微RNA-335對胃癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制

路德榮，顧世玉，魏晨初，郗曉慧，郁 帥

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

胃癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，而我國是胃癌高發(fā)國家，且近年來其發(fā)病率呈上升趨勢[1]。目前，對胃癌發(fā)病機制的研究已取得重大進展，但仍尚未完全明確[2]。微RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性單鏈小分子RNA。人體內(nèi)的miRNA可通過與靶基因3′非翻譯區(qū)(3′-untranslated region，3′UTR)配對，實現(xiàn)對mRNA轉(zhuǎn)錄及翻譯的調(diào)控，從而在腫瘤細(xì)胞分化、增殖、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[3]。人miR-335定位于7q32.2，并與miR-335下游多種基因存在靶控關(guān)系[4]。研究證實，miR-335在胃癌[5]、甲狀腺癌[6]、肺癌[7]等惡性腫瘤組織中存在低表達，可導(dǎo)致其靶基因調(diào)控異常，進而為惡性腫瘤細(xì)胞增殖、分化提供有利條件。p53是一種腫瘤抑制基因，50%以上惡性腫瘤中會出現(xiàn)該基因的突變，可參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡；野生型p53基因是一種抑癌基因，是迄今為止被發(fā)現(xiàn)最為有效的腫瘤抑制基因[8-10]；突變型p53可作為腫瘤促進因子引起腫瘤細(xì)胞的惡化和轉(zhuǎn)移[11-13]。研究顯示，miR-335可通過p53和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2信號抑制腫瘤的生長[14]。目前，miR-335的表達變化對胃癌增殖及轉(zhuǎn)移的影響尚未完全明確，且miR-335是否可通過靶向調(diào)控p53參與胃癌細(xì)胞增殖及凋亡過程尚未可知?；诖?，本研究選擇胃癌細(xì)胞株SGC-7901為研究對象，探討miR-335對胃癌細(xì)胞內(nèi)p53的靶向調(diào)控作用及其對胃癌細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)節(jié)機制，為胃癌的臨床診斷及靶向治療提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織來源選擇2020年1月至2021年7月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院收治的胃癌患者為研究對象，收集患者手術(shù)切除的胃癌組織、癌旁組織(距癌灶1～2 cm)及切緣正常組織。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有標(biāo)本均經(jīng)電子胃鏡聯(lián)合病理活檢組織病理學(xué)檢測證實；(2)患者術(shù)前均未接受化學(xué)治療、放射治療或其他免疫治療；(3)患者病歷資料完整。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤或重要臟器功能不全的患者；(2)有嚴(yán)重心肺疾病、高血壓、嚴(yán)重血液系統(tǒng)疾病及近1周服用抗凝劑等內(nèi)鏡檢查禁忌證的患者。本研究共納入胃癌患者61例，其中男40例，女21例；年齡23～78(53.2±11.9)歲；臨床分級：Ⅰ級33例，Ⅱ 級16例；Ⅲ級12例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者45例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者16例。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器人胃癌細(xì)胞系SGC-7901購自蘇州瑞思坦細(xì)胞庫，胎牛血清、達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)購自美國Gibco公司，轉(zhuǎn)染試劑Lip2000購自美國Invitrogen公司，實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time flurocent qualitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒(包括RNA提純、反轉(zhuǎn)錄及擴增試劑盒)購自日本TaKaRa公司，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)檢測試劑盒購自美國Sigma有限公司，Transwell小室購自美國Corning公司，p53和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自美國Santa Cruz公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；qRT-PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，p53-3′UTR預(yù)測基因質(zhì)粒的構(gòu)建由廣州銳博生物公司協(xié)助完成。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染將人胃癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM中，當(dāng)細(xì)胞匯合度生長至80%～90%時及時傳代，收集含有細(xì)胞的DMEM，800×g離心 5 min，棄上清后，吸取一定量細(xì)胞滴入已經(jīng)加入完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶內(nèi)，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)；將胃癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞隨機分為miR-335轉(zhuǎn)染組、空白載體組和對照組。miR-335轉(zhuǎn)染組SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-335 precursor，空白載體組SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-335-NC，應(yīng)用Lipofectamine 2000試劑進行轉(zhuǎn)染，嚴(yán)格按照說明書進行操作；對照組細(xì)胞不做任何轉(zhuǎn)染；于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6 h，之后更換含血清的DMEM培養(yǎng)1 d。

1.3.2 qRT-PCR法檢測胃癌組織、癌旁組織和正常組織中miR-335表達取胃癌組織、癌旁組織及正常組織，充分研磨，每50 mg組織加入1 mL TRIzol試劑，移液器吹吸6～8次，轉(zhuǎn)入無RNA酶的EP管中，靜置5 min，加入0.2 mL氯仿，混勻，靜置5 min，800×g離心15 min，吸取上層水相并置于無RNA酶的EP管中，加入0.5 mL異丙醇，靜置10 min，4 ℃下12 000×g離心15 min；去除上清液，加入1 mL 的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇，混勻，4 ℃下12 000×g離心5 min，去除上清液，靜置5～10 min，加入適量焦碳酸二乙酯水溶解RNA沉淀(60 ℃，10 min)。 采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳實驗觀察所提取的樣品總RNA的完整性，合格后，將各樣品中DNA污染去除，使用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用超微量紫外可見光分光光度計對cDNA純度及濃度進行測定；采用qRT-PCR法檢測miR-335表達，以GAPDH為內(nèi)參。引物序列如下：miR-335上游引物序列為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCG-3′，下游引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；GAPDH上游引物序列為5′-TGTTCGAC-ACTCCTCCGTCAGC-3′，下游引物序列為5′-CAAATCCCC-CAATACGACGTT-3′。分析各cDNA樣品的擴增曲線及溶解曲線，按2-ΔΔCt計算miR-335相對表達量。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3.3 MTT法檢測3組SGC-7901細(xì)胞的增殖能力將3組SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng) 72 h，使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，加入20 μL MTT孵育4 h，按照每孔150 μL將二甲基亞砜加入至每個細(xì)胞培養(yǎng)孔中，脫色搖床上振蕩反應(yīng) 10 min，使細(xì)胞內(nèi)的結(jié)晶物溶解，使用酶標(biāo)儀測定波長 570 nm 處吸光度值，以吸光度值代表細(xì)胞增殖能力，吸光度值越高代表增殖能力越高。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3.4 劃痕實驗檢測3組SGC-7901細(xì)胞遷移能力調(diào)整3組SGC-7901細(xì)胞濃度為1×108L-1，將2 mL細(xì)胞懸液接種至6孔板，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育過夜；去除孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入新鮮的含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM，孵育過夜；去除細(xì)胞培養(yǎng)液，在孔板內(nèi)用200 μL 無菌微量移液槍頭垂直劃痕，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌3次，加入無血清的DMEM，于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；分別于0、24、48、72 h時在倒置顯微鏡下隨機選擇劃痕區(qū)域5個視野進行拍照，測量不同時間點劃痕寬度，計算劃痕細(xì)胞遷移的長度差異即為細(xì)胞遷移距離。細(xì)胞遷移距離越大表示遷移能力越高。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3.5 Transwell小室法檢測3組SGC-7901細(xì)胞侵襲能力應(yīng)用人工基質(zhì)膠(Matrigel膠)構(gòu)建侵襲小室，于4 ℃條件下將人工基質(zhì)膠進行稀釋，均勻平鋪于8 μm的聚碳酸酯膜上，覆蓋微孔，在37 ℃條件下靜置30 min凝固，置于紫外線下照射30 min以滅菌消毒；用不含血清的DMEM持續(xù)培養(yǎng)24 h，維持趨化液的滲透壓，將各組轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)期的細(xì)胞用無菌PBS清洗2～3次，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)24 h；棄上清，加入體積分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶，待多數(shù)細(xì)胞變圓并開始脫落時終止消化，收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中，4 ℃下1 500×g離心 5 min，制備單細(xì)胞懸液；將細(xì)胞密度調(diào)整至5×108L-1；將小室放入細(xì)胞培養(yǎng)板中，在上室加入 300 μL 預(yù)溫的無血清DMEM，在室溫條件下靜置15～30 min； 將200 μL趨化液加入下室，向其上加蓋已制備好的人工基質(zhì)膠；向每個上室加入稀釋好的400 μL單細(xì)胞懸液，設(shè)置3個平行小室；小室置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h；取出小室，擦去上室細(xì)胞，加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液固定 30 min，蘇木精-伊紅常規(guī)染色，于倒置顯微鏡下選取5個視野對穿膜細(xì)胞進行計數(shù)，以穿過人工基底侵襲膜細(xì)胞的相對數(shù)量表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3.6 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的構(gòu)建和熒光素酶活性檢測將含有p53-3′UTR預(yù)測基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入SGC-7901細(xì)胞(細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法同前)，并隨機分為對照組、空白載體組和miR-335轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入100 μL DMEM和100 μL配制好的luciferase底物，漩渦振蕩 5 min，使用熒光光度計測定熒光值(hLcu熒光值)。然后，加入100 μL配制好的反應(yīng)終止液，漩渦振蕩5 min，熒光光度計測定熒光值(hRuc熒光值)。最終熒光值=hLcu熒光值/hRuc熒光值，以最終熒光值代表熒光素酶活性。

1.3.7 Western blot法檢測對照組、空白載體組及轉(zhuǎn)染組SGC-7901細(xì)胞中p53蛋白表達取3組SGC-7901細(xì)胞用預(yù)冷的RIPA細(xì)胞裂解液(每1×106個細(xì)胞加入1 mL的細(xì)胞裂解液)進行裂解，充分勻漿后靜置30 min， 4 ℃下12 000×g離心30 min，二喹啉甲酸法測定上清液蛋白濃度。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%分離膠 5 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%濃縮膠3 mL，用微量加樣器將蛋白marker、各蛋白樣品加入梳孔內(nèi)，蛋白上樣量20 μg。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒壓60 V，之后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，350 mA恒流電轉(zhuǎn)移2 h。使用脫脂牛奶室溫下封閉60 min，用體積分?jǐn)?shù)5%的脫脂奶粉溶液將抗p53抗體稀釋，滴加一抗，4 ℃孵育 24 h，然后用含吐溫20 Tris緩沖鹽溶液洗滌10 min×3次；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗體孵育60 min，后用TBST洗滌10 min×3次，采用化學(xué)發(fā)光法染色，使用成像掃描分析系統(tǒng)測定蛋白條帶的灰度值， p53蛋白相對表達量以p53條帶灰度值與內(nèi)參灰度值的比值表示。實驗重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織、胃癌癌旁組織、正常組織中miRNA-335相對表達量比較胃癌組織、胃癌癌旁組織、正常組織中miR-335相對表達量分別為1.02±0.21、2.71±0.13、2.86±0.42。胃癌組織、胃癌癌旁組織、正常組織中miR-335相對表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.150，P<0.05)。胃癌組織中miR-335相對表達量顯著低于正常組織和胃癌癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.238、8.796，P<0.05)；癌旁組織與正常組織中miR-335相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.293，P>0.05)。

2.2 3組SGC-7901細(xì)胞增殖能力比較對照組、空白載體組和miR-335轉(zhuǎn)染組細(xì)胞吸光度值分別為1.86±0.22、1.73±0.22、0.82±0.11。3組SGC-7901細(xì)胞的增殖能力比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.452，P<0.05)。miR-335轉(zhuǎn)染組SGC-7901細(xì)胞的增殖能力顯著低于空白載體組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.192、9.209，P<0.05)；空白載體組與對照組SGC-7901細(xì)胞的增殖能力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.910，P>0.05)。

2.3 3組SGC-7901細(xì)胞遷移距離比較結(jié)果見圖1。對照組、空白載體組和miR-335轉(zhuǎn)染組SGC-7901細(xì)胞的遷移距離分別為(1 886.34±121.04)、(1 839.73±114.33)、(1 067.82±70.87)μm。3組SGC-7901細(xì)胞遷移距離比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.964，P<0.05)。miR-335轉(zhuǎn)染組SGC-7901細(xì)胞遷移距離顯著短于空白載體組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.833、12.987，P<0.05)；空白載體組與對照組SGC-7901細(xì)胞遷移距離比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.623，P>0.05)。

A:對照組；B:空白載體組；C：miR-335轉(zhuǎn)染組。

2.4 3組SGC-7901細(xì)胞侵襲能力比較結(jié)果見圖2。對照組、空白載體組和miR-335轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞侵襲數(shù)分別為(173.66±11.59)、(169.24±13.39)、(79.44±8.29)個。3組SGC-7901細(xì)胞侵襲數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=18.741，P<0.05)。 miR-335轉(zhuǎn)染組SGC-7901細(xì)胞侵襲數(shù)顯著少于空白載體組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.750、14.553，P<0.05)；空白載體組與對照組SGC-7901細(xì)胞侵襲數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.556，P>0.05)。

A:對照組；B:空白載體組；C：miR-335轉(zhuǎn)染組。

2.5 3組SGC-7901細(xì)胞熒光素酶活性比較熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，對照組、空白載體組和miR-335轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性分別為1.56±0.23、1.49±0.26、0.68±0.09，含有p53-3′UTR預(yù)測基因質(zhì)粒miR-335轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性顯著低于空白載體組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.609、7.671，P<0.05)，空白載體組與對照組細(xì)胞熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.432，P>0.05)。

2.6 3組SGC-7901細(xì)胞中p53蛋白相對表達量比較結(jié)果見圖3。對照組、空白載體組和miR-335轉(zhuǎn)染組SGC-7901細(xì)胞中p53蛋白相對表達量分別為1.46±0.12、1.38±0.13、0.79±0.11。3組SGC-7901細(xì)胞中p53蛋白相對表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.358，P<0.05)。miR-335轉(zhuǎn)染組SGC-7901細(xì)胞中p53蛋白相對表達量顯著低于空白載體組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.652、9.227，P<0.05)；空白載體組與對照組SGC-7901細(xì)胞中p53蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.004，P>0.05)。

圖3 3組SGC-7901細(xì)胞中p53蛋白表達

3 討論

我國是胃癌高發(fā)國家，胃癌的發(fā)病率和病死率分別位居惡性腫瘤的第2位、第3位，但我國早期胃癌的診斷率仍低于20%。目前，以手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療為基礎(chǔ)的多學(xué)科綜合治療正越來越廣泛地應(yīng)用到胃癌的治療中，但胃癌患者的遠期生存率仍不盡如人意，5 a生存率僅為27.4%，因此，早期診斷胃癌及尋找更為有效的輔助治療方法和治療靶點抑制腫瘤局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移是臨床亟待解決的重點及難點問題。miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。邢麗娜等[15]研究報道，miR-335可通過調(diào)控Survivin表達、下調(diào)核因子-κB信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并抑制B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。WU等[16]研究報道，miR-335通過高膠原蛋白Ⅺ亞型限制卵巢癌的侵襲。王崢嶸等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-335在胃癌細(xì)胞中呈低表達。有研究報道，LINC00319通過上調(diào)腺苷酸環(huán)化酶3促進miR-335的表達而抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移[18]，提示miR-335具有抑癌基因的功能，但miR-335在胃癌中的表達及作用尚未完全明確。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-335相對表達量顯著低于正常組織和胃癌癌旁組織，而正常組織與胃癌癌旁組織中miR-335相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示miR-335可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。為進一步探究miR-335對胃癌細(xì)胞增殖和遷移的影響，本研究將miR-335 precursor轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞，并與轉(zhuǎn)染miR-335-NC的SGC-7901細(xì)胞和未做任何轉(zhuǎn)染的SGC-7901細(xì)胞做對照，結(jié)果顯示，miR-335轉(zhuǎn)染組SGC-7901細(xì)胞的增殖水平顯著低于空白載體組和對照組，空白載體組與對照組SGC-7901細(xì)胞的增殖水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；miR-335轉(zhuǎn)染組SGC-7901細(xì)胞的遷移距離顯著短于空白載體組和對照組，空白載體組與對照組SGC-7901細(xì)胞的遷移距離比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；miR-335轉(zhuǎn)染組SGC-7901細(xì)胞侵襲數(shù)顯著少于空白載體組和對照組，空白載體組與對照組SGC-7901細(xì)胞侵襲數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；說明過表達miR-335可顯著抑制胃癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

在惡性腫瘤中，p53基因可出現(xiàn)突變，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡過程。p53基因分為野生型和突變型2種，野生型p53主要發(fā)揮抑癌活性，突變型p53卻喪失了抑癌活性，甚至促進細(xì)胞癌變惡化[11,19]。生物信息學(xué)基因組預(yù)測提示，p53可能是miR-335的靶向基因之一，但miR-335是否可通過靶向調(diào)控p53參與胃癌細(xì)胞增殖及凋亡過程報道較少。為進一步探究轉(zhuǎn)染miR-335抑制胃癌細(xì)胞增殖的機制，本研究將含有p53-3′UTR預(yù)測基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入SGC-7901細(xì)胞，熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，含有p53-3′UTR預(yù)測基因質(zhì)粒的miR-335轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的熒光素酶活性顯著低于空白載體組和對照組，空白載體組與對照組細(xì)胞的熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；說明p53基因有miR-335的潛在作用靶點，miR-335可直接調(diào)控p53蛋白的表達。此外，本研究結(jié)果顯示，miR-335轉(zhuǎn)染組SGC-7901 細(xì)胞中p53蛋白相對表達量顯著低于空白載體組和對照組，空白載體組與對照組SGC-7901細(xì)胞中p53蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這提示，miR-335高表達可降低腫瘤細(xì)胞中p53的表達，從而抑制p53基因的突變，這可能是miR-335發(fā)揮抑癌作用的重要方式。

綜上所述，胃癌組織中miR-335呈低表達，miR-335可能通過靶向抑癌基因p53抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移，這為miR-335作為胃癌的診斷及治療提供了實驗依據(jù)。