微RNA-342-3p/末端尿苷酰轉(zhuǎn)移酶1/凝血酶敏感素-2通路在胰腺導(dǎo)管腺癌中的作用及機(jī)制

黃亞蘭，賴柏安，楊 玲，張薇珊，羅 婷

(遂寧市中心醫(yī)院病理科，四川 遂寧 629000)

胰腺導(dǎo)管腺癌是一種消化道腫瘤,惡性程度較高,診斷和治療難度大[1]，患病早期可能出現(xiàn)慢性胃炎、復(fù)發(fā)性胰腺炎的癥狀。此外，由于胰腺癌壓迫膽管,還可能導(dǎo)致黃疸癥狀的出現(xiàn),同時也可能出現(xiàn)糖尿病、腹瀉等良性疾病的癥狀[2]。胰腺導(dǎo)管腺癌是胰腺癌的主要類型,約占胰腺癌的80%～90%[3]。胰腺導(dǎo)管腺癌具有極高的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力,由于胰腺癌缺乏早期診斷標(biāo)志物,確診時多已發(fā)生局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致放射治療和化學(xué)治療效果不理想,治療后患者的中位生存期小于6個月,即使接受胰腺癌手術(shù)的患者， 5 a生存率仍低于20%[4]。因此，深入探討胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)病機(jī)制,為該病提供可行性診斷和治療靶點是目前急需要解決的問題。微RNA(microRNA，miRNA)具有發(fā)夾結(jié)構(gòu),能夠降解信使RNA(messenger RNA，mRNA)或抑制mRNA的翻譯,進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)[5]。有研究發(fā)現(xiàn),miR-342-3p在鼻咽癌、肝細(xì)胞癌等多種腫瘤中呈低表達(dá),具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的生物學(xué)行為,可以作為預(yù)測腫瘤預(yù)后的獨立因子[6]。末端尿苷酰轉(zhuǎn)移酶1 (terminal uridylyl transferase 1,TUT1)可對特定的miRNA進(jìn)行尿苷化,并間接控制其穩(wěn)定性和miRNA的表達(dá)[7]。凝血酶敏感素-2(thrombospondin-2,THBS2)是血小板反應(yīng)蛋白家族中的成員之一,具有多個結(jié)構(gòu)域的鈣離子相關(guān)性糖蛋白[8]。有研究發(fā)現(xiàn),THBS2具有調(diào)節(jié)組織創(chuàng)傷后重塑和抗血管生成的作用[9],與腫瘤的關(guān)系密切。目前，尚未見關(guān)于miR-342-3p在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中表達(dá)情況及調(diào)控TUT1、THBS2基因?qū)σ认賹?dǎo)管腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響的相關(guān)報道?；诖耍狙芯刻接憁iR-342-3p/TUT1/THBS2通路在胰腺導(dǎo)管腺癌中的作用及機(jī)制，以期為胰腺癌的診療提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織來源選擇2008年5月至2021年3月在遂寧市中心醫(yī)院行根治性手術(shù)切除的胰腺導(dǎo)管腺癌標(biāo)本(n=80)和對應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本(n=20)為研究對象。病例納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理學(xué)檢查確診為胰腺導(dǎo)管腺癌患者；(2)術(shù)前均未接受過放射治療、化學(xué)治療和靶向分子治療；(3)臨床資料完整;(4)原發(fā)胰腺導(dǎo)管腺癌；(5)患者知情同意并簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)合并或并發(fā)影響本研究結(jié)果的疾病者。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞、試劑與儀器人胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;二辛可寧酸蛋白質(zhì)定量試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司，聚偏氟乙烯膜和達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳配膠試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司,TUT1和THBS2一抗購自美國Millipore公司,miR-342-3p mimic和miR-342-3p inhibitor由上海吉瑪制藥公司合成，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒和細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒購自美國 Promega 公司,Lipofectamine 3000、TRIzol試劑購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司,慢病毒載體陰性對照(shRNA negative control,sh-NC)和pGCshL-TUT1載體由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;化學(xué)發(fā)光顯影系統(tǒng)購自英國Syngene公司,酶標(biāo)儀購自美國Biotech公司，常氧培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)法檢測胰腺導(dǎo)管腺癌組織和癌旁正常組織中miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA的表達(dá)取胰腺導(dǎo)管腺癌組織和癌旁正常組織各50 mg,剪碎,在液氮中研磨,采用TRIzoI試劑提取總RNA,應(yīng)用PrimeScriptTM RT Master Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA。miR-342-3p上游引物序列為5′-GCTACACATTACAGATACCT-3′,下游引物序列為5′-GACACCACTGCCATACCT-3′;TUT1上游引物序列為5′-TTCATTAATCTGGTCCATCT-3′,下游引物序列為5′-GTAATCCTAGGTGATCTAT-3′;THBS2上游引物序列為5′-GTATCTCAGGCGTACCGGCT-3′,下游引物序列為5′-GCCTTAAGTGATGCCTAAGTCT-3′;以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參,GAPDH上游引物序列為5′-GTCAATCCAGGTATATACCT-3′,下游引物序列為5′-GTTATCGTCTATATTACCAT-3′。qRT-PCR反應(yīng)體系:2×SYBR Green mixture 5 μL,PCR正向引物和反向引物各 1 μL,cDNA 1 μL,無RNase酶2 μL；反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算miR-342-3p、TUT1、THBS2 mRNA相對表達(dá)量。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)將人胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1接種于DMEM中，置于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%以上時,棄培養(yǎng)液,使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗3次,胰蛋白酶消化細(xì)胞,棄液,PBS沖洗2次,加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組取對數(shù)生長期PANC-1細(xì)胞,以每孔1×105個細(xì)胞接種于6孔板中,用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng) 24 h，待細(xì)胞生長至融合度80%～90%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，取6孔板中的PANC-1細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗，加入使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑配置好的混合液。將細(xì)胞分為10組，分別為對照組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-342-3p過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染miR-342-3p mimic)、miR-342-3p抑制劑組(轉(zhuǎn)染miR-342-3p inhibitor)、Vector組(轉(zhuǎn)染pCS4-HA vector)、TUT1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3-Flag- TUT1)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染sh-NC 慢病毒載體)、TUT1沉默組(轉(zhuǎn)染pGCshL-TUT1載體) 、miR-342-3p過表達(dá)+TUT1組(同時轉(zhuǎn)染miR-342-3p mimic和TUT1)、miR-342-3p過表達(dá)+THBS2組(同時轉(zhuǎn)染miR-342-3p mimic和THBS2)、TUT1+THBS2組(同時轉(zhuǎn)染pcDNA3-Flag-TUT1和THBS2),按照說明書操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞。

1.3.4 CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖能力取對照組、miR-342-3p過表達(dá)組、miR-342-3p抑制劑組、Vector組、TUT1組、陰性對照組、TUT1沉默組、miR-342-3p 過表達(dá)+TUT1組、miR-342-3p過表達(dá)+THBS2組、TUT1+THBS2組對數(shù)生長期PANC-1細(xì)胞，以每孔1×106個細(xì)胞接種于96孔板,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別于24、48、72 h 時取出培養(yǎng)板,每孔加入 10 μL CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,用酶標(biāo)儀測各孔吸光度值，吸光度值越大，細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況取對照組、miR-342-3p過表達(dá)組、miR-342-3p抑制劑組、Vector組、TUT1組、陰性對照組、TUT1沉默組、miR-342-3p 過表達(dá)+TUT1組、miR-342-3p過表達(dá)+THBS2組、TUT1+THBS2組對數(shù)生長期PANC-1細(xì)胞，以每孔1×106個細(xì)胞接種于6孔板,用不含乙二胺四乙酸鈉的胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞,PBS重懸細(xì)胞,3 000 r·min-1離心10 min,棄上清、重新重懸細(xì)胞，分別加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)混勻，避光孵育20 min，1 h后使用流式細(xì)胞儀檢測各組PANC-1細(xì)胞的凋亡情況。

1.3.6 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miR-342-3p與TUT1的靶向關(guān)系通過Targetscan網(wǎng)站預(yù)測miR-342-3p與TUT1的3′非編碼區(qū)(3′-untranslated region,3′-UTR)的結(jié)合點位,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法從基因組擴(kuò)增含有與miR-342-3p結(jié)合野生型或突變型的TUT13′-UTR序列,克隆到pGL-3熒光素酶報告載體,將載體和TUT1、對照物轉(zhuǎn)染到完全培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h的PANC-1細(xì)胞中,48 h后,采用雙熒光素酶報告基因測試盒檢測野生型和突變型TUT1相對熒光素酶活性。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3.7 Western blot法檢測PANC-1細(xì)胞中TUT1、THBS2蛋白表達(dá)提取對照組、miR-342-3p過表達(dá)組和miR-342-3p抑制劑組PANC-1細(xì)胞中的蛋白質(zhì),3 000 r·min-1離心5 min,加入蛋白裂解液，采用二喹啉甲酸法測蛋白濃度。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，轉(zhuǎn)膜 1 h，緩沖液沖洗。根據(jù)抗體說明書，加入TUT1 (11 000稀釋)、THBS2 (11 000稀釋)一抗和GAPDH抗體(11 000稀釋)， 4 ℃過夜。室溫下孵育二抗，2 h后回收二抗，緩沖液沖洗，電化學(xué)發(fā)光法顯影，拍照記錄。以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行目的蛋白定量分析，目的蛋白相對表達(dá)量以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示。實驗重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA在胰腺導(dǎo)管腺癌組織和癌旁正常組織中的相對表達(dá)量比較

胰腺導(dǎo)管腺癌組織中miR-342-3p、TUT1、THBS2 mRNA的相對表達(dá)量分別為1.03±0.02、0.98±0.03和1.04±0.02，癌旁正常組織中miR-342-3p、TUT1、THBS2mRNA的相對表達(dá)量分別為1.67±0.39、1.53±0.44和1.75±0.52；胰腺導(dǎo)管腺癌組織中miR-342-3p、TUT1、THBS2 mRNA的相對表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 胰腺導(dǎo)管腺癌癌組織中miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA表達(dá)與患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系結(jié)果見表1。不同年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期患者癌組織中miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA的表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；高分化癌組織中miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA的表達(dá)顯著高于中+低分化癌組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 胰腺導(dǎo)管腺癌癌組織中miR-342-3p、TUT1、THBS2 mRNA表達(dá)與患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

2.3 各組PANC-1細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞凋亡率比較結(jié)果見表2、表3、表4和圖1。培養(yǎng)0 h時，各組PANC-1細(xì)胞的增殖能力比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。培養(yǎng)24、48、72 h時，TUT1組細(xì)胞的增殖能力均顯著低于Vecort組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TUT1組細(xì)胞的凋亡率顯著高于Vecort組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。培養(yǎng)24、48、72 h時，TUT1沉默組細(xì)胞的增殖能力顯著高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TUT1沉默組的細(xì)胞凋亡率顯著低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

培養(yǎng)24、48、72 h時，miR-342-3p抑制劑組的細(xì)胞增殖能力顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-342-3p過表達(dá)組的細(xì)胞增殖能力顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。培養(yǎng)24 h時，miR-342-3p過表達(dá)+TUT1組、miR-342-3p 過表達(dá)+THBS2組、TUT1+THBS2組與miR-342-3p過表達(dá)組的細(xì)胞增殖能力比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。培養(yǎng)48、72 h時，miR-342-3p 過表達(dá)+TUT1組、miR-342-3p過表達(dá)+THBS2組、TUT1+THBS2組的細(xì)胞增殖能力均顯著低于miR-342-3p過表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。miR-342-3p抑制劑組細(xì)胞的凋亡率顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-342-3p過表達(dá)組細(xì)胞的凋亡率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-342-3p過表達(dá)+TUT1組、miR-342-3p過表達(dá)+THBS2組、TUT1+THBS2組細(xì)胞的凋亡率顯著高于miR-342-3p過表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 Vector組與TUT1組PANC-1細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞凋亡率比較

表3 陰性對照組與TUT1沉默組PANC-1細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞凋亡率比較

表4 對照組、miR-342-3p抑制劑組、miR-342-3p過表達(dá)組、miR-342-3p過表達(dá)+TUT1組、miR-342-3p過表達(dá)+THBS2組和TUT1+THBS2組細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞凋亡率比較

A:對照組;B:miR-342-3p過表達(dá)組;C:miR-342-3p抑制劑組;D:Vector組;E:TUT1組;F:陰性對照組;G:TUT1沉默組;H:miR-342-3p過表達(dá)+TUT1組;I:miR-342-3p過表達(dá)+THBS2組;J:TUT1+THBS2組。

2.4 miR-342-3p與TUT1的靶向關(guān)系分析結(jié)果結(jié)果見圖2。熒光素酶報告結(jié)果顯示,對照組和miR-342-3p過表達(dá)組細(xì)胞中野生型TUT1報告基因的熒光素酶活性分別為1.02±0.19、1.74±0.67，突變型TUT1的熒光素酶活性分別為1.01±0.23、1.03±0.22。miR-342-3p過表達(dá)組細(xì)胞中野生型TUT1報告基因的熒光素酶活性顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；突變型TUT1報告基因的熒光素酶活性與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 miR-342-3p與TUT1的靶向關(guān)系

2.5 對照組、miR-342-3p過表達(dá)組和miR-342-3p抑制劑組細(xì)胞中TUT1、THBS2蛋白相對表達(dá)量比較結(jié)果見圖3。對照組和miR-342-3p過表達(dá)組細(xì)胞中TUT1蛋白的相對表達(dá)量分別為1.02±0.07、1.63±0.18，THBS2蛋白的相對表達(dá)量分別為0.97±0.05、1.59±0.14；對照組和miR-342-3p抑制劑組細(xì)胞中TUT1蛋白的相對表達(dá)量分別1.01±0.05、0.49±0.03，THBS2蛋白的相對表達(dá)量分別為0.95±0.07、0.34±0.06。miR-342-3p過表達(dá)組細(xì)胞中TUT1和THBS2蛋白的相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);miR-342-3p抑制劑組細(xì)胞中TUT1和THBS2蛋白的相對表達(dá)量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 對照組、miR-342-3p過表達(dá)組和miR-342-3p抑制劑組細(xì)胞中TUT1、THBS2蛋白表達(dá)(Western blot)

3 討論

胰腺癌是一種致死率極高的消化系統(tǒng)常見的腫瘤。近年來,胰腺癌的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢,該病的發(fā)病比較隱匿,且在發(fā)病早期就可出現(xiàn)組織浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,而且惡性程度較高,放射治療和化學(xué)治療效果不理想。目前，最有效的辦法是行根治性腫瘤切除手術(shù)。但近80%的患者確診時已屬于晚期或者已發(fā)生轉(zhuǎn)移[10]。僅有20%的患者才有機(jī)會進(jìn)行手術(shù),10%的患者才可行徹底的切除手術(shù),而且常規(guī)手術(shù)治療后,患者平均生存率最高為20個月,切除率較低,預(yù)后較差[11]。有研究報道,胰腺癌的 5 a總生存率僅為5%,是常見腫瘤中病死率較高的惡性腫瘤[12]。因此,迫切需要探索新的有效的治療方法來改變胰腺癌的治療現(xiàn)狀。

miRNA參與細(xì)胞增殖、凋亡等多種生理過程和生物學(xué)行為的調(diào)控[13]。miR-342-3p由14號染色體編碼,有研究表明,miR-342-3p可通過靶向人宮頸癌中的FOXM1來抑制增殖、遷移和侵襲[14]。miR-342-3p還可通過直接抑制E2F1的表達(dá)調(diào)控人肺癌MYC的轉(zhuǎn)錄活性[15]。還有研究表明,miR-342-3p可通過靶向AGR2抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和遷移[16]。關(guān)于miR-342-3p在肺癌、宮頸癌、甲狀腺癌、乳腺癌中的作用的研究較多,但目前關(guān)于miR-342-3p在胰腺導(dǎo)管腺癌中的作用的報道較少。基于此，本研究探討了miR-342-3p在胰腺導(dǎo)管腺癌中的作用,并通過觀察miR-342-3p對TUT、THBS2的調(diào)控作用來驗證miR-342-3p/TUT1/THBS2通路在胰腺導(dǎo)管腺癌中的主要作用。

TUT1 是末端尿苷酰轉(zhuǎn)移酶,可將尿苷磷酰化尾部與 U6-snRNA 的30區(qū)結(jié)合,誘導(dǎo) LSM2-8 蛋白復(fù)合物的募集[17]。有研究表明，TUT1可通過使特定 miRNA 的尿苷磷?；?，來間接控制miRNA的穩(wěn)定性和整體miRNA的表達(dá)。在人骨肉瘤細(xì)胞株MG63和U2OS中,增強(qiáng)TUT1的表達(dá)可以抑制細(xì)胞增殖[18]。THBS2是一種鈣結(jié)合糖蛋白,在創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤形成和胚胎發(fā)育中發(fā)揮著組織重建的作用[19]。有研究顯示，THBS2在宮頸癌中呈低表達(dá)[20]。本研究結(jié)果顯示,miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的相對表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織。胰腺導(dǎo)管腺癌組織中miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA的表達(dá)與患者的年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及腫瘤分期無關(guān)；但與腫瘤的分化程度有關(guān)，其在高分化腫瘤組織中的相對表達(dá)量顯著高于中+低分化組織。本研究結(jié)果提示，miR-342-3p、TUT1、THBS2可能屬于抑癌基因,其表達(dá)量增加能夠阻止胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

為了證實miR-342-3p在胰腺導(dǎo)管腺癌中的作用機(jī)制,本研究采用CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)檢測PANC-1細(xì)胞的增殖和凋亡情況,結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-342-3p可以抑制PANC-1細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡;抑制miR-342-3p的表達(dá)可以促進(jìn)PANC-1細(xì)胞的增殖,降低其凋亡。本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-342-3p可顯著上調(diào)野生型TUT1報告基因的熒光素酶活性；過表達(dá)TUT1后,PANC-1細(xì)胞的增殖能力顯著降低,凋亡率顯著升高，沉默TUT1的表達(dá)后,PANC-1細(xì)胞的增殖能力則顯著升高,凋亡率顯著降低；過表達(dá)miR-342-3p后,PANC-1細(xì)胞中的TUT1、THBS2蛋白的表達(dá)顯著增加,而抑制miR-342-3p 表達(dá)后,TUT1、THBS2蛋白的表達(dá)則顯著降低。以上結(jié)果說明，miR-342-3p與TUT1、THBS2存在正相關(guān)關(guān)系。為了進(jìn)一步驗證miR-342-3p/TUT1/THBS2通路對PANC-1細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)制,本研究采用雙轉(zhuǎn)染實驗來觀察miR-342-3p 對TUT1和THBS2的作用,結(jié)果顯示,miR-342-3p過表達(dá)+TUT1組、miR-342-3p過表達(dá)+THBS2組、TUT1+THBS2組的細(xì)胞增殖能力顯著低于miR-342-3p過表達(dá)組。miR-342-3p過表達(dá)+TUT1組、miR-342-3p過表達(dá)組+THBS2組、TUT1+THBS2組的細(xì)胞的凋亡率顯著高于miR-342-3p過表達(dá)組；這說明，miR-342-3p/TUT1/THBS2通路可以抑制PANC-1細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)其凋亡。

綜上所述,過表達(dá)miR-342-3p可以抑制PANC-1細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡，進(jìn)而抑制胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)展，其機(jī)制可能與miR-342-3p/TUT1/THBS2通路有關(guān)。