RNA研發(fā)簡史：從微不足道到無比重要

郭曉強，李巖異

①河北體育學(xué)院 運動人體科學(xué)系，石家莊 050041；②華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司，石家莊 050035

新冠肺炎疫情暴發(fā)使公眾對“核酸檢測”一詞耳熟能詳，那么作為檢測物的“核酸”究竟是何種物質(zhì)？如何被發(fā)現(xiàn)和研究？又有何種重要功能和應(yīng)用呢？

核酸(nucleic acid)有兩大類，一類是核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)，另一類是脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)。DNA與RNA在結(jié)構(gòu)和功能上存在較大差別，DNA主要以雙鏈結(jié)構(gòu)存在(雙螺旋)，作為遺傳物質(zhì)；RNA以單鏈結(jié)構(gòu)為主(局部存在雙鏈結(jié)構(gòu))，功能較為多樣。今天，兩類分子都已成為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究重點，而它們的發(fā)現(xiàn)可追溯到19世紀(jì)60年代。

1 核素的發(fā)現(xiàn)

米歇爾(Friedrich Miescher)出生于瑞士一個學(xué)術(shù)氛圍濃厚的家庭，父親和叔叔都是巴塞爾大學(xué)的教授，他自小就對科學(xué)充滿巨大興趣。17歲時，米歇爾進(jìn)入巴塞爾大學(xué)學(xué)習(xí)醫(yī)學(xué)，打算遵從父親建議完成醫(yī)學(xué)培訓(xùn)后主攻耳科，卻中途而廢。這一方面是由于米歇爾對醫(yī)學(xué)興趣有限，另一方面則是兒時耳部感染導(dǎo)致聽力不佳，對臨床工作造成不便，使他最終選擇從事更感興趣的基礎(chǔ)科學(xué)研究。

1868年秋，米歇爾來到德國圖賓根霍佩-塞勒(Ernst Felix Immanuel Hoppe-Seyler)的實驗室，開啟了他的研究生涯?；襞?塞勒是著名的生理學(xué)家和化學(xué)家，也是現(xiàn)代生物化學(xué)開創(chuàng)者之一，在血液成分、血紅蛋白性質(zhì)等領(lǐng)域均作出重要貢獻(xiàn)。米歇爾堅定地認(rèn)為解決諸多生命問題已不能僅依靠傳統(tǒng)的觀察法，而應(yīng)更多運用化學(xué)方法，這也是他加入霍佩-塞勒實驗室的主要原因。作為霍佩-塞勒唯一的學(xué)生，米歇爾決定研究細(xì)胞的化學(xué)成分。由于當(dāng)時淋巴細(xì)胞是此類研究的主要材料來源，最初米歇爾試圖從動物淋巴結(jié)分離淋巴細(xì)胞，但收率較低，很難達(dá)到實驗所需的細(xì)胞量。后來在霍佩-塞勒建議下，他從外科繃帶新鮮膿液中分離白細(xì)胞。這一改進(jìn)收到奇效，很容易地獲得足夠?qū)嶒灢牧稀?/p>

米歇爾最初關(guān)注細(xì)胞的蛋白質(zhì)成分，這是當(dāng)時的主流研究方向。然而在一次實驗過程中他意外發(fā)現(xiàn)一種加酸沉淀，隨后再加堿沉淀又溶解的現(xiàn)象，這一特性與當(dāng)時已知的蛋白質(zhì)都不相同，他推測可能存在一種新物質(zhì)。米歇爾經(jīng)全面研究和分析最終確定這種物質(zhì)盡管有部分性質(zhì)與蛋白質(zhì)相似，但絕非蛋白質(zhì)。他對這種物質(zhì)進(jìn)行元素構(gòu)成分析，發(fā)現(xiàn)其含有碳、氫、氧、氮和磷元素，而非蛋白質(zhì)的碳、氫、氧、氮和硫元素，進(jìn)一步證明這是一種新物質(zhì)，該物質(zhì)位于細(xì)胞核，故命名核素(nuclein)[1]。米歇爾還進(jìn)一步確定磷是以有機(jī)結(jié)合的磷酸存在，而非游離的無機(jī)磷酸，從而確定了核素的第一種成分。

1869年底，米歇爾將這一重大發(fā)現(xiàn)匯報給霍佩-塞勒，但后者對此持懷疑態(tài)度。為慎重起見，霍佩-塞勒又指派助手重復(fù)米歇爾的實驗，確認(rèn)無誤后才最終于1871年和米歇爾的結(jié)果同時發(fā)表。盡管米歇爾最初認(rèn)定核素是一種重要物質(zhì)，但在研究幾年無重大突破后最終還是放棄了該方向。1889年，德國病理學(xué)家奧爾特曼(Richard Altmann)利用胃蛋白酶和堿水解方法成功去除核素中絕大部分蛋白質(zhì)成分，將剩余顯酸性成分正式命名為核酸(nucleic acid)。此時核酸包含DNA和RNA兩種，接下來需要研究其化學(xué)組成。

2 幾種堿基的鑒定

科塞爾(Albrecht Kossel)出生于德國羅斯托克一個富裕家庭，從小就對化學(xué)和植物學(xué)產(chǎn)生濃厚興趣，并于1872年進(jìn)入斯特拉斯堡大學(xué)學(xué)習(xí)醫(yī)學(xué)。在這里他受到多位科學(xué)大師的熏陶，其中就包括霍佩-塞勒。1877年，科塞爾成為霍佩-塞勒的研究助理，開啟自己的科研生涯，并在接觸到核素后決定解析其化學(xué)構(gòu)成。

為研究核素組成，科塞爾首先需要解決實驗材料問題。他與當(dāng)?shù)匾患彝涝讏鼋⒚芮嘘P(guān)系，由后者為其提供實驗材料——牛的胰腺?？迫麪柕恼麄€研究過程耗費了30頭牛的100 kg胰腺和200 L的酸(如鹽酸等)，以期從中發(fā)現(xiàn)其化學(xué)組成。艱苦付出終于獲得回報，1885年科塞爾從核酸中分離得到兩種生物堿基：一種是1844年由德國化學(xué)家馬格努斯(Heinrich Gustav Magnus)發(fā)現(xiàn)的鳥嘌呤(guanine, G)；另一種為新物質(zhì)，科塞爾將其命名為腺嘌呤(adenine, A)，以紀(jì)念材料來源——胰腺。幾年后科塞爾又從屠宰場獲得另一批器官——胸腺，并于1893年鑒定出第3種新堿基，再次根據(jù)來源命名為胸腺嘧啶(thymine, T)。1894年，科塞爾發(fā)現(xiàn)構(gòu)成核酸的第4種堿基，命名為胞嘧啶(cytosine, C)。1901年，科塞爾的學(xué)生阿斯科利(Alberto Ascoli)發(fā)現(xiàn)第5種堿基——尿嘧啶(uracil, U)。至此，構(gòu)成核酸的堿基鑒定完畢，科塞爾也由于在核酸化學(xué)組成成分研究上的重大貢獻(xiàn)(堿基發(fā)現(xiàn))獲得1910年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎，這也是諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎早期唯一一次頒發(fā)給純基礎(chǔ)研究，也說明委員會對科學(xué)發(fā)展獨有的深邃洞察力。

3 核糖的發(fā)現(xiàn)

20世紀(jì)初，研究人員發(fā)現(xiàn)從多種生物材料中獲得的核酸在組成上存在一定的差異，最終確定自然界存在兩種核酸，酵母核酸和胸腺核酸。這兩種核酸均含4種堿基，其中A、G和C相同，而酵母核酸含U，胸腺核酸含T。此外，這兩種核酸的糖有些許不同，但具體差異卻不得而知。

列文(Phoebus Aaron Theodore Levene)是出生于俄國的美籍生物化學(xué)家，學(xué)醫(yī)期間對生物化學(xué)產(chǎn)生濃厚興趣，1893年移民到美國，先后在哥倫比亞大學(xué)和紐約大學(xué)州立醫(yī)院學(xué)習(xí)和工作，期間還曾在著名生物化學(xué)家科塞爾和費歇爾(Emil Fischer)實驗室工作過，熟悉核酸組成的研究方法。1905年，列文成為新成立的洛克菲勒大學(xué)醫(yī)學(xué)院的一員，開啟系統(tǒng)研究核酸的生涯。1909年，列文和助手雅各布斯(Walter Jacobs)從酵母核酸中鑒定出D-核糖(1891年由費歇爾實驗室首先合成，但對作用未深入研究)，并證明其是核酸基本成分之一，推翻了傳統(tǒng)觀點(當(dāng)時認(rèn)為L-木糖是核酸組成成分)。20年后列文又發(fā)現(xiàn)胸腺核酸所含戊糖為脫氧核糖[2]。酵母核酸和胸腺核酸獲得基于結(jié)構(gòu)而非來源的新名稱：酵母核酸為核糖核酸，即RNA；胸腺核酸為脫氧核糖核酸，即DNA。至此，RNA三種基本成分磷酸、核糖和堿基鑒定完畢(圖1)。

圖1 RNA及其組成元件的發(fā)現(xiàn)

盡管1909年就完成了RNA成分的鑒定，但其生物功能一直未得到科學(xué)界足夠重視。一方面當(dāng)時缺乏研究生物大分子的強有力工具；另一方面在于思維慣性，如20世紀(jì)初小分子研究較為成熟，想當(dāng)然地認(rèn)為酶的本質(zhì)是小分子，待蛋白質(zhì)研究成為主流時，自然而然又認(rèn)為遺傳物質(zhì)為蛋白質(zhì)。因此，RNA研究進(jìn)展緩慢。但是，50年代這種狀況有了巨大改觀，RNA研究迎來春天。

4 RNA與蛋白質(zhì)合成

帕拉德(George Emil Palade)出生于羅馬尼亞一個知識分子家庭，父親為大學(xué)哲學(xué)教授，母親是中學(xué)教師，在這種氛圍熏陶下，他對自然科學(xué)尤其是醫(yī)學(xué)興趣濃厚。他在布加勒斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)習(xí)期間，原本想成為一名臨床醫(yī)生，但出于對基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的摯愛而投身科研事業(yè)。1946年初，帕拉德來到美國，幸運結(jié)識紐約大學(xué)的克勞德(Albert Claude)教授，隨后學(xué)習(xí)了克勞德發(fā)明的細(xì)胞組分分離方法和新興的電子顯微鏡技術(shù)，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。20世紀(jì)50年代初，帕拉德利用細(xì)胞組分分離方法將肝臟組織勻漿離心獲得兩部分顆粒狀結(jié)構(gòu)：一部分為容易沉淀的大顆粒，包含已知的線粒體等細(xì)胞器；另一部分是難沉淀的小顆粒，命名為微粒體。1955年，帕拉德發(fā)現(xiàn)微粒體總附著于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，據(jù)此將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分為粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(附著微粒體)和光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(不附著微粒體)。帕拉德通過使用去污劑溶解微粒體膜證明了其由蛋白質(zhì)和RNA兩部分構(gòu)成，并將其命名為核蛋白顆粒(ribonucleoprotein particle,RNP)。由于RNA攜帶遺傳信息，推測RNP可能參與蛋白質(zhì)合成，微粒體于1958年被重新命名為核糖體(ribosome)，相應(yīng)的RNA被稱為核糖體RNA(ribosomal RNA, rRNA)[3]。1974年，帕拉德由于在核糖體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)領(lǐng)域的發(fā)現(xiàn)而分享了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

扎梅奇尼克(Paul Charles Zamecnik)出生于美國俄亥俄州克利夫蘭市一個捷克后裔家庭。受經(jīng)濟(jì)大蕭條影響，扎梅奇尼克為了穩(wěn)定而選擇醫(yī)學(xué)專業(yè)，最終卻因?qū)A(chǔ)科學(xué)的濃厚興趣從事了科學(xué)研究。當(dāng)時多個研究小組都在探索蛋白質(zhì)合成機(jī)制，而扎梅奇尼克對此也具有濃厚興趣。1953年，扎梅奇尼克成功制備出第一個大鼠肝臟勻漿無細(xì)胞體系，使蛋白質(zhì)體外實驗操作大大簡化，同時借助當(dāng)時研究蛋白質(zhì)生物合成的兩種常規(guī)方法(氨基酸放射性標(biāo)記和高速離心)加快研究進(jìn)程。采用無細(xì)胞體系，扎梅奇尼克先后確定蛋白質(zhì)合成場所為核糖體和氨基酸活化形式氨基酰腺苷酸。1956年，扎梅奇尼克進(jìn)一步將放射性標(biāo)記氨基酸加入無細(xì)胞體系，通過離心處理獲得含有高放射性的部分，除含有活化氨基酸外還包含某種RNA。最初該RNA在pH值為5.2時出現(xiàn)沉淀，因此命名為pH5 RNA，后確定其參與活化氨基酸轉(zhuǎn)運工作，重新命名為轉(zhuǎn)運RNA(transfer RNA, tRNA)[4]。

1957年底，克里克提出遺傳信息流動中心法則，確定RNA在DNA將信息傳遞給蛋白質(zhì)過程中發(fā)揮中介作用，但錯誤認(rèn)為當(dāng)時唯一已知的rRNA就是蛋白質(zhì)合成模板。然而，法國巴斯德研究所雅各布(Fran?ois Jacob)的研究激發(fā)了克里克劍橋大學(xué)同事布雷內(nèi)(Sydney Brenner)的靈感，他敏銳意識到應(yīng)存在新型RNA。布雷內(nèi)首先將大腸桿菌在含重同位素(13C和15N)培養(yǎng)基中生長以保證所有物質(zhì)均被標(biāo)記，隨后用T2噬菌體感染大腸桿菌后迅速轉(zhuǎn)移到輕同位素(12C和14N)培養(yǎng)基(還含有32P)中培養(yǎng)一段時間，破碎細(xì)菌并進(jìn)行密度梯度離心，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有重同位素標(biāo)記的核糖體，表明噬菌體感染后沒有新rRNA生成(若有生成則必然有輕同位素標(biāo)記的核糖體)。對32P標(biāo)記的物質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn)其只存在于完整核糖體(參與蛋白質(zhì)合成)，而不存在于分離開的核糖體大小亞基(說明并非rRNA)。雜交實驗進(jìn)一步表明32P標(biāo)記的物質(zhì)不與大腸桿菌DNA互補，而是與噬菌體DNA互補，這些結(jié)果清晰表明新型RNA的存在[5]。1961年5月13日，布雷內(nèi)和沃森小組在Nature上發(fā)表背靠背文章，確定一種新型RNA的發(fā)現(xiàn)。與此同時，雅各布和莫諾(Jacques Monod)將這種RNA命名為信使RNA(messenger RNA, mRNA)。至此，參與蛋白質(zhì)合成的3種RNA均被發(fā)現(xiàn)(圖2)，它們在蛋白質(zhì)生物合成過程中如何發(fā)揮作用不久后也得到完美解決。

圖2 蛋白質(zhì)合成相關(guān)的3種RNA發(fā)現(xiàn)。(a)發(fā)現(xiàn)三種RNA的科學(xué)家(分別來自www.nasonline.org、www.findagrave.com和www.britannica.com)；(b)三種RNA在蛋白質(zhì)合成中的作用(bioninja網(wǎng)站)

早在1954年，理論物理學(xué)家伽莫夫(George Gamow)基于立體化學(xué)模型從邏輯分析上提出密碼子概念，即每3個堿基對應(yīng)一個氨基酸。1959年，克里克和布雷內(nèi)在理論上確立遺傳密碼由3個連續(xù)核苷酸構(gòu)成，即三聯(lián)體密碼，并于1961年用設(shè)計精美的實驗證實了這種觀點，確定3個核苷酸與氨基酸的具體對應(yīng)關(guān)系。

尼倫伯格(Marshall Warren Nirenberg)出生于美國紐約布魯克林，自小對生物學(xué)就有濃厚興趣，1957年獲得密歇根大學(xué)生物化學(xué)博士學(xué)位后進(jìn)入國立衛(wèi)生研究院開展博士后研究，于1960年成為研究院成員，并開始關(guān)注mRNA的信使作用。尼倫伯格首先構(gòu)思出多聚核苷酸策略來確定遺傳密碼，他獲得多聚U(即…UUUUU…)的RNA序列并讓其助手馬特伊(J. Heinrich Matthaei)負(fù)責(zé)完成，最終合成出只包含苯丙氨酸的多肽鏈，據(jù)此確定UUU對應(yīng)苯丙氨酸。采用相似策略，他們又確定AAA對應(yīng)賴氨酸、CCC對應(yīng)脯氨酸。1964年，尼倫伯格和萊德(Philip Leder)開發(fā)出三聯(lián)體-核糖體結(jié)合實驗，實驗原理為3個核苷酸在體外亦可與攜帶對應(yīng)氨基酸的tRNA結(jié)合，兩者隨后與核糖體形成復(fù)合物，從而無法穿越相應(yīng)孔徑的過濾膜。采用這一策略，他們將除終止密碼子外剩余密碼子(前后共61種編碼氨基酸的密碼子)完成解析[6]。

與此同時，威斯康星大學(xué)印度裔美國生物化學(xué)家霍拉納(Har Gobind Khorana)采用另一策略也完成了密碼子破譯?；衾{擁有高超的化學(xué)和酶學(xué)研究能力，因此成功合成一系列二核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)的多核苷酸，成為解析密碼子的基礎(chǔ)。如以UC重復(fù)多核苷酸為模板最終合成絲氨酸-亮氨酸交替出現(xiàn)的多肽鏈，結(jié)合其他信息最終確定UCU編碼絲氨酸，而CUC編碼亮氨酸[7]。霍拉納借助這一策略最終完成61種對應(yīng)氨基酸的密碼子和3種終止密碼子的解析。

霍利(Robert Holley)則將目標(biāo)轉(zhuǎn)向tRNA，經(jīng)過3年多的艱苦努力最終完成酵母丙氨酸-tRNA全序列(77個核苷酸)測序。這一工作解決了兩個基本科學(xué)問題：tRNA與氨基酸結(jié)合的問題(氨基酸臂)；tRNA攜帶氨基酸準(zhǔn)確運輸?shù)胶颂求w參與蛋白質(zhì)合成的問題(mRNA密碼子和tRNA反密碼子互補配對)。1968年，3位科學(xué)家因“對遺傳密碼及其在蛋白質(zhì)合成過程方面作用的解釋”而分享諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

2000年前后，拉馬克里斯南(Venkatraman Ramakrishnan)、施泰茨(Thomas Steitz)和尤納斯(Ada E. Yonath)解析了核糖體RNA在蛋白質(zhì)合成過程中的重要作用，并因此分享2009年諾貝爾化學(xué)獎。至此，3種RNA的生物功能和作用機(jī)制得到完美解決。

5 RNA的遺傳功能

1944年，艾弗里細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗證明DNA是遺傳因子。1952年，赫爾希(Alfred Hershey)和同事利用噬菌體侵染實驗證明DNA是遺傳物質(zhì)。RNA作為遺傳物質(zhì)的生物功能不久之后也得到證實。

煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)是一種植物病毒，主要由外部的衣殼蛋白和內(nèi)部的單鏈RNA構(gòu)成。1955年，德裔美國生物化學(xué)家弗蘭克爾-康拉特(Heinz Fraenkel-Conrat)將兩種成分拆分，并證明單獨RNA可以完成致病，而單獨衣殼蛋白則缺乏此功能。他還進(jìn)一步將兩種不同病毒的RNA和衣殼蛋白交叉重組形成“雜種”病毒，發(fā)現(xiàn)感染宿主后的表型與病毒RNA相關(guān)，與蛋白無關(guān)，這些結(jié)果清晰表明TMV的遺傳物質(zhì)是RNA[8]。幾乎同時，多名科學(xué)家特別是德國的施拉姆(Gerhard Schramm)也得出相同結(jié)論(圖3)。因此赫爾希、弗蘭克爾-康拉特和施拉姆分享了1958年的拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)獎。赫爾希還于1969年分享了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎，但另外兩位科學(xué)家未能分享，原因在于DNA作為遺傳物質(zhì)的普遍性，而RNA主要是作為病毒遺傳物質(zhì)。

圖3 RNA作為遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)(biocyclopedia網(wǎng)站)

將RNA作為遺傳物質(zhì)的病毒根據(jù)RNA的狀態(tài)和功能通?？梢苑譃?類，分別為單鏈-正鏈RNA病毒、單鏈-負(fù)鏈RNA病毒、雙鏈RNA病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。單鏈-正鏈RNA病毒是最大的一類RNA病毒，正鏈RNA(類似mRNA，可以直接作為翻譯的模板)為遺傳物質(zhì)，常見的如丙型肝炎病毒(HCV)、新冠肺炎病毒(SARS-CoV)和脊髓灰質(zhì)炎病毒等；單鏈-負(fù)鏈RNA病毒種類較少，負(fù)鏈RNA(需首先通過復(fù)制產(chǎn)生正鏈RNA)作為遺傳物質(zhì)，常見的如流感病毒等；雙鏈RNA病毒為宿主最廣泛的一類RNA病毒，著名的如輪狀病毒等；逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA通常需要先逆轉(zhuǎn)錄為DNA后才具有遺傳功能，常見的如人類免疫缺陷病毒(HIV)等。相比較于DNA病毒，RNA病毒具有較高的變異性，這一特征為有效疫苗研發(fā)和藥物研制帶來巨大的挑戰(zhàn)。

6 RNA的催化功能

早在1967年，沃斯(Carl Woese)、克里克和奧爾格爾(Leslie Orgel)就基于RNA具有類似蛋白質(zhì)可形成復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的特點，推測其具有催化功能，但缺乏直接的實驗支持。

1982年，科羅拉多大學(xué)切赫(Thomas Robert Cech)實驗室在研究四膜蟲rRNA中內(nèi)含子切除機(jī)制過程，并試圖純化負(fù)責(zé)完成該過程的酶時，意外發(fā)現(xiàn)其包含的內(nèi)含子可在不存在任何蛋白質(zhì)前提下完成自我切除。他們在嘗試進(jìn)一步尋找其他相關(guān)蛋白質(zhì)多次無果后，最終確定rRNA的內(nèi)含子序列具有催化磷酸二酯鍵斷裂和重新形成的作用。這是首次鑒定出RNA具有和蛋白質(zhì)類似的催化功能。

大約同一時間，耶魯大學(xué)奧特曼(Sidney Altman)小組正在研究tRNA分子加工過程。他們從大腸桿菌中分離得到一種RNA酶P，該酶包含蛋白質(zhì)和RNA(稱為M1 RNA)兩部分，負(fù)責(zé)將前體tRNA轉(zhuǎn)化為活性tRNA。最初認(rèn)為其中的蛋白質(zhì)組分發(fā)揮催化核心作用，M1 RNA發(fā)揮輔助作用，但隨后發(fā)現(xiàn)完全去除蛋白質(zhì)單獨保留M1 RNA時仍能在體外完成tRNA加工，從而為RNA作為催化劑提供了重要證據(jù)。克魯格(Kelly Kruger)將這種具有催化功能的RNA命名為核酶(ribozyme)[9]。1989年，切赫和奧特曼因發(fā)現(xiàn)“RNA催化功能”而分享諾貝爾化學(xué)獎。

RNA催化功能的發(fā)現(xiàn)深化了對生命起源的認(rèn)識。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為生物催化是蛋白質(zhì)的“專利”，DNA是遺傳信息載體，因為蛋白質(zhì)翻譯的信息由DNA指導(dǎo)，而DNA復(fù)制需要酶(蛋白質(zhì))催化，所以兩者“誰先誰后”難以確定(“先有雞還是先有蛋”悖論)。RNA既作遺傳物質(zhì)又具催化功能的新發(fā)現(xiàn)促使科學(xué)家對生命起源有了新的理解。吉爾伯特(Walter Gilbert)于1986年提出“RNA世界”學(xué)說，認(rèn)為生命之初首先產(chǎn)生RNA，隨著進(jìn)化RNA將催化功能給予蛋白質(zhì)，遺傳功能給予DNA，從而形成今天的世界，但RNA仍殘存了早期生物功能的痕跡。

7 調(diào)節(jié)RNA

今天多種調(diào)節(jié)RNA被發(fā)現(xiàn)并成為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的熱點和前沿，其實RNA調(diào)節(jié)功能的推測最早可追溯到20世紀(jì)50年代末。雅各布和莫諾提出乳糖操縱子模型時最初假定調(diào)節(jié)功能的可移動元件為RNA，但不久吉爾伯特證明是一種特殊蛋白質(zhì)，直到30多年后RNA的調(diào)節(jié)功能才被發(fā)現(xiàn)。

1979年，美國遺傳學(xué)家安布羅斯(Victor Ambros)進(jìn)入麻省理工學(xué)院著名分子生物學(xué)家霍維茨(H. Robert Horvitz，2002年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者)實驗室從事線蟲發(fā)育研究，特別關(guān)注影響發(fā)育時間的相關(guān)基因，因為這些基因突變造成線蟲發(fā)育提前或延遲。安布羅斯發(fā)現(xiàn)一種線蟲突變體lin-4，早期幼蟲階段細(xì)胞反復(fù)分裂，最終出現(xiàn)發(fā)育遲緩。不久，他又觀察到另一種突變體lin-14，線蟲直接跨越早期階段而出現(xiàn)早熟表型。兩種表型差異暗示lin-4和lin-14在蠕蟲發(fā)育過程發(fā)揮相反作用。1982年，魯夫昆(Gary Ruvkun)也加入霍維茨實驗室，開啟與安布羅斯關(guān)于線蟲發(fā)育的多年合作。他們首先發(fā)現(xiàn)lin-14基因編碼一種蛋白產(chǎn)物，該產(chǎn)物在線蟲發(fā)育早期大量積累，隨后出現(xiàn)急劇下降，如果不出現(xiàn)下降則會造成線蟲重復(fù)早期細(xì)胞分裂，而之所以會出現(xiàn)下降原因在于lin-4的產(chǎn)物具有抑制lin-14蛋白積累的功能，但這種調(diào)控機(jī)制不得而知。

20世紀(jì)90年代，魯夫昆揭示lin-14調(diào)控機(jī)制并發(fā)現(xiàn)其mRNA序列3'末端存在非翻譯區(qū)(3'untranslated region, 3'UTR)，該序列變異或缺失可影響mRNA翻譯效率和所產(chǎn)生蛋白質(zhì)的數(shù)量。與此同時安布羅斯也成功分離到lin-4基因，最初認(rèn)為其編碼蛋白質(zhì)，但隨后發(fā)現(xiàn)即使轉(zhuǎn)入700 bp的DNA片段也可恢復(fù)lin-4突變線蟲表型。這個DNA短于絕大多數(shù)編碼基因長度，并且缺乏編碼基因所擁有的開放閱讀框結(jié)構(gòu)，預(yù)示可能并非通過蛋白質(zhì)發(fā)揮功能。1992年春天，安布羅斯獲得與lin-4對應(yīng)的一個61個核苷酸構(gòu)成的RNA，隨后發(fā)現(xiàn)一個更小的22個核苷酸RNA。與魯夫昆進(jìn)行課題討論過程中他們發(fā)現(xiàn)lin-4的22個核苷酸恰好可以與lin-14的mRNA 3'UTR部分序列堿基配對，基于此他們推測正是二者的結(jié)合調(diào)節(jié)了lin-14 mRNA翻譯效率和蛋白質(zhì)含量(圖4)。lin-4成為第一個發(fā)現(xiàn)的微小RNA(microRNA,miRNA)，但隨后并未在其他生物中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，因此認(rèn)為是一種特殊現(xiàn)象，直到2000年前后一系列miRNA的發(fā)現(xiàn)才使大家意識到這是一種普遍的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制[10]。安布羅斯和魯夫昆因調(diào)節(jié)RNA的發(fā)現(xiàn)榮獲眾多科學(xué)大獎，包括2008年美國拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)獎。

圖4 miRNA發(fā)現(xiàn)及作用。(a)發(fā)現(xiàn)miRNA的兩位科學(xué)家；(b)miRNA調(diào)控機(jī)制(均來自laskerfoundation.org)

8 反義RNA

隨著對RNA功能研究的拓展和深入，RNA應(yīng)用價值也得到全面體現(xiàn)，多種基于RNA的治療也應(yīng)運而生，首先是反義RNA技術(shù)的發(fā)明。

20世紀(jì)60年代，發(fā)現(xiàn)tRNA的扎梅奇尼克開始將興趣轉(zhuǎn)向勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus,RSV)。70年代，隨著DNA測序技術(shù)發(fā)展和RSV基因組序列完成，扎梅奇尼克構(gòu)思出一種全新抗病毒策略，設(shè)計與RSV關(guān)鍵基因末端互補的13個堿基，稱反義RNA，亦稱反義寡聚核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, ASO)。體外實驗證明這種反義RNA可特異性與靶基因的mRNA形成雙鏈而抑制蛋白質(zhì)合成，細(xì)胞內(nèi)實驗則進(jìn)一步表明反義RNA抑制RSV復(fù)制和宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化，顯示出巨大的應(yīng)用潛力。扎梅奇尼克還通過在3'和5'末端進(jìn)行化學(xué)修飾來提高反義RNA生物活性和穩(wěn)定性。1978年，扎梅奇尼克發(fā)表反義RNA領(lǐng)域兩篇里程碑論文，標(biāo)志著反義RNA應(yīng)用的正式開啟[4]。

多家制藥公司建立反義RNA研發(fā)團(tuán)隊，期待能在新藥方面取得新突破。隨后研究者發(fā)現(xiàn)反義RNA策略存在眾多問題，臨床效果并不理想，最終多家公司放棄進(jìn)一步投入，但仍有一些小公司堅持研發(fā)和開展臨床試驗。2010年后反義RNA的應(yīng)用出現(xiàn)巨大轉(zhuǎn)機(jī)，幾款藥物先后被美國、歐洲和中國批準(zhǔn)應(yīng)用。2013年1月，米泊美生(Mipomersen)被美國FDA批準(zhǔn)用于治療家族性高膽固醇血癥(familial hypercholesterolemia,FH)；2016年9月，依特利生(Eteplirsen)被FDA批準(zhǔn)用于治療杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy, DMD)；2016年12月，諾西那生(Nusinersen)被FDA批準(zhǔn)用于治療脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy, SMA)。目前，還有幾十種藥物在臨床階段，其中20多種已進(jìn)入Ⅱ期或Ⅲ期臨床[11]。

ASO類藥物的一個重大缺點是價格昂貴。一方面是因為這些藥物主要應(yīng)用于單基因突變引起的罕見病治療，如前段時間引起爭議的天價醫(yī)藥費事件主角就是諾西那生；另一方面它們針對的是mRNA，并未涉及突變本質(zhì)DNA，從而意味著這種治療只能緩解而無法治愈，患者通常需要終身用藥。若想從根本上消除疾病達(dá)到一勞永逸的效果，則需要寄希望于其他策略(如基因編輯技術(shù))的發(fā)展和完善，在將來實現(xiàn)DNA修復(fù)才行。

9 RNA干擾

盡管反義RNA存在一定不足(抑制靶基因效果并不理想)，但在20世紀(jì)90年代仍然作為一種基因研究工具得到了廣泛應(yīng)用。

1998年，美國梅洛(Craig Mello)小組和菲爾(Andrew Fire)小組合作研究肌肉蛋白在線蟲發(fā)育過程中的作用。他們?yōu)榫€蟲單獨注射肌肉蛋白的mRNA或反義RNA，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)表型異常。若將兩種RNA(兩者可以互補)同時注射入線蟲體內(nèi)，線蟲出現(xiàn)抽搐，該表現(xiàn)與線蟲肌肉蛋白缺陷一致，暗示兩種RNA可實現(xiàn)線蟲肌肉蛋白敲除的效果。他們又對其他基因進(jìn)行互補雙鏈RNA注射實驗，獲得類似效果，線蟲出現(xiàn)相應(yīng)基因缺陷表型。經(jīng)過一系列簡單巧妙的實驗后，他們最終得出結(jié)論：雙鏈RNA可將靶基因?qū)崿F(xiàn)沉默，并且這種效應(yīng)具有特異性，稱為RNA干擾(RNA interfere, RNAi)[12]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，RNA干擾效果比反義RNA更為顯著，操作又比當(dāng)時的基因敲除技術(shù)簡便，因此迅速成為實驗室研究基因功能的強有力工具。梅洛和菲爾在RNA干擾技術(shù)發(fā)明8年后就分享了2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

RNA干擾盡管在科學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用，但在疾病治療方面卻面臨諸多挑戰(zhàn)，如脫靶效應(yīng)。早期臨床試驗的結(jié)果令人失望，低功效和高毒性使大部分藥物最終被否。RNA干擾策略最大挑戰(zhàn)在于器官靶向性，也就是把高濃度小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)藥物精準(zhǔn)運送到需要發(fā)揮作用的細(xì)胞內(nèi)才行。研究人員最初設(shè)計出脂質(zhì)納米顆粒(lipid nanoparticle, LNP)和N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine, GalNac)載體技術(shù)。但這些技術(shù)仍存在一定缺陷，那就是容易在肝臟聚焦，難以到達(dá)其他器官。然而至今仍有多款RNA干擾藥物被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用。2018年，第一種RNA干擾藥物帕蒂西蘭(Patisiran)批準(zhǔn)用于治療一種罕見遺傳病——遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性(hereditary transthyretin-mediated amyloidosis)。2019年，吉沃西蘭(Givosiran)被批準(zhǔn)用于治療罕見遺傳病急性肝卟啉癥(acute hepatic porphyria)。2020年，盧馬西蘭(Lumasiran)被批準(zhǔn)用于治療罕見遺傳病Ⅰ型原發(fā)性高草酸尿癥(primary hyperoxaluria type 1, PH1)。目前多款藥物尚在臨床試驗中，有望將來批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床治療[13]。

RNA干擾藥物和ASO藥物存在類似的問題。首先也是價格高昂，如服用盧馬西蘭，每個病人年花費近50萬美元，需終身用藥；其次適應(yīng)癥有限，絕大多數(shù)遺傳病和復(fù)雜性疾病都缺乏有效的RNA干擾藥物。

10 適配體

20世紀(jì)80年代，研究人員發(fā)現(xiàn)RNA可像其他有機(jī)分子一樣具有多樣結(jié)構(gòu)，并與蛋白質(zhì)、糖等物質(zhì)特異結(jié)合，促使科學(xué)界開始考慮從RNA分子中篩選出具有潛在藥物價值的化合物。1989年，戈爾德(Larry Gold)和圖爾克(Craig Tuerk)成功開發(fā)了指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技術(shù)，這是一種體外選擇或體外進(jìn)化方法，通過對合成的寡聚核苷酸鏈進(jìn)行多輪篩選，最終獲得理想結(jié)果。借助SELEX技術(shù)，戈爾德鑒定出可與T4噬菌體DNA聚合酶結(jié)合的單鏈RNA分子[14]。與此同時，紹斯塔克(Jack Szostak)和艾靈頓(Andy Ellington)設(shè)計出相似的程序，最終他們鑒定出可與染料小分子結(jié)合的多種RNA。特別的是，他們將這類RNA命名為適配體(aptamer)，“aptamer”由拉丁語“aptus”(意為“適合”)和希臘語“meros”(意為“部分”)組合而成(圖5)[15]。

圖5 RNA適配體的發(fā)現(xiàn)和作用。(a)發(fā)現(xiàn)適配體的兩位科學(xué)家(來自somalogic.com和www.hhmi.org)；(b)適配體作用機(jī)制[16]

適配體是一類可折疊為特定空間結(jié)構(gòu)的單鏈RNA，可與靶蛋白特異性結(jié)合。這種結(jié)合抑制蛋白質(zhì)間相互作用，因此通常作為拮抗劑發(fā)揮藥理效應(yīng)[16]。適配體在實際應(yīng)用中有眾多優(yōu)勢：第一，相比于蛋白質(zhì)它分子量較小，通常不會激發(fā)機(jī)體免疫；第二，作為多聚核苷酸鏈，可與其他分子形成復(fù)合物聯(lián)合應(yīng)用；第三，對于特異性識別細(xì)胞表面分子的適配體，還可參與藥物的靶向運輸。當(dāng)然適配體也存在諸多弊端，如價格昂貴、未修飾RNA體內(nèi)易降解、水溶性和分子量小的特點導(dǎo)致其易被腎臟排出、攜帶負(fù)電荷易結(jié)合血液蛋白而無法靶向細(xì)胞等。當(dāng)然，通過減少適配體核苷酸數(shù)量來降低成本、對糖基進(jìn)行修飾來減少降解、連接聚乙二醇等降低腎濾過率等方法可使問題得到適當(dāng)解決。

2004年12月，首個核酸適配體藥物哌加他尼(Pegaptanib)被FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于治療老年黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)。哌加他尼最初占有較大市場份額，但最終輸給了效果更理想的單克隆抗體藥物雷珠單抗(Lucentis)。目前，多款適配體藥物仍處于開發(fā)和臨床試驗階段，雖被業(yè)界寄予厚望，但效果如何尚需評判。

11 RNA指導(dǎo)的基因編輯

RNA早期應(yīng)用主要集中于靶向mRNA或蛋白質(zhì)，而在DNA基因編輯方面的應(yīng)用則極大拓展其應(yīng)用領(lǐng)域。20世紀(jì)90年代，研究人員在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)一種全新獲得性免疫系統(tǒng)，由成簇規(guī)律性間隔短回文重復(fù)(clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR)序列和相關(guān)蛋白(CRISPR-associated, Cas)構(gòu)成。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)一種特定Cas蛋白——Cas9為核酸內(nèi)切酶，而CRISPR序列可轉(zhuǎn)錄出一種特殊RNA——crRNA(CRISPR-related RNA)，crRNA與特定DNA序列互補配對，啟動Cas9對DNA的特異剪切。

法國微生物學(xué)家卡彭蒂耶(Emmanuelle Marie Charpentier)從小摯愛醫(yī)學(xué)并選擇生命科學(xué)作為終身職業(yè)，她于2009年6月開始研究CRISPRCas9系統(tǒng)?？ㄅ淼僖〗M鑒定出第二種RNA，即反式激活CRISPR來源RNA(trans-activating CRISPR-derived RNA, tracrRNA)，這種RNA可與剛轉(zhuǎn)錄出的CRISPR特定序列互補配對，隨后被一種RNA酶Ⅲ識別和剪切產(chǎn)生成熟crRNA[17]。至此參與細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)的3種元件(Cas9、crRNA和tracrRNA)全部鑒定完畢，下一步就是將這一天然系統(tǒng)改造為一種有效的基因編輯工具。

卡彭蒂耶與美國結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物化學(xué)家杜德娜(Jennifer Anne Doudna)達(dá)成合作協(xié)議，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)tracrRNA具有雙重作用，不僅參與crRNA加工和成熟，還與crRNA形成特殊二級結(jié)構(gòu)指導(dǎo)Cas9蛋白對靶DNA剪切。Cas9擁有兩個DNA核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，分別對兩條鏈進(jìn)行切割，并且其活性依賴tracrRNA與crRNA形成的二級結(jié)構(gòu)(發(fā)夾樣結(jié)構(gòu))?；谶@一特征，她們將兩條RNA鏈tracrRNA與crRNA合二為一形成單鏈引導(dǎo)RNA(single guide RNA, sgRNA)，sgRNA保留原來兩種RNA的二級結(jié)構(gòu)。體外實驗表明，sgRNA和Cas9可完成對靶DNA的精準(zhǔn)剪切[18]，一種RNA指導(dǎo)的簡單基因編輯系統(tǒng)從此誕生。后續(xù)研究一方面證明CRISPR-Cas9系統(tǒng)在細(xì)胞乃至完整生物體內(nèi)也可發(fā)揮活性，另一方面通過改進(jìn)實驗使有效率和精準(zhǔn)度均得到不同程度的提升。

RNA指導(dǎo)的CRISPR基因編輯系統(tǒng)在生命科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域均具有廣泛的應(yīng)用潛力。借助該系統(tǒng)可有效進(jìn)行動物模型構(gòu)建、快速疾病診斷、傳染性疾病治療等，特別是有望在遺傳病治療方面發(fā)揮更大價值。該系統(tǒng)可從根本上解決突變DNA，因此意義更為重大?？ㄅ淼僖投诺履纫惨虼朔窒砹?020年諾貝爾化學(xué)獎。

12 mRNA疫苗

mRNA盡管在1961年就已被發(fā)現(xiàn)，但直到20世紀(jì)90年代初才開始應(yīng)用。1990年，威斯康星大學(xué)醫(yī)學(xué)院沃爾夫(Jon Asher Wolff)等首次將體外轉(zhuǎn)錄(in vitro transcribed, IVT)的mRNA直接注射到小鼠肌肉并成功表達(dá)功能蛋白，開啟了mRNA的應(yīng)用[19]。其他研究隨后也證實這一策略的可行性，但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)mRNA應(yīng)用存在包括激發(fā)機(jī)體先天免疫、易降解和穩(wěn)定性差、體內(nèi)表達(dá)效率不高等諸多缺陷。

1990年，匈牙利裔美國生物化學(xué)家卡里科(Katalin Karikó)開始嘗試mRNA應(yīng)用，盡管困難重重但她仍堅信mRNA擁有美好未來。1997年，卡里科在賓夕法尼亞大學(xué)結(jié)識免疫學(xué)家魏斯曼(Drew Weissman)，并與其合作研究mRNA在疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用。經(jīng)過反復(fù)實驗，他們發(fā)現(xiàn)IVT的mRNA缺乏真核細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄后修飾過程。因此，通常被機(jī)體看作“異物”產(chǎn)生免疫排斥，此外IVT產(chǎn)生的mRNA還容易形成雙鏈結(jié)構(gòu)，引發(fā)免疫應(yīng)答并造成穩(wěn)定性下降。在獲悉IVT的mRNA這些特征的基礎(chǔ)上，卡里科和魏斯曼改進(jìn)體外mRNA制備方法[20]，采用核苷酸修飾策略(如將尿嘧啶修飾為假尿嘧啶等)，同時完善mRNA純化策略，成功解決了最初的免疫原性大和不穩(wěn)定性等難題，為實際應(yīng)用掃除眾多技術(shù)障礙(圖6)。

圖6 mRNA修飾技術(shù)發(fā)展和疫苗開發(fā)。(a)mRNA疫苗研究作出重要貢獻(xiàn)的科學(xué)家(圖片來自www.med.wisc.edu、www.pennmedicine.org和www.med.upenn.edu)；(b)mRNA疫苗的制備和使用(來自health feedback網(wǎng)站)

盡管如此，后續(xù)的流感和HIV的mRNA疫苗開發(fā)仍未取得明顯進(jìn)展[21]。2020年初，新冠肺炎(COVID-19)暴發(fā)給了mRNA疫苗一展身手的機(jī)會。摩德納公司(Moderna)和輝瑞公司經(jīng)過半年多研制和臨床測試最終成功開發(fā)出新冠肺炎mRNA疫苗并啟動緊急應(yīng)用，大范圍的疫苗接種為緩解全球新冠肺炎疫情作出重要貢獻(xiàn)。

新冠肺炎mRNA疫苗的成功為卡里科和魏斯曼帶來眾多榮譽，僅2021年他們就先后榮獲著名的路易莎·格羅斯·霍維茨獎(Louisa Gross Horwitz Prize)、奧爾巴尼醫(yī)學(xué)中心獎(Albany Medical Center Prize)、生命科學(xué)突破獎和拉斯克臨床應(yīng)用獎等，并有望將來分享諾貝爾化學(xué)獎。

13 結(jié)語

自1869年核素(可看作RNA起始)發(fā)現(xiàn)至今已有150多年，RNA研究發(fā)生了翻天覆地的變化(圖7)，無論基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)還是實際應(yīng)用都取得長足進(jìn)步。基礎(chǔ)方面拓展了對眾多生命過程的理解和認(rèn)識，尤其是調(diào)節(jié)RNA成為當(dāng)前生命科學(xué)研究的前沿和熱點；應(yīng)用方面更是進(jìn)展迅猛，基于寡聚核苷酸(oligonucleotide, ON)的眾多RNA產(chǎn)品已在臨床展示出巨大價值，有望在疾病診斷、治療和預(yù)防等方面發(fā)揮重要作用。

圖7 RNA研發(fā)過程簡史