Runt相關轉錄因子3在結直腸癌組織中的表達及意義

王 璧，王戰(zhàn)會，韓保衛(wèi)，鄭秋霞，孫宗斌，蔡萌萌，段廷賀

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.鄭州大學附屬洛陽市中心醫(yī)院肝膽外科，河南 洛陽 471009；3.河南省第二兒童醫(yī)院胃腸外科，河南 洛陽 471009；4.蘭州大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科，甘肅 蘭州 730000)

結直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，每年造成約71.5萬人死亡，是癌癥死亡的第2大病因[1-3]。近年來，結直腸癌的發(fā)病率逐漸上升，且有年輕化趨勢[4]。由于結直腸癌早期缺乏典型的臨床癥狀，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，且目前結直腸癌的診斷尚缺乏特異性強、靈敏度高的檢測指標，因此，如何更好地實現(xiàn)早篩查、早診斷，對結直腸癌具有非常重要的意義。有研究指出，結直腸癌相關因子檢測及癌前篩查對該疾病的診斷、個體化治療及預后判斷意義重大[5]。因此，結直腸癌的分子標志物成為國內(nèi)外研究的熱點。Runt相關轉錄因子3(Runt-related transcription factor 3,RUNX3)是新近發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，其在胃癌、肺癌、肝癌等多種消化道惡性腫瘤組織中呈低表達，且與患者的預后有關[6]。研究發(fā)現(xiàn)，RUNX3不僅參與細胞的增殖、生長和凋亡，還參與信號轉導。RUNX3作為重要的轉錄因子能夠促進轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路的激活和Wnt信號通路的抑制，而這些通路的異常轉導在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用[7-8]，提示RUNX3可能在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中也起到一定作用。目前，關于RUNX3在結直腸癌中的作用機制尚未完全明確。本研究對結直腸癌組織中的RUNX3表達水平進行分析，探討其與結直腸癌臨床病理特征及預后的關系，以期為臨床尋找結直腸癌標志物提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年2月至2020年6月鄭州大學附屬洛陽市中心醫(yī)院胃腸外科收治的100例結直腸癌患者為研究對象。病例納入標準：(1)經(jīng)影像學、腸鏡及術后病理學檢查確診為原發(fā)性結直腸癌；(2)患者術前均未接受過新輔助化學治療、放射治療及免疫治療。排除標準：(1)既往患有其他惡性腫瘤者；(2)合并機體臟器嚴重衰竭者；(3)術前已行化學治療、放射治療及免疫治療者；(4)臨床資料不完善者。100例患者中，男52例，女48例；年齡42～79(64.33±12.31)歲，其中≥60歲61例，<60歲 39例；腫瘤部位：結腸48例，直腸52例；腫瘤直徑：≥5 cm 43例，<5 cm 57例；分化程度：高分化18例，中分化52例，低分化30例；病理分型：潰瘍型66例，隆起型23例，浸潤型11例；浸潤深度：cT18例，cT230例，cT325例，cT437例；淋巴結轉移：N061例，N139例；遠處轉移：M081例，M119例；TNM分期：Ⅰ期29例，Ⅱ期29例，Ⅲ期26例，Ⅳ期16例。所有患者術中留取結直腸癌組織及距離癌組織邊緣5 cm以上的癌旁組織標本，將每例標本均分為2份，其中1份制備石蠟標本，另1份快速保存于-80 ℃冰箱備用。本研究采用查閱電子病歷、患者隨訪系統(tǒng)或電話等方法對所有患者進行隨訪，隨訪截止日期為2020年10月，生存期的計算為從患者手術日期到隨訪截止日期或死亡日期。本研究通過鄭州大學附屬洛陽市中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，所有患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 細胞、主要試劑與儀器人正常結腸上皮細胞NCM460及結腸癌細胞系HCT-116、SW-480細胞均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，RUNX3一抗購自武漢博士德生物工程有限公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗、辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)標記的羊抗兔二抗、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、枸櫞酸鈉抗原修復液均購自上海碧云天生物技術研究所，內(nèi)源性過氧化物酶阻滯劑購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒、放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 免疫組織化學染色法檢測結直腸癌組織和癌旁組織中RUNX3蛋白的表達取患者術中切除的結直腸癌組織和癌旁組織(距離癌組織邊緣>5 cm以上)固定后制作的石蠟標本，層厚5 μm連續(xù)切片，80 ℃恒溫箱中烤片2 h，將切片置于二甲苯中脫蠟，遞減梯度乙醇(無水乙醇、體積分數(shù)95%乙醇、體積分數(shù)75%乙醇)脫去二甲苯并水化，將切片浸泡于枸櫞酸鈉抗原修復液中進行抗原修復，自然冷卻后使用PBS沖洗，切片；每張切片滴加50 μL過氧化物酶阻滯劑，室溫孵育10 min,然后用PBS沖洗；用體積分數(shù)5%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min，傾去血清；滴加50 μL RUNX3一抗(稀釋倍數(shù)1100)，室溫孵育1 h，PBS沖洗3次，每次2 min；加入羊抗兔單克隆抗體IgG作為二抗(稀釋倍數(shù)150)，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，每次2 min；DAB顯色，蘇木精復染，遞減梯度乙醇(無水乙醇、體積分數(shù)95%乙醇、體積分數(shù)75%乙醇)脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。細胞核中出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或棕褐色顆粒的細胞為RUNX3陽性表達細胞，隨機選取5個高倍鏡視野，觀察并計數(shù)陽性細胞數(shù)占同類細胞總數(shù)的百分比。參照KARPATHIOU等[9]和沈曉健等[10]的方法，根據(jù)染色強度及陽性細胞所占比例進行半定量評分：(1)陽性細胞所占比例為0%～25%計為1分，26%～75%計為2分，76%～100%計為3分；(2)無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(3)2項評分的乘積為每張切片的組織染色最終評分，二者相乘共分為0～9分，0～4分為低表達，5～9分為高表達。分別計數(shù)結直腸癌組織和癌旁組織標本中RUNX3蛋白高表達及低表達的例數(shù)，計算RUNX3蛋白高表達率和低表達率，高表達率=RUNX3蛋白高表達例數(shù)/總例數(shù)×100%，低表達率=RUNX3蛋白低表達例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 蛋白免疫印跡法檢測結直腸癌組織、癌旁組織和人正常結腸上皮細胞NCM460、結腸癌細胞系HCT-116、SW-480細胞中RUNX3蛋白相對表達量將蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑分別按150比例加入蛋白裂解液中混勻，配置蛋白裂解混合液。取1 cm×1 cm×1 cm的結直腸癌組織樣本及癌旁組織樣本，研磨均勻后分別置于EP管中；另分別取人正常結腸上皮細胞NCM460、結直腸癌細胞系HCT-116、SW-480細胞2×106個，置于相應的EP管；各EP管做好標記，分別加入500 μL蛋白裂解混合液，冰上裂解30 min，12 000 r·min-1離心10 min，收集上清液。根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書，在96孔板中設置標準孔和待測樣本孔，標準孔設置為8個標準品濃度，即于8個標準孔中分別加入相應量的標準品試劑，然后以PBS將其補足為20 μL的終體積，使其標準品終質量濃度分別為0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40、0.50 mg·μL-1；另取裂解后的結直腸癌組織、癌旁組織和人正常結腸上皮細胞NCM460、結腸癌細胞系HCT-116、SW-480細胞上清液各20 μL，分別加入相應的待測樣本孔中；最后向標準孔及各待測樣本孔中分別加入200 μL工作液，震蕩20 s混勻，覆膜后置于37 ℃恒溫箱中反應30 min，然后用全波長多功能酶標儀在波長562 nm處測定各孔樣本的吸光度(A)值，并建立坐標軸，根據(jù)標準曲線計算出各樣本的實際蛋白濃度；將所有樣本取相同質量并移入新的離心管中，并以PBS補足至相同體積，加入1/4樣本體積的loading buffer，充分混勻后置于金屬浴中100 ℃加熱變性10 min；每個泳道裝載20 μg變性蛋白，選擇80 V恒壓進行電泳約20 min,然后更換至 100 V恒壓電泳約1 h；蛋白分離后經(jīng)濕轉法電轉至聚偏二氟乙烯膜上；用洗膜液洗膜2次，每次10 min,然后將膜置于高效封閉液中室溫搖床震動下孵育15 min；分別將膜放置于配置好的目的蛋白RUNX3一抗溶液(稀釋倍數(shù)11 000)及內(nèi)參蛋白GAPDH溶液(稀釋倍數(shù)11 000)中4 ℃搖床震動下孵育過夜；再次洗膜后將膜置于配置好的二抗溶液(稀釋倍數(shù)11 000)中室溫搖床震動下孵育 2 h；在避光容器中配置增強化學發(fā)光顯色液，而后將其覆蓋于膜表面，放置1 min后在全自動凝膠成像系統(tǒng)中觀察、采集圖片，應用Image J軟件分析各條帶的灰度值，計算結直腸癌組織、癌旁組織及人正常結腸上皮細胞NCM460和結腸癌細胞系HCT-116、SW-480細胞中目的蛋白RUNX3的相對表達量，RUNX3相對表達量以目的蛋白RUNX3灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示。實驗重復3次，取均值。

2 結果

2.1 結直腸癌組織與癌旁組織中RUNX3蛋白表達率比較結果見表1和圖1。結直腸癌組織中RUNX3蛋白高表達率為35.0%(35/100)，癌旁組織中RUNX3高表達率為74.0%(74/100)；結直腸癌組織中RUNX3蛋白高表達率顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=30.670，P<0.05)。

表1 結直腸癌組織和癌旁組織中RUNX3蛋白表達率比較

A:癌旁組織；B:結直腸癌組織。

2.2 結直腸癌組織和結腸癌細胞系中RUNX3蛋白相對表達量比較結果見圖2和圖3。結直腸癌組織和癌旁組織中RUNX3蛋白相對表達量分別為0.52±0.28、0.99±0.17；結直腸癌組織中RUNX3蛋白相對表達量顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.904,P<0.05)。結腸癌細胞系HCT-116、SW-480細胞和正常結腸上皮細胞NCM460中RUNX3蛋白相對表達量分別為0.58±0.05、0.62±0.09、1.05±0.01，結腸癌細胞系HCT-116和SW-480細胞中RUNX3蛋白相對表達量均顯著低于正常結腸上皮細胞NCM460，差異有統(tǒng)計學意義(t=-14.738、-8.082,P<0.05)；結腸癌細胞系HCT-116與SW-480細胞中RUNX3蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(t=0.554,P>0.05)。

A:癌旁組織；B:結直腸癌組織。

A:結腸癌細胞系HCT-116細胞；B：結腸癌細胞系SW-480細胞；C：正常結腸上皮細胞NCM460。

2.3 結直腸癌組織中RUNX3表達與患者臨床病理特征的關系結果見表2。結直腸癌組織中RUNX3表達水平與患者淋巴結轉移、遠處轉移及腫瘤TNM分期有關(P<0.05)，與患者的性別、年齡、腫瘤直徑、位置、大體分型、浸潤深度及分化程度無關(P>0.05)。

2.4 結直腸癌組織中RUNX3表達水平與結直腸癌患者預后的關系結果見圖4。Kaplan-Meier生存分析顯示，結直腸癌組織中RUNX3低表達患者生存率為60.0%(39/65)，高表達患者生存率為71.4%(25/35)；高表達患者生存率顯著高于低表達患者，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.413，P<0.05)。

表2 結直腸癌組織中RUNX3表達與臨床病理特征的關系

圖4 結直腸癌組織中RUNX3高表達和低表達患者的生存曲線

2.5 結直腸癌患者生存影響因素的單因素Cox回歸分析結果見表3。單因素Cox回歸分析顯示，腫瘤浸潤深度、有無淋巴結轉移、有無遠處轉移、腫瘤TNM分期及RUNX3表達水平與患者生存顯著相關(P<0.05)，而患者性別、年齡、腫瘤位置、直徑、大體分型、分化程度與結直腸癌患者生存無顯著相關性(P>0.05)。

表3 結直腸癌患者生存影響因素的單因素Cox回歸分析

2.6 結直腸癌患者生存影響因素的多因素Cox回歸分析結果見表4。將單因素Cox回歸中差異有統(tǒng)計學意義的因素進一步行多因素Cox回歸分析，結果顯示，有無遠處轉移、腫瘤TNM分期及RUNX3表達水平是影響患者生存的獨立危險因素(P<0.05)。

表4 結直腸癌患者生存影響因素的多因素Cox回歸分析

3 討論

結直腸癌作為惡性程度較高的消化道腫瘤，侵襲能力較強，易出現(xiàn)早期轉移，多數(shù)患者預后不良，嚴重威脅著患者的生命健康[11]。盡管目前結直腸癌發(fā)病機制尚未完全闡明，但分子流行病學研究發(fā)現(xiàn)，相關基因的遺傳多態(tài)性在結直腸癌易感性中發(fā)揮著至關重要的作用[12-13]；因此，將抑癌基因或癌基因作為治療的靶點是目前結直腸癌研究的熱點之一[14]。

RUNX3基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，又稱急性髓性白血病因子2(acute myeloid leukemia 2,AML2)基因，其位于人染色體1號短臂1p36.1和鼠4號染色體上，含6個外顯子和1 290 bp的開放閱讀框，總長約67 kb，其中啟動子p2可控制基因的轉錄，對細胞的生長發(fā)育、凋亡、信號轉導及生物學效應的發(fā)揮起關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，RUNX3參與多種惡性腫瘤細胞的生長發(fā)育、增殖、凋亡及細胞信號轉導通路[15]，其中以TGF-β和Wnt信號傳導通路為主。RUNX3參與介導TGF-β由細胞質轉入細胞核，促使TGF-β與核內(nèi)靶蛋白相結合，調節(jié)靶點基因轉錄，同時與TGF-β傳導通路下游因子相互協(xié)同，增強TGF-β抑制細胞增長的能力；RUNX3還可以與Wnt信號轉導通路關鍵效應器T細胞因子4和β-連環(huán)蛋白形成復合物，從而抑制T細胞因子4/β-連環(huán)蛋白復合物與靶標DNA的結合，減弱目的基因的轉錄，抑制該通路的致癌作用。RUNX3異常表達導致TGF-β的信號轉導通路紊亂，細胞抗凋亡能力增強，從而引發(fā)包括結直腸癌在內(nèi)的惡性腫瘤的發(fā)生[16-17]。

RUNX3雖表達廣泛，但被認為與胃腸道發(fā)育相關，以RUNX3為靶點的研究能夠進一步理解結直腸癌的發(fā)病機制。RUNX3異常表達不僅與胃腺癌癌前病變及胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展、預后相關，而且參與肺癌、膀胱癌、胰腺癌等惡性腫瘤形成。而RUNX3與結直腸癌發(fā)生、發(fā)展及臨床預后的相關性尚未完全闡明?；诖?，本研究通過免疫組織化學染色法檢測結直腸癌患者癌組織及癌旁組織中RUNX3蛋白的表達水平，并通過蛋白免疫印跡法檢測結直腸癌組織、癌旁組織及正常結直腸上皮細胞NCM460、結腸癌細胞系HCT-116和SW-480細胞中RUNX3蛋白的相對表達量，結果發(fā)現(xiàn)，結直腸癌組織中RUNX3蛋白高表達率顯著低于癌旁組織；結直腸癌組織中RUNX3蛋白的相對表達量顯著低于癌旁組織，結腸癌細胞系HCT-116和SW-480細胞中RUNX3蛋白的相對表達量均顯著低于正常結腸上皮細胞NCM460，而結腸癌細胞系HCT-116和SW-480細胞中RUNX3蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義。賈光輝[18]、孫光源等[19]通過蛋白免疫印跡法檢測RUNX3蛋白在66對配伍的結直腸癌組織和癌旁組織中的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)，RUNX3在結直腸癌組織中的表達較癌旁組織顯著下調。另有研究表明，大腸癌中的RUNX3表達量較正常黏膜組織顯著降低，且RUNX3在伴有淋巴結轉移組和低分化組中的表達水平顯著低于未轉移組和中高分化組。上述研究與本研究結果一致，即結直腸癌組織中RUNX3高表達率顯著低于癌旁組織，結直腸癌細胞中RUNX3的表達水平顯著低于正常腸上皮細胞，這提示RUNX3基因的沉默、失活可能與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展存在相關性。

目前，圍繞RUNX3基因表達下調的相關分子機制，有研究指出，RUNX3基因表達下調與該基因啟動子區(qū)域甲基化密切相關[20]，而RUNX3基因表達下調會導致TGF-β信號轉導通路受到抑制，造成細胞凋亡失控，引發(fā)癌變可能。袁澤龍等[21]在關于zeste基因增強子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)和RUNX3在進展期直腸癌新輔助化學治療敏感性關系的研究中發(fā)現(xiàn)，與直腸癌旁組織相比，RUNX3蛋白在癌組織中表達顯著下調，可能與 EZH2通過誘導H3組蛋白的第27位賴氨酸發(fā)生甲基化而沉默RUNX3蛋白表達有關，其通過多因素logistic回歸法分析發(fā)現(xiàn)，RUNX3蛋白表達差異也是影響新輔助化學治療療效的影響因素之一，即RUNX3蛋白表達越低，療效越差。LI[22]研究顯示，RUNX3基因在結直腸癌組織中顯著下調，并且與結直腸癌的分期和轉移相關，RUNX3在TNM分期Ⅰ、Ⅱ期患者的癌組織中表達水平高于Ⅲ、Ⅳ期患者，提示低表達RUNX3患者往往預后不良。因此，為進一步探究RUNX3表達與結直腸癌患者臨床病理特征及預后的關系，本研究根據(jù)免疫組織化學檢測結果對結直腸癌患者RUNX3表達水平與患者臨床病理特征的相關性進行統(tǒng)計分析，結果發(fā)現(xiàn)，RUNX3蛋白表達與患者是否發(fā)生淋巴結轉移、遠處轉移及TNM分期相關，這進一步提示，RUNX3可能作為一種抑癌基因抑制結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展， RUNX3表達水平可反映結直腸癌患者的惡性程度，其可作為判斷結直腸癌預后的一個指標。

本研究Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，RUNX3高表達患者的生存率顯著高于低表達患者，提示RUNX3低表達可能不利于患者生存。同時，本研究通過COX模型單因素及多因素分析顯示，腫瘤的 TNM分期及RUNX3表達水平是影響結直腸癌患者預后的獨立危險因素。以上結果提示，RUNX3與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、不良預后具有高度相關性，可作為判定患者預后的潛在指標。

綜上所述，RUNX3在結直腸癌組織中呈低表達，且與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及不良預后有高度相關性，其可能參與了結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，但具體的調控機制尚待進一步研究。