β-煙酰胺單核苷酸的合成研究進(jìn)展

周 愛，張佳麗，董文興，吳英捷，林思佳，尹龍飛

（臺(tái)州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000）

0 引言

煙酰胺單核苷酸（Nicotinamide mononucleotide，NMN）是一種具有生物活性并廣泛存在于自然中的核苷酸。NMN有α和β兩種化學(xué)結(jié)構(gòu)，β-異構(gòu)體是其活性形式。NMN是一種人體內(nèi)重要的輔助因子，主要在電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)中起作用［1］。NMN還是一種具有延緩衰老作用的天然化合物，是人體細(xì)胞中的一種內(nèi)源性物質(zhì)［2］。美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院David Sinclair教授發(fā)現(xiàn)NMN能夠有效轉(zhuǎn)化成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide,NAD），并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了NMN具有抗衰老、延長壽命的功效［3］。面對新冠病毒全球肆虐，西達(dá)塞納醫(yī)學(xué)中心的Robert Huizenga利用NMN雞尾酒療法能明顯改善新冠肺炎患者體內(nèi)出現(xiàn)的細(xì)胞因子風(fēng)暴［4］。根據(jù)近幾年NMN在市場的風(fēng)向顯示，它在醫(yī)藥美容行業(yè)和食品科技方面具有很高的應(yīng)用前景。2017年，基因港首次推出了生物合成的NMN-艾沐茵。大量研究表明，NMN 對阿爾茨海默病［5］、帕金森?。?］、退行性疾?。?-8］、代謝性疾病和肥胖病［9］等具有一定的治療作用。Irie等［10］研究表明，NMN在人體內(nèi)具有良好的耐受性，這為其將來在臨床上的研究打開了藍(lán)圖。

近年來，NMN的高效合成方式引來了科學(xué)界和工業(yè)界的眾多關(guān)注?，F(xiàn)已知可以通過化學(xué)法或生物法來合成NMN。化學(xué)合成NMN需要保護(hù)和脫保護(hù)過程，它還使用了對環(huán)境有污染性的溶劑，并且其合成的NMN中只有2/3具有生物活性的異構(gòu)體［11］。與化學(xué)合成不同的是，NMN的生物合成具有高立體選擇性、溫和的反應(yīng)條件、低副產(chǎn)品數(shù)等優(yōu)點(diǎn)。對于生物法發(fā)酵途徑，可以使用廉價(jià)的原料，如核糖、肌酸和煙酰胺等，在底物存在的情況下通過過表達(dá)合成NMN的酶來實(shí)現(xiàn)NMN的高效合成。事實(shí)上，酶催化法和發(fā)酵法具有一些相同的酶轉(zhuǎn)化步驟。目前，NMN雖然能通過化學(xué)合成生產(chǎn)，但其成本較高且轉(zhuǎn)化率不高，因此現(xiàn)有合成技術(shù)不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。本綜述主要討論了生物法生產(chǎn)NMN的最新進(jìn)展，重點(diǎn)討論了參與這些過程的關(guān)鍵酶，并對其市場應(yīng)用價(jià)值和未來應(yīng)用前景等進(jìn)行了深度分析與展望。

1 化學(xué)合成

雖然現(xiàn)有報(bào)道的NMN的化學(xué)合成方法較多，但是化學(xué)合成存在對環(huán)境有極大污染、產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本高等不利因素，影響著其大規(guī)模發(fā)展。目前NMN的化學(xué)合成方法主要有4種：

（1）煙酸乙酯與四乙酰核糖經(jīng)過縮合，再通過脫乙酰基、磷酸化和氨解的主要工藝步驟，制備得到β-NMN［12］。

（2）在酸催化劑存在下，煙酰胺核糖與縮酮化試劑反應(yīng)以保護(hù)煙酰胺核糖，然后磷酸化，經(jīng)分離作用脫保護(hù)得到β-NMN［13］。

（3）Lee等以四乙酰核糖經(jīng)氫溴酸溴代，與煙酰胺發(fā)生取代制得，再經(jīng)氨氣脫乙酰基，用三氯氧磷/磷酸三甲酯磷酸化后經(jīng)樹脂層析法純化得β-NMN，總收率達(dá)到57%［14］。

（4）改進(jìn)了以煙酸乙酯與四乙酰核糖為起始原料，經(jīng)縮合、脫乙?；⒘姿峄?、氨解反應(yīng)，其NMN總收率約為64%。雖然此方法的原料容易得到、收率高且過程中的中間產(chǎn)物無須純化，但該方法是使用交換樹脂后處理的，工藝成本較高［15］。

2 生物合成

生物合成法因得益于其所用的催化劑反應(yīng)條件溫和安全、對環(huán)境基本無污染、分離過程較為簡單、轉(zhuǎn)化率和對映選擇性較高等優(yōu)點(diǎn)，所以其更加優(yōu)于化學(xué)合成方法并成為近年來生物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

2.1 酶促法

目前公開報(bào)道采用酶催化生產(chǎn)β-煙酰胺單核苷酸的生物合成法有：

（1）以煙酰胺核糖（Nicotinamide Riboside,NR）為起始底物，在煙酰胺核苷激酶（Nicotinamide Riboside Kinase,NRK）的作用下將NR和ATP催化生成NMN和二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate,ADP）［16］，如圖 1 所示。

圖1 NRK催化NR合成NMN

（2）以煙酰胺（Nicotinamide,NAM）為起始底物，在煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Nicotinamide Phosphoribosyltransferase,NAMPT）的作用下將NAM和磷酸核糖焦磷酸（Phosphoribosyl Pyrophosphate,PRPP）催化生成NMN和焦磷酸［17-18］，如圖2所示。

圖2 NAMPT催化PRPP合成NMN

此方法中使用到的NAMPT是一個(gè)關(guān)鍵酶，它已經(jīng)被廣泛研究。NAMPT在哺乳動(dòng)物中被廣泛表達(dá)，但大多數(shù)細(xì)菌缺乏NAMPT基因［19］。研究表明：來自哺乳動(dòng)物和細(xì)菌的10種NAMPTs的活性與其細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平大致相關(guān)；來自Chitinophaga pinensis的NAMPT在E.coli中的表達(dá)水平最高，表現(xiàn)出最高的NAM轉(zhuǎn)化活性［20］。NAMPT是NAD生物合成途徑中的限速酶，它可以影響細(xì)胞中的NAD濃度的相對平衡［21］。相比之下，具有高活性的NAMPT更適合用于NMN的工業(yè)生產(chǎn)。方法中用到的PRPP是合成NMN的重要原料，而PRPP不僅非常昂貴而且不穩(wěn)定，所以直接使用它作為工業(yè)應(yīng)用的底物是不可行的?，F(xiàn)有研究表明：可以把簡單的相對廉價(jià)的底物（如核糖、腺苷和葡萄糖）轉(zhuǎn)化為PRPP，進(jìn)而合成NMN。

2.1.1 核糖轉(zhuǎn)化為PRPP

生產(chǎn)PRPP的一個(gè)比較經(jīng)濟(jì)的方法是通過兩步催化步驟，將作為起始材料的核糖轉(zhuǎn)化為PRPP。第一步，使用ATP作為磷酸基團(tuán)的供體，利用核糖激酶（Riboside Kinase,RK）催化核糖生成核酮糖-5-磷酸（R5P）；第二步，利用磷酰焦磷酸合成酶（PRS）將ATP的二磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到R5P的C1-羥基上，誘導(dǎo)PRPP的產(chǎn)生。據(jù)報(bào)道，E.coli核糖激酶的酶學(xué)特性已被廣泛研究，它的活性主要受陽離子（如鉀離子和鎂離子）的影響［22］。在優(yōu)化條件下，其常數(shù)Kcat/KM可高達(dá)3.48×108，這一數(shù)據(jù)表明E.coli的RK可以用高效的方式轉(zhuǎn)化出 D-核糖［23］。

根據(jù)對磷酸鹽離子活性的要求及二磷酸基團(tuán)供體的特異性和異生調(diào)節(jié)機(jī)制，PRSs可分為三個(gè)亞組［24-26］。第一類PRSs是被調(diào)查研究最多的，它可以被Mg2+和磷酸鹽激活，但被二磷酸腺苷（ADP）競爭性和異生性抑制［27］。來自Bacillus subtilis、E.coli和人類的I類PRSs的三維結(jié)構(gòu)已被解析。所有這些結(jié)構(gòu)顯示，PRS的功能形式是一個(gè)六聚體，每個(gè)亞單位由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成［28-30］。ATP和R5P在一個(gè)亞單位的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的界面上與催化活性部位相結(jié)合，ADP與六聚體的三個(gè)亞基之間的界面上的異生位點(diǎn)相結(jié)合，從而降低了酶對活性位點(diǎn)上的ATP和R5P的親和力，導(dǎo)致其活性受到抑制。盡管Bacillus subtilis、E.coli和人類的PRSs的晶體結(jié)構(gòu)相似，但它們的酶學(xué)特性是不同的。人類的PRS對于R5P和ATP具有較高的結(jié)合親和力，但最大的親和力是來自枯草桿菌的PRS［31-32］。

據(jù)報(bào)道，PRS的酶學(xué)特性也會(huì)受到突變的影響。人類的PRS中提到的D52H、N114S和L129I通過增加對ADP的抗性而導(dǎo)致其過度活躍［33-34］。與此結(jié)果一致的是，淀粉酶中的N120S和L135I（對應(yīng)于人類PRS中的N114S和L129I）也對ADP進(jìn)行抵抗，從而減輕了ADP引起的抑制程度［30］。值得注意的是，PRS的抑制劑ADP是核糖到R5P的生物合成過程中的副產(chǎn)品。因此，抗ADP的PRS可能具有巨大的潛力，可以在一系列反應(yīng)中把核糖轉(zhuǎn)化為PRPP［35］。

2.1.2 腺苷轉(zhuǎn)化為PRPP

一專利［36］報(bào)道了一種以腺苷為起始材料并通過串聯(lián)催化合成PRPP的方法，第一步，腺苷首先被腺苷激酶（Adenosine Kinase,ADK）轉(zhuǎn)化為一磷酸腺苷（Adenosine Monophosphate,AMP）；然后，通過AMP和無機(jī)焦磷酸合成PRPP和腺嘌呤（A），這一生物轉(zhuǎn)化過程是由腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Adenine Phosphoribosyltransferase,APRT）催化的；最后，在NAMPT和NAM的存在下，合成的PRPP被轉(zhuǎn)化為NMN。ADK屬于糖激酶的磷酸果糖激酶B（PfkB）家族。事實(shí)上，上面描述的RK也屬于PfkB家族。這個(gè)家族的成員有3個(gè)保守的序列圖案，它們的活動(dòng)需要五價(jià)元素的存在［37］。第二步，APRT催化正向和反向反應(yīng)，其中AMP的合成是正向反應(yīng)［38］，高濃度水平的AMP可以增加PRPP的合成速率，因?yàn)樗钦蚍磻?yīng)的競爭性抑制劑［39］。Huyet等［40］證明，人類APRT中的Tyr105是調(diào)節(jié)該反應(yīng)兩個(gè)方向的動(dòng)力學(xué)活性的關(guān)鍵性氨基酸殘基，因?yàn)門yr105Phe突變體增加了對AMP的抑制作用，從而降低了該酶對正向反應(yīng)的催化效率。然而，該專利中使用了來自E.coli的野生型APRT，其NMN產(chǎn)量高達(dá)19 g/L。由于NAMPT消耗了PRPP，促進(jìn)了APRT催化反方向的反應(yīng)，從而導(dǎo)致具有雙向活性的野生型APRT催化反應(yīng)的NMN產(chǎn)量和理論高產(chǎn)量之間的不一致。

2.1.3 通過葡萄糖合成PRPP

葡萄糖是一種廣泛應(yīng)用于工業(yè)的糖類，如果它的生物催化效率足夠高，它就有可能成為合成PRPP的理想材料。Shinichiro等［20］報(bào)道了一種生產(chǎn)NMN的方法，其中PRPP是由E.coli從葡萄糖中發(fā)酵產(chǎn)生的，它過表達(dá)了其磷酸戊糖途徑的七個(gè)內(nèi)源基因。磷酸戊糖途徑分為兩個(gè)階段：氧化階段和非氧化階段。葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）在氧化階段被轉(zhuǎn)化為R5P和二氧化碳；然后在非氧化階段，一個(gè)分子的5-核酮糖被轉(zhuǎn)化為一個(gè)分子的R5P和兩個(gè)分子的5-木酮糖。其中非氧化階段產(chǎn)生的R5P是改良版磷酸戊糖途徑的目標(biāo)產(chǎn)品，它可用于等摩爾合成PRPP，那么利用磷酸戊糖途徑的非氧化階段可以獲得PRPP的前體物質(zhì)——R5P。因此，PRPP在這個(gè)E.coli工程菌中得到了有效的制備。研究顯示：51.6%的葡萄糖（在培養(yǎng)基中含量為21 g/L）通過磷酸戊糖途徑被用來合成NMN，產(chǎn)量為6.79 g/L。

2.1.4 應(yīng)用ATP再生系統(tǒng)進(jìn)行NMN的生物合成

上述的酶促法合成NMN都需要ATP作為底物，并且在有ATP存在的情況下，NAMPT可以通過自磷酸化激活［41］。引入與聚磷酸激酶（Polyphosphate Kinase,PPK）有關(guān)的ATP再生系統(tǒng)，能夠大幅減少ATP的消耗，實(shí)現(xiàn)低成本生產(chǎn)NMN［42］。ATP再生系統(tǒng)包括兩部分：其一是需要ATP參與的生物酶反應(yīng)系統(tǒng)；其二是ATP生物合成系統(tǒng)，二者缺一不可。在反應(yīng)過程中，ATP降解產(chǎn)生的ADP（或AMP）通過其他反應(yīng)體系再生成ATP，從而使ATP能夠再生并用于生物合成。用能夠再生ATP的廉價(jià)底物來替代反應(yīng)物中昂貴的ATP，能夠進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本以達(dá)到高效生產(chǎn)目標(biāo)［43］。PPK可催化無機(jī)聚磷酸鹽（Poly P）和ATP之間的可逆轉(zhuǎn)化［44］，且由于Poly P容易獲得且價(jià)格低廉，因此以PPK為基礎(chǔ)的ATP再生系統(tǒng)受到業(yè)內(nèi)更多的關(guān)注［45］。

2.2 發(fā)酵法

國內(nèi)外科研人員對發(fā)酵法合成NMN也進(jìn)行了大量的研究。發(fā)酵法過程比較復(fù)雜，因?yàn)樗硕喾N酶的復(fù)雜系統(tǒng)。除了反應(yīng)條件外，催化過程還可能受到其他非目標(biāo)酶的影響。發(fā)酵法利用NAMPT催化PRPP轉(zhuǎn)化為NMN，其中的焦磷酸鹽（PPi）是一種副產(chǎn)品。Burgos等［41］證明，PPi的水解有利于反應(yīng)平衡向NMN的生產(chǎn)方向轉(zhuǎn)移。通過添加焦磷酸酶（PPase）消除PPi，NMN的產(chǎn)量增加了約50%，可能是因?yàn)楦碑a(chǎn)品PPi的降解促進(jìn)了反應(yīng)過程［42］。但由于宿主細(xì)胞內(nèi)其余非目標(biāo)酶的存在，在催化過程中可能會(huì)發(fā)生底物、中間產(chǎn)物和NMN合成的最終產(chǎn)物的消除。例如，底物煙酰胺可以被宿主吡嗪酰胺酶/煙酰胺酶1（PNC1）脫氨形成煙酸。研究表明，在pnc1缺失的酵母菌細(xì)胞中，NMN的產(chǎn)量明顯較高［46］。

在發(fā)酵法中，有研究表明細(xì)胞內(nèi)的底物轉(zhuǎn)入和產(chǎn)物轉(zhuǎn)出是影響NMN產(chǎn)量的另一個(gè)關(guān)鍵因素［20］，NAM進(jìn)入到工程菌細(xì)胞內(nèi)是合成NMN所必需的首要條件。在篩選的6個(gè)煙酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因（NiaP）中，來自布氏菌的NiaP表現(xiàn)出對NAM具有最高的吸收活性。在表達(dá)NiaP的基因工程菌中，NMN的產(chǎn)量提高約25%。NMN在細(xì)胞中會(huì)通過NMNAT催化作用轉(zhuǎn)化為NAD，從而導(dǎo)致其產(chǎn)量下降。因此除了下調(diào)NMNAT外，避免這種轉(zhuǎn)化的另一個(gè)策略是將NMN輸出到細(xì)胞外。而PRPP和NAM向NMN的轉(zhuǎn)化是可逆的，這就表明NMN在細(xì)胞內(nèi)的積累可能會(huì)阻礙產(chǎn)品在細(xì)胞內(nèi)的形成。然而，在E.coli中NMN并不能高效地輸出到培養(yǎng)基中［35］。Shinichiro等［20］鑒定了一種來自霉菌的新的煙酰胺核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體（PnuC），它能夠幫助排出細(xì)胞內(nèi)的NMN，使表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)體的E.colii工程菌的NMN產(chǎn)量提高了30%，并且大部分NMN被輸出到上清液中。Liu等［47］采用一系列代謝工程策略，包括增加能量供給，提高底物進(jìn)入細(xì)胞的效率等，使得NMN的產(chǎn)量達(dá)到496.2 mg/L。

3 展望

鑒于NMN具有抗衰老等功能以及具備安全性較高、熱穩(wěn)定性較好等優(yōu)點(diǎn)，因此NMN將有十分廣闊的應(yīng)用前景。NMN在減緩生物體生理機(jī)能衰退、延緩衰老等方面有特殊功效；在醫(yī)藥、美容、食品保健及日化領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景；對于帕金森病、阿爾茨海默病及糖尿病等的治療效果極佳［48］。由于目前NMN的合成仍然艱難，其面臨操作復(fù)雜、產(chǎn)品純度低、收率低以及成本高昂等問題。在今后研究中，可利用基因工程技術(shù)，采用全細(xì)胞生物催化方法合成NMN，最終構(gòu)建出一個(gè)完整、高效的β-煙酰胺單核苷酸全細(xì)胞催化和分離純化體系，為NMN的產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)今我國在醫(yī)療健康方面應(yīng)用NMN的占比較大，而在食品方面的應(yīng)用卻寥寥無幾。隨著業(yè)內(nèi)對NMN安全性及效果的進(jìn)一步探索研究，將會(huì)有更多與NMN相關(guān)的保健品用于生活中，造福人類。