二甲雙胍對胰島素抵抗小鼠肝組織中胎球蛋白A 表達(dá)及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信號通路的影響

高俊鳳，嚴(yán) 軍，胡春平，馮珍鳳，劉曼曼

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，上海 201203；2.上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 201899)

胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是指由于組織器官對胰島素的敏感性和反應(yīng)性減低，機(jī)體需要高水平的循環(huán)胰島素來達(dá)到正常的生物學(xué)效應(yīng)，使機(jī)體代償性胰島素分泌增多而出現(xiàn)一系列病理改變。IR是肥胖、2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)、動脈粥樣硬化、高脂血癥和高尿酸血癥等代謝紊亂疾病的危險因素及病理生理基礎(chǔ)[1-4]。近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活方式的改變，與IR相關(guān)的代謝紊亂疾病發(fā)病率逐年上升[5-6]。過多或不當(dāng)?shù)母咧嬍硵z入往往會影響肝臟胰島素分泌相關(guān)信號通路，引起肝臟IR[7]。胎球蛋白A(fetuin A，F(xiàn)A) 也稱為α2-Heremans-Schmid糖蛋白，主要由肝細(xì)胞分泌入血，是一種多功能時相蛋白質(zhì)[8]。人類FA主要通過磷酸化合成，在胎兒時期可在多種組織中合成，在血液中含量最高，是一種重要的蛋白質(zhì)；而在成年人中FA含量明顯降低，95%于肝臟中表達(dá)[9-10]。FA在代謝綜合征、炎癥、肥胖、肝脂肪變性及動脈粥樣硬化等多種疾病的患者中水平顯著升高[11-15]，說明FA可能促進(jìn)IR病理進(jìn)程，但其是否通過抑制胰島素相關(guān)信號通路發(fā)揮作用目前尚不明確。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B，Akt)信號通路是調(diào)控胰島素信號傳導(dǎo)的經(jīng)典通路，PI3K/Akt信號通路失衡會導(dǎo)致肥胖、T2DM 及其并發(fā)癥的發(fā)生[16-17]。二甲雙胍是目前臨床一線降糖藥物，可有效改善IR，增強(qiáng)胰島素敏感性[18]。基于此，本研究旨在探討二甲雙胍對IR小鼠肝組織中FA表達(dá)及PI3K/Ak信號通路的影響，以期為IR提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物30只6周齡無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級健康雄性C57BL/6J小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號：北京百善 SCXK(京)2016-0006]，體質(zhì)量18～22 g，飼養(yǎng)于SPF級實驗動物設(shè)施IVC系統(tǒng)，溫度(22±5)℃，相對濕度(50±10)%，明暗周期 12 h/12 h，鼠籠每日清潔消毒。

1.2 主要試劑與儀器高脂飼料購自美國Research Diets公司，鹽酸二甲雙胍片購自中美上海施貴寶制藥有限公司(國藥準(zhǔn)字20023370)，酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，F(xiàn)A 抗體購自美國Affinity Biosciences公司，放射免疫沉淀(radio-immunoprecipitation,RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司，PI3K、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K)、Akt、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p-Akt)抗體購自美國CST公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司，羊抗兔免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G購自上海泊灣生物科技有限公司；全自動醫(yī)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)分析系統(tǒng)購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司，酶標(biāo)儀、Gene Gnome曝光系統(tǒng)購自美國Bio Tek Instruments公司；本研究所用PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與處理30只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選擇10只小鼠為正常組，給予普通飼料喂養(yǎng)8周；另外20只小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)8周，制備IR模型，所有小鼠隔夜禁食不禁水。30只小鼠喂養(yǎng) 8周后，采用腹腔注射葡萄糖耐量實驗(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)作時間-血糖水平曲線，以IR模型小鼠的曲線下面積高于正常組小鼠曲線下面積均值為IR模型建立成功[19]。將造模成功的16只小鼠隨機(jī)分為模型組(n=8)和二甲雙胍組(n=8)。二甲雙胍組小鼠給予二甲雙胍灌胃(102.75 mg·kg-1)，每日1次，連續(xù)給藥4周；正常組和模型組小鼠給予同等劑量的生理鹽水灌胃。

1.3.2 小鼠體質(zhì)量測定造模8周期間和給藥4周期間，每周稱量小鼠體質(zhì)量，并記錄數(shù)值。

1.3.3 空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平及穩(wěn)態(tài)模型評估-胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment-estimated insulin resistance，HOMA-IR)檢測給藥4周后，將3組小鼠剪尾采血， 1 000 r·min-1離心5 min，取上層血清，使用胰島素酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒測定小鼠血清FINS水平，嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進(jìn)行操作；并計算HOMA-IR，HOMA-IR=空腹血糖(mmol·L-1)×FINS(μg·L-1)/22.5。

1.3.4 IPGTT給藥4周后，3組小鼠禁食12 h，腹腔注射體積分?jǐn)?shù)25%葡萄糖溶液，分別于注射前和注射后30、60、120 min剪尾采血，使用血糖儀測定血糖水平，作時間-血糖水平曲線并計算曲線下面積，曲線下面積表示糖耐量，曲線下面積越大表示糖耐量越低。

1.3.5 實時熒光定量PCR法檢測小鼠肝組織中FA、PI3K、Akt mRNA相對表達(dá)量給藥4周后，進(jìn)行完“1.5”和“1.6”項實驗后將所有小鼠處死，取肝組織，液氮保存。隨機(jī)取各組4只小鼠肝組織100 mg，加入液氮研磨后，使用TRIzol試劑提取小鼠肝組織中總RNA，將 1 μg 總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作。以cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR，反應(yīng)體系20 μL：SYBR Green Mix 10 μL,Primer Mix 2 μL，ddH2O 3 μL，cDNA 5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)。內(nèi)參18 S上游引物序列為5′-AGTCGCCGTGCCTACCAT-3′,下游引物序列為5′-CGGGTCGGGAGTGGGTAAT-3′；PI3K上游引物序列為5′-GATTGGCTGGGGTGTGTGAT-3′,下游引物序列為5′-GGGGCAGTGCTGGTGG-3′；Akt上游引物序列為5′-TGGCAGATGGACTCAAGAG-3′,下游引物序列為5′-CTCGTTCATGGTCACACGGT-3′；FA上游引物序列為5′-CCCCGCTGGCAAATCTCAT-3′,下游引物序列為5′-TCGTGGTAAGTTCGGTGGTC-3′。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)分析各條帶熒光強(qiáng)度。以18 S基因為內(nèi)參，以目的條帶的熒光強(qiáng)度與內(nèi)參條帶的熒光強(qiáng)度比值表示目的基因mRNA相對表達(dá)量。

1.3.6 Western blot法檢測小鼠肝組織中FA、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白相對表達(dá)量分別取3組小鼠肝組織100 mg，加入液氮研磨后，使用RIPA裂解液提取小鼠肝組織總蛋白。使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。取20 μL 蛋白上樣，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后將蛋白恒壓轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，將聚偏二氟乙烯膜放入封閉液中37 ℃封閉1 h，使用Tris緩沖生理鹽水-吐溫20洗膜 3 次，每次 15 min，加入FA、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt一抗 (稀釋度 11 000)，4 ℃冰箱孵育過夜，使用Tris緩沖生理鹽水-吐溫20洗膜3次，每次15 min；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(稀釋度 15 000)，置于搖床上緩慢搖動，室溫下孵育1 h，Tris緩沖生理鹽水-吐溫20洗膜3次，每次15 min。使用ECL試劑于暗室中顯影，應(yīng)用Gene Gnome系統(tǒng)曝光顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示目的蛋白相對表達(dá)量，并計算p-PI3K與PI3K蛋白相對表達(dá)量比值(p-PI3K/PI3K)、p-Akt與Akt蛋白相對表達(dá)量比值(p-Akt/Akt)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量變化結(jié)果見表1。造模前，3組小鼠的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.783，P>0.05)。 造模8周后，模型組與二甲雙胍組小鼠的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模8周后，模型組和二甲雙胍組小鼠的體質(zhì)量顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 給藥1、2、3、4周后，模型組和二甲雙胍組小鼠的體質(zhì)量顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。給藥1、2周后，模型組與二甲雙胍組小鼠的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。給藥3、4周后，二甲雙胍組小鼠的體質(zhì)量顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 3組小鼠體質(zhì)量比較

2.2 3組小鼠糖耐量比較給藥4周后，正常組、模型組、二甲雙胍組小鼠的IPGTT曲線下面積分別為1 605.68±126.52、2 535.38±221.36、2 102.91±304.56。模型組和二甲雙胍組小鼠的IPGTT曲線下面積顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 二甲雙胍組小鼠的IPGTT曲線下面積顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 3組小鼠FINS水平及HOMA-IR比較結(jié)果見表2。給藥4周后，模型組小鼠的FINS水平及HOMA-IR顯著高于正常組、二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；二甲雙胍組與正常組小鼠的FINS水平及HOMA-IR比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 3組小鼠FINS水平及HOMA-IR比較

2.4 3組小鼠肝組織中FA、PI3K、Akt mRNA相對表達(dá)量比較結(jié)果見表3。給藥4周后，模型組小鼠肝組織中FA、PI3K、Akt mRNA相對表達(dá)量顯著高于正常組、二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；二甲雙胍組與正常組小鼠肝組織中FA、PI3K、Akt mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 3組小鼠肝組織中FA、PI3K、Akt mRNA相對表達(dá)量比較

2.5 3組小鼠肝組織中FA蛋白相對表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比較結(jié)果見圖1和表4。給藥4周后，模型組小鼠肝組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt顯著低于正常組、二甲雙胍組，F(xiàn)A蛋白相對表達(dá)量顯著高于正常組、二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。二甲雙胍組與正常組小鼠肝組織中FA蛋白相對表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表4 3組小鼠肝組織中蛋白相對表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比較

3 討論

高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠構(gòu)建IR模型在IR相關(guān)代謝疾病研究中常被使用[20-22]。在本研究中，造模前，3組小鼠的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；造模8周后，模型組與二甲雙胍組小鼠的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；模型組和二甲雙胍組小鼠的體質(zhì)量顯著高于正常組，進(jìn)一步驗證了模型組和二甲雙胍組小鼠IR模型構(gòu)建成功。此外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥1、2、3、4周后，模型組和二甲雙胍組小鼠的體質(zhì)量顯著高于正常組；給藥1、2周后，模型組與二甲雙胍組小鼠的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；給藥3、4周時，二甲雙胍組小鼠的體質(zhì)量顯著低于模型組；說明使用二甲雙胍干預(yù)后IR小鼠體質(zhì)量增加趨勢減緩，提示二甲雙胍有利于改善IR小鼠的肥胖狀態(tài)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥4周后，模型組和二甲雙胍組小鼠的IPGTT曲線下面積顯著高于正常組，二甲雙胍組小鼠的IPGTT曲線下面積較模型組顯著降低，說明IR模型小鼠的糖耐量低于正常小鼠，而二甲雙胍干預(yù)后IR小鼠的糖耐量提高，提示二甲雙胍可提高IR小鼠胰島β細(xì)胞功能和機(jī)體對血糖濃度的調(diào)節(jié)能力。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥4周后，模型組小鼠的FINS水平及HOMA-IR顯著高于正常組和二甲雙胍組；二甲雙胍組與正常組小鼠的FINS水平及HOMA-IR比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；提示二甲雙胍可降低IR小鼠FINS水平及HOMA-IR，改善IR狀態(tài)。

FA是一種肝臟細(xì)胞因子，有研究證實，F(xiàn)A與IR病理機(jī)制相關(guān)，是IR發(fā)生的危險因素[23]。有研究表明，F(xiàn)A 的磷酸化狀態(tài)對于抑制胰島素作用至關(guān)重要，并且與肥胖和胰島素抵抗有關(guān)[24]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥4周后，模型組小鼠肝組織中FA mRNA和蛋白相對表達(dá)量顯著高于正常組和二甲雙胍組，二甲雙胍組與正常組小鼠肝組織中FA mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示二甲雙胍可降低IR小鼠肝組織中FA水平。FA 在肝臟中是胰島素受體酪氨酸激酶的內(nèi)源性抑制劑，可抑制胰島素受體底物-1和PI3K的磷酸化，從而使肝臟產(chǎn)生IR[25]。

PI3K/Akt信號通路是調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和胰島素水平的經(jīng)典信號通路，在胰島素信號傳導(dǎo)中扮演著重要角色[26]。肝臟是胰島素參與調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的重要靶器官，可通過減少肝葡萄糖生成和糖原分解，降低餐后血糖水平，維持機(jī)體空腹?fàn)顟B(tài)下血糖濃度的穩(wěn)態(tài)[27-34]。有研究表明，二甲雙胍可通過改善嚙齒動物PI3K/Akt/葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4通路，改善胰島β細(xì)胞功能障礙，從而減弱肝臟IR[35]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥4周后，模型組小鼠肝組織中PI3K、Akt mRNA相對表達(dá)量顯著高于正常組和二甲雙胍組，二甲雙胍組與正常組小鼠肝組織中PI3K、Akt mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；模型組小鼠肝組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt顯著低于正常組和二甲雙胍組，二甲雙胍組與正常組小鼠肝組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；這提示，二甲雙胍可提高IR小鼠肝組織中PI3K/Akt通路關(guān)鍵蛋白磷酸化水平。

綜上所述，二甲雙胍可改善IR小鼠的肥胖狀態(tài)，提高機(jī)體對血糖濃度的調(diào)節(jié)能力，降低FINS水平及HOMA-IR，其機(jī)制可能為二甲雙胍通過降低肝臟FA表達(dá)，激活PI3K/Akt通路，從而緩解IR。本研究團(tuán)隊將繼續(xù)完善后續(xù)PI3K/Akt胰島素信號傳導(dǎo)通路中跨膜蛋白的相關(guān)研究，深入探討FA與PI3K/Akt信號通路之間的關(guān)系。