng)量指標(biāo)和Ct值進(jìn)行整理，采用2-ΔCt（樣品ΔCt=樣品Ct值-內(nèi)參Ct值）為樣品的均一化表達(dá)量，以正扦插苗木相關(guān)樣品中的目標(biāo)基因平均表達(dá)量為對(duì)照，將其表達(dá)量設(shè)定為1，計(jì)算倒扦插苗對(duì)應(yīng)目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量，其計(jì)算公式為2-ΔΔCt（ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt-對(duì)照組ΔCt）[23]。應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase基因的生物信息學(xué)分析

2.1.1PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase基因的理化性質(zhì)

利用ExPASy在線工具ProtParam分別對(duì)Py-UGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase基因編碼的氨基酸組成成分和理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。根據(jù)ProtParam算法，不穩(wěn)定性系數(shù)數(shù)值大于40時(shí)，預(yù)測(cè)的蛋白比較不穩(wěn)定，反之穩(wěn)定性較好[24-25]。由表3可知，PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白不穩(wěn)定性系數(shù)分別為31.67、26.01和32.50，均小于40，表明三者均屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)是指一個(gè)蛋白質(zhì)中脂肪側(cè)鏈所占的相對(duì)值，脂肪系數(shù)值越高代表蛋白質(zhì)越穩(wěn)定[26]。Py-UGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白脂肪系數(shù)分別為101.96、103.22和83.45，3個(gè)蛋白脂肪系數(shù)較高，進(jìn)一步表明3個(gè)蛋白均較穩(wěn)定。

表3 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase基因編碼蛋白的部分理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位Table 3 Some physicochemical properties and subcellular localization of PyUGPase-A,PyUGPase-B and PyUSPase e coding proteins

續(xù)表 3

2.1.2 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白親水性/疏水性

蛋白質(zhì)的親/疏水性通常依據(jù)GRAVY值來(lái)判定，GRAVY值為負(fù)，則認(rèn)為該蛋白質(zhì)為親水性蛋白，GRAVY值為正，則為疏水性蛋白[27]。利用ExPASy在線工具ProtScale，分別對(duì)PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白進(jìn)行親/疏水性預(yù)測(cè)（圖1）。由圖1可見(jiàn)，PyUGPase-A蛋白的GRAVY值為-0.151，多肽鏈112位具有最高的分值（2.578），疏水性最強(qiáng)，而多肽鏈70位的分值最低，為-2.500，表明親水性最強(qiáng)（圖1a）；PyUGPase-B蛋白的GRAVY值為-0.151，其多肽鏈112位具有最高的分值2.578，疏水性最強(qiáng)，多肽鏈71位具有最低的分值-2.856，親水性最強(qiáng)（圖1b）；PyUSPase蛋白的GRAVY值為-0.326，其多肽鏈144位具有最高的分值2.400，疏水性最強(qiáng)，多肽鏈409位具有最低的分值-2.289，親水性最強(qiáng)（圖1c）。由圖1還可知，3個(gè)蛋白的整個(gè)多肽鏈均沒(méi)有明顯的疏水區(qū)域，因此，3個(gè)蛋白均是親水性蛋白。這與蛋白質(zhì)理化性質(zhì)相一致。

圖1 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白親水性預(yù)測(cè)Fig.1 Hydrophilic prediction of PyUGPase-A,PyUGPase-B and PyUSPase

2.1.3 亞細(xì)胞定位

蛋白質(zhì)的功能與該蛋白在細(xì)胞中的定位密不可分，利用Plant-mPLoc在線軟件分別對(duì)PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，3個(gè)蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（表3）。

2.1.4 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域

跨膜結(jié)構(gòu)域是膜內(nèi)在蛋白與細(xì)胞膜脂質(zhì)相結(jié)合的主要區(qū)域，一般由20個(gè)左右的疏水性氨基酸組成，形成α螺旋結(jié)構(gòu)并固定于細(xì)胞膜上起“錨定”作用[28]。利用TMHMM在線工具分別對(duì)PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。如圖2所示，信號(hào)線平直沒(méi)有變化，可知PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白均不是膜蛋白，均不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，該預(yù)測(cè)結(jié)果與蛋白亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的結(jié)果相一致。

圖2 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Transmembrane domain analysis of PyUGPase-A,PyUGPase-B and PyUSPase

2.1.5 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白信號(hào)肽結(jié)構(gòu)

信號(hào)肽是分泌蛋白N端的一段20～30個(gè)氨基酸殘基組成的肽段，它用于蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)移[28]。利用ExPASy的SignalP 4.1在線軟件，分別 對(duì)PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示（表4和圖3），PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋 白 的氨基酸殘基具有最高的原始剪切位點(diǎn)，分別在第42、25和23位上，分值分別為0.115、0.122和0.115；氨基酸殘基具有最高的信號(hào)肽的位點(diǎn)分別在第41、1和40位上，分值分別為0.107、0.130和0.148；氨基酸殘基的信號(hào)肽區(qū)域分別在第1～41位、第1～16位和第1～69位置上，得分為0.098、0.107和0.097；氨基酸殘基具有最高綜合剪切位點(diǎn)分別在第42、17和70位上，得分為0.107、0.113和0.108。從表4可見(jiàn)，3個(gè)蛋白氨基酸殘基的原始剪切位點(diǎn)和信號(hào)肽的分值均較小，由此可知PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋 白 不存在信號(hào)肽，它是一種非分泌蛋白。

表4 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果Table 4 Prediction result of PyUGPase-A,PyUGPase-B and PyUSPase protein signal peptide

圖3 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白信號(hào)肽Fig.3 Prediction of PyUGPase-A,PyUGPase-Band PyUSPase protein signal peptide

2.1.6 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白結(jié)構(gòu)域

使用NCBI的CDD（Conserved Domain Database）數(shù)據(jù)庫(kù)，分別對(duì)PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。結(jié)果如圖4所示，PyUGPase-A和-B蛋白均具有Substrate binding site、PLN02474和UDPGP、UGPase和QRI1等結(jié)合位點(diǎn)和保守域，屬于Glyco_tranf_GTA_type超家族蛋白；而PyUSPase蛋白具有Substrate binding site、PLN02830和UDP-葡萄糖/半乳糖焦磷酸化酶UGGPase等結(jié)合位點(diǎn)和保守域，屬于Glyco_tranf_GTA_type超家族蛋白。

圖4 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.4 Analysisof conserved domainsof PyUGPase-A,PyUGPase-Band PyUSPase

2.1.7 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

利用ExPASy-SOPMA在線軟件分別對(duì)PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表5和圖5。由表5可知，PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白的無(wú)規(guī)則卷曲比例均較高，分別為38.81%、39.45%和38.78%；其次為α螺旋結(jié)構(gòu)比例，分別為33.05%、32.62%和35.74%；延伸鏈和β折疊所占比例均較少。由表5和圖5可知，α螺旋結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)散布于其整個(gè)蛋白質(zhì)中，是構(gòu)成PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要骨架。

圖5 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Protein secondary structure of PyUGPase-A,PyUGPase-Band PyUSPase

表5 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Table 5 Protein secondary structure resultsof PyUGPase-A,PyUGPase-Band PyUSPase%

2.1.8 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

通過(guò)Expasy工具中的在線軟件SWISSSMODEL對(duì)PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。由圖6可知，PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白的空間構(gòu)象主要由α螺旋結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)所組成，且延伸鏈數(shù)目也較多，而β折疊較少。

圖6 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Protein tertiary structure of PyUGPase-A,PyUGPase-B and PyUSPase

2.1.9 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase蛋白同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

使用ClustalX2.1軟件，對(duì)PyUGPase-A和PyUGPase-B氨基酸序列與擬南芥（Arabidopsis thaliana）UGPase-A和UGPase-B（NP_186975.1、NP_197233.1）、雜交楊樹(shù)（P. tremula×P.tremuloides）UGPase-A和UGPase-B（AAP86317.1、ABB88893.1）、毛果楊（P. trichocarpa）UGPase-A和UGPase-B（XP_006384119.1、XP_006372413.1）、美洲黑楊（P.deltoides）UGPase（AEF13021.1）、銀白楊（P.alba）UGPase（XP_034898917.1）、胡楊（P.euphratica）UGPase（XP_011038414.1）、番木瓜（Carica papaya）UGPase（XP_021888036.1）、克 萊 門(mén) 柚（Citrusclementina）UGPase（XP_006430411.1）、橡膠樹(shù)（Heveabrasiliensis）UGPase（XP_021643510.1）、雜交核桃（Juglansmicrocarpa×J.regia）UGPase（XP_041007687.1）、核桃（J.regia）UGPase（XP_018811449.1）、歐洲 甜 櫻 桃（Prunusavium）UGPase（XP_021823827.1）、雷 公 藤（Tripterygiumwilfordii）UGPase（XP_038702092.1）、河岸葡萄（Vitisriparia）UGPase（XP_034682270.1）、棗（Ziziphus jujuba）UGPase（XP_015880132.1）等氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果如圖7a顯示，PyUGPase與楊屬中其他樹(shù)種的UGPase同源性高達(dá)97.35%，而與其他植物的同源性也達(dá)到89.28%，表明UGPase蛋白具有較高的保守性。

圖7 滇楊與其它物種UGPase-A、UGPase-B和USPase氨基酸序列的同源性分析Fig.7 P. yunnanensis and other plant UGPase-A, UGPase-B and USPaseamino acid homology analysis

對(duì)PyUSPase氨基酸序列與擬南芥USPase（NP_568775.1）、銀白楊USPase（XP_034930993.1）、胡 楊USPase（XP_011027439.1）、毛果 楊USPase（XP_024451421.1）、克萊門(mén)柚USPase（XP_006434300.1）、麻 風(fēng) 樹(shù)（Jatrophacurcas）USPase（XP_012078333.1）、蓮（Nelumbo nucifera）USPase（XP_010270310.1）、梅（Prunus mume）USPase（XP_008219569.1）、蓖 麻（Ricinuscommunis）USPase（XP_002520299.1）、河岸葡萄USPase（XP_034675602.1）、棗USPase（XP_015885782.1）等氨基酸序列進(jìn)行同源性分析（圖7b）。由圖7b可見(jiàn)，PyUSPase與楊屬的其他樹(shù)種同源性高度一致（99.24%），而與其他植物的同源性也有87.24%，表明USPase蛋白的保守性較高。

進(jìn)一步地，通過(guò)MEGA7.0軟件比對(duì)分析，構(gòu)建PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase氨 基酸序列進(jìn)化樹(shù)。如圖8所示，滇楊與毛果楊親緣關(guān)系最近，而與同屬的其他楊樹(shù)或者其他植物親緣關(guān)系相距較遠(yuǎn)，根據(jù)氨基酸序列分析的物種親緣關(guān)系與傳統(tǒng)進(jìn)化親緣關(guān)系相同。

圖8 滇楊與其它物種UGPase-A、UGPase-B和USPase氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.8 Phylogenetic tree based on P. yunnanensis and other plant UGPase-A,UGPase-B and USPaseamino acid

2.2 生長(zhǎng)量統(tǒng)計(jì)分析

2020年10月對(duì)正、倒扦插苗的主枝長(zhǎng)度和主枝粗度統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明（圖9），倒扦插苗主枝長(zhǎng)度33.94 cm，正扦插苗主枝長(zhǎng)度為68.78 cm，倒扦插苗主枝長(zhǎng)度明顯低于正扦插苗，但兩者差異不顯著。倒扦插苗主枝粗度為3.00 cm，正扦插苗主枝粗度為3.39 cm，倒扦插苗主枝粗度略低于正扦插苗主枝粗度且差異不顯著。綜上所述，倒扦插苗的主枝長(zhǎng)度和粗度均低于正扦插苗，但插穗方向?qū)χ髦Ω呱L(zhǎng)的影響更明顯。

圖9 1年生滇楊正、倒扦插苗主枝長(zhǎng)度和粗度Fig.9 Main branch length and diameter of upright and inverted cuttingsof one-year-old P. yunnanensis

2.3 PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase基因在不同組織中的表達(dá)

2.3.1 RNA提取與檢測(cè)

使用OMEGA試劑盒提取正、倒扦插苗5個(gè)組織的總RNA，通過(guò)Nanodrop檢測(cè)RNA的核酸濃度和純度，結(jié)果表明，A260/280的比值在1.8～2.1之間，且峰圖均為單峰，說(shuō)明RNA的純度較高。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳條帶為清晰的兩條帶且沒(méi)有明顯的彌散或降解現(xiàn)象（圖10），說(shuō)明RNA完整性良好，沒(méi)有降解，總RNA的質(zhì)量可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

圖10 部分RNA電泳圖Fig.10 Electrophoresis of partial RNA

2.3.2 引物特異性驗(yàn)證

將RT-qPCR反應(yīng)的產(chǎn)物通過(guò)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示內(nèi)參基因和目的基因的電泳條帶均為單一條帶且無(wú)其他雜帶。通過(guò)RT-qPCR的溶解曲線分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)參基因和目的基因均產(chǎn)生單一的溶解峰，表明設(shè)計(jì)的引物特異性較好，RT-qPCR反應(yīng)的專一性較高（圖11）。

圖11 內(nèi)參基因和目的基因溶解曲線Fig.11 Melting curvesof reference gene and target genes

2.3.3 基因表達(dá)量分析

PyUGPase-A基因在正扦插苗的莖尖、成熟葉、莖及根中的表達(dá)量均顯著高于嫩葉，PyUGPase-B基因在成熟葉和根中的表達(dá)量顯著高于莖尖、嫩葉和莖，并且嫩葉中基因表達(dá)量仍表現(xiàn)為最低（圖12a）。在倒扦插苗中，PyUGPase-A基因在成熟葉中表達(dá)量顯著高于嫩葉和根，PyUGPase-B基因在成熟葉中表達(dá)量顯著高于莖尖和嫩葉（圖12b）。PyUSPase基因在正、倒扦插苗根中的表達(dá)量均為最高，在倒扦插苗中，PyUSPase在根中的表達(dá)量顯著高于莖尖、嫩葉和成熟葉，而在正插苗中的根中表達(dá)量?jī)H顯著高于嫩葉（圖12a、b）。

圖12 基因表達(dá)量Fig.12 Geneexpression

由圖12c、d可知，除扦插苗的嫩葉和倒扦插苗的根外，在正、倒扦插苗的其余組織中Py-USPase基因的表達(dá)量顯著低于PyUGPase-A和PyUGPase-B基因。在正扦插苗的成熟葉和根中，PyUGPase-B基因的表達(dá)量高于PyUGPase-A基因且存在顯著差異（圖12c），而在倒扦插苗的嫩葉、成熟葉和根中，PyUGPase-B基因的表達(dá)量均顯著高于PyUGPase-A基因（圖12d）。

綜上所述，PyUGPase-A和PyUGPase-B基因在正、倒扦插苗的成熟葉、莖及根的表達(dá)量相對(duì)較高，PyUSPase基因在5個(gè)組織中表達(dá)量較低且表達(dá)量均低于PyUGPase-A和PyUGPase-B基因。

2.3.4 相對(duì)表達(dá)量分析

以正扦插苗不同組織樣本中的平均表達(dá)量為對(duì)照，將其表達(dá)量設(shè)定為1，計(jì)算目標(biāo)基因在倒扦插苗對(duì)應(yīng)組織中的相對(duì)表達(dá)量。圖13所示，PyUGPase-A和PyUGPase-B基因，僅在倒扦插苗的嫩葉中上調(diào)，在其余4個(gè)組織中均為下調(diào)；PyUSPase基因在5個(gè)組織中均為下調(diào)。

圖13 3個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.13 Relativeexpression levelsof 3 genes

3 結(jié)論與討論

利用生物信息學(xué)軟件，分別對(duì)PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase基因編碼蛋白進(jìn)行分析，PyUGPase-A、PyUGPase-B和PyUSPase與楊屬其他樹(shù)種氨基酸序列的同源性達(dá)到97%以上，與其他植物也達(dá)到85%以上的同源性，這與紫穗槐（Amorpha fruticosa）與其他植物之間的UGPase氨基酸同源性比對(duì)結(jié)果較為一致，都有較高的同源性[29]。本研究分析結(jié)果與黃芪（Astragalus membranaceus）和棉花（Gossypiumhirsutum）中UGPase基因進(jìn)化的分析結(jié)果相一致，均具有較高的保守性，且均定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的一種親水性穩(wěn)定蛋白[30-31]。

UGPase和USPase參與植物細(xì)胞壁的合成，由它們催化產(chǎn)生的UGPD是合成纖維素、半纖維和胼質(zhì)體的底物[32]。在擬南芥中，USPase基因的功能缺失突變使花粉缺乏果膠纖維內(nèi)層，細(xì)胞質(zhì)退化，完全破壞了雄性植株的生育能力[10]。在細(xì)胞快速生長(zhǎng)和分裂過(guò)程中，還需要USPase和特定的糖激酶回收從細(xì)胞壁中釋放出來(lái)的單糖，所以USPase在細(xì)胞壁合成途徑中也起著重要作用[33]。將棉花的GhUGP基因?qū)氲綌M南芥中進(jìn)行過(guò)表達(dá)，植株生長(zhǎng)速度明顯加快，同時(shí)使葉片中的可溶性糖和纖維素含量提高[34]；在番茄中過(guò)量表達(dá)UGP基因，使植株的高度增加，提高了番茄的生物量[35]。在雜交楊樹(shù)（P.alba×P. grandidentata）中過(guò)量表達(dá)細(xì)菌的UGPase基因，發(fā)現(xiàn)纖維素、可溶性糖含量增加，但植株生長(zhǎng)速率減緩，莖高降低、葉面積減小等[36]。

本研究對(duì)正、倒扦插苗生長(zhǎng)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，倒扦插苗的主枝長(zhǎng)度和粗度均低于正扦插苗，表明倒扦插苗相對(duì)于正扦插苗生長(zhǎng)遲緩，與前期研究結(jié)果相一致[37]。采用RT-qPCR技術(shù)對(duì)滇楊正、倒扦插苗不同組織中PyUGPase-A、Py-UGPase-B和PyUSPase基因表達(dá)特性的分析結(jié)果表明，在兩種類型扦插苗的不同組織中，3個(gè)目標(biāo)基因均有表達(dá)且具有組織表達(dá)的特異性，Py-UGPase-A和PyUGPase-B基因在成熟葉、莖、根中表達(dá)量較高，而PyUSPase基因在根中表達(dá)量高于其他組織。對(duì)雜交楊樹(shù)和美洲黑楊UGPase-A基因表達(dá)譜研究顯示，在成熟葉、莖和根中表達(dá)量較高[19-20]，與PyUGPase-A表達(dá)規(guī)律相一致。然而，鐵皮石斛（Dendrobiumofficinale）的UGPase-A基因僅在莖中表達(dá)量最高，可能與莖含有豐富的多糖有關(guān)[38]。美洲黑楊的UGPase-B基因在嫩葉和根中具有較高的表達(dá)量[20]，而滇楊PyUGPase-B在成熟葉、莖和根中表達(dá)量較高，表明UGPase-B基因表達(dá)規(guī)律存在一定的物種特異性。USPase基因的組織表達(dá)規(guī)律研究比較有限，更多關(guān)注于USPase酶特性及其作用底物[5,11]。

在胡楊和灰楊（P. pruinose）中，UGPase-A和UGPase-B基因在鹽脅迫的條件下表達(dá)規(guī)律較為一致，在莖和葉中上調(diào)，在根中下調(diào)[39]。野生型擬南芥中，在缺磷和蔗糖脅迫下UGPase基因均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)[15]。相對(duì)于正扦插苗，滇楊倒扦插苗中的PyUGPase-A和PyUGPase-B基因在嫩葉中上調(diào)表達(dá)，而PyUSPase基因在所有組織中都呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。前期RNA-seq分析結(jié)果表明，PyUSPase基因在滇楊倒扦插苗葉片和樹(shù)皮中均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)[14,40]。據(jù)此推測(cè)，插穗倒插后對(duì)其發(fā)育形成的植株具有一定脅迫作用，但其脅迫機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。