牛乳和雙峰駝乳中乳脂球膜蛋白的差異分析

豆智華，楊迎春，楊 潔

（新疆大學生命科學與技術學院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830046）

駝乳富含多種維生素及礦物質，其蛋白質、脂類、氨基酸、微生物等物質的組成含量與其他乳類有顯著差異。與牛乳、羊乳等常見的反芻動物乳相比，駝乳具有低糖、低膽固醇、高礦物質（鉀、鈉、銅、鐵、鎂和鋅）、高維生素和高濃度胰島素的特性[1-3]。同時由于駝乳中含有豐富的α-乳白蛋白，不含β-乳球蛋白或含量很少，具有與母乳相似的蛋白組成，一般不會引發(fā)牛乳蛋白過敏癥[4]。隨著對駝乳營養(yǎng)價值及生物學功能研究，大眾對駝乳營養(yǎng)價值和保健功能的認知度越來越高，駝乳及其乳制品受到越來越多消費者的青睞，以前一直被忽視的一些低豐度蛋白質已經成為乳蛋白研究中的重要組成部分。

乳脂作為乳的重要組成部分，約占總乳成分的3%～5%，主要是以圓球/橢圓球形狀的脂肪球形式存在于乳中。乳脂肪球一般以球狀小液滴的方式存在于乳中，直徑約為0.2～15 μm，表面覆蓋著一層10～20 nm的薄膜，稱為乳脂肪球膜（milk fat globule membranes，MFGM）[5-6]。MFGM上的25%～70%的膜蛋白，稱為乳脂球膜蛋白（milk fat globule membrane proteins，MFGMP）[7]。MFGMP是膜結合的蛋白，主要是吸附在乳脂肪球的表面，包括蛋白質、糖蛋白、酶、中性脂質和極性脂類（如磷脂和鞘糖脂）等[8]。MFGMP作為MFGM的主要組成成分，以不對稱的形式分布在乳脂肪球中，占MFGM總量的25%～60%，僅占乳中蛋白質總量的1%～2%[9]。MFGMP雖然只占總乳蛋白的一小部分，但卻具有豐富的生物學功能，其營養(yǎng)價值和組成分布取決于不同物種的乳[10-11]。目前人乳、山羊乳、牛初乳與常乳、驢初乳與常乳等之間MFGMP的組成的差異已經被廣泛研究[12-17]，但雙峰駝乳的乳脂肪球膜蛋白組成、以及與牛乳的乳脂肪球模蛋白之間組成的差異尚未被探討。本實驗以雙峰駝乳和牛乳為研究對象，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）對2種乳的MFGMP蛋白進行組成分析，基于液相色譜-串聯(lián)質譜（liquid chromatograph-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術對雙峰駝乳的MFGMP進行鑒定，并通過基因本體（Gene Ontology，GO）功能注釋、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代謝通路分析等生物信息學方法對鑒定到的蛋白進行功能及作用的生物學途徑的探討，為駝乳和其乳制品在乳品行業(yè)的進一步應用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駝乳：選擇烏魯木齊紅雁池的哈族村自然放牧的10 峰雙峰駱駝；現(xiàn)場采集駝乳混勻后用低溫保存帶回實驗室，-20 ℃中保存?zhèn)溆谩ＥＨ椋翰勺赞r十二師五一農場飼養(yǎng)的奶牛，低溫保存帶回實驗室于-20 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

ImmobilineTMDryStrip pH3-10 NL、IPG Buffer美國GE公司；四甲基乙二胺、三(羥甲基)氨基甲烷、SDS、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、硫脲、溴酚藍、尿素、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、過硫酸銨、甘氨酸、低熔點瓊脂糖、無水乙醇、冰醋酸、蛋白質染色試劑 生工生物工程（上海）股份有限公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸 美國Sigma公司；乙腈、三氟乙酸 美國Thermo Scientific公司；Mass Standards Kit for Proteomics Analyzer 美國ABI公司；非預染蛋白Marker 美國Fermentas公司。

1.2 儀器與設備

Mini Protein II型垂直電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；DYY-10型三恒電泳儀 北京六一儀器廠；ALPHA 1-2 LD型真空冷凍干燥機 德國賀利氏公司；Alphalmager 2200型凝膠處理及分析系統(tǒng) 美國阿爾法公司；Scientz-IID型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Heal Force NW系列低溫離心機 美國Sigma公司；UV-1600型分光光度儀 美譜達儀器公司；BYJ0型純水裝置 美國摩爾公司；SE-600型電泳儀、ImageScannerIII型光密度掃描儀、LX300冷卻水循環(huán)系統(tǒng) 美國GE公司；4800 Plus型MALDI TOF/TOFTM Analyzer、Opti-TOF 123 mm×81 mm美國ABI公司；Q Exactive LC/MS二級質譜儀 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 MFGMP的提取

MFGMP提取方法1：取新鮮雙峰駝乳乳樣1 000 mL，在4 ℃、5 000 r/min離心15 min，上層為含MFGM的乳脂肪。將離心得到的乳脂肪置于50 mL離心管中，加入40 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），攪拌均勻后8 000 r/min離心15 min，除去上清液，重復清洗乳脂肪2次（目的將脂肪中殘留的酪蛋白膠束清洗干凈）后收集即為乳脂肪球。用超純水溶解乳脂肪球，37 ℃搖床孵育10 min（清洗殘留的PBS）后，在4 ℃、8 000 r/min離心15 min后將取上層乳脂肪，4 ℃過夜使其結晶化；棄去上清液，用超純水溶解沉淀，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩４稳?，往結晶化的乳脂肪球膜中加入超純水用磁珠攪拌器均質20 min后45 ℃水浴30 min以促進乳脂肪熔化，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，所得沉淀即為MFGMP。

MFGMP提取方法2：取新鮮雙峰駝乳乳樣1 000 mL，在4 ℃、5 000 r/min離心15 min，上層為含MFGM的乳脂肪。將離心得到的乳脂肪置于50 mL離心管中，加入40 mL PBS，攪拌均勻后在4 ℃、8 000 r/min離心15 min，除去上清液，重復清洗乳脂肪3次（目的將脂肪中殘留的酪蛋白膠束清洗干凈）后收集即為乳脂肪球。用超純水溶解乳脂肪球，37 ℃搖床孵育10 min（清洗殘留的PBS）后，8 000 r/min離心15 min后將取上層乳脂肪，4 ℃過夜使其結晶化；棄去上清液，用超純水溶解沉淀，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。次日，再往MFGM組分中加入超純水用超聲波細胞破碎機超聲（超聲2 s，間隔8 s，共20 min），使MFGM均質。將均質后MFGM置于45 ℃搖床中孵育30 min促進乳脂肪熔化后在4 ℃、10 000 r/min離心15 min后，所得沉淀即為MFGMP。

在實驗室用同樣的方法來提取牛乳的MFGMP。將方法1和方法2中所得到的MFGMP用分別超純水溶解，并用2D蛋白定量試劑盒檢測MFGMP的濃度。所得MFGMP樣品于-80 ℃中預凍后用冷凍干燥機凍干保存，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 SDS-PAGE

電泳前樣品的制備：準確稱取3 mg的MFGMP凍干粉，分別用500 μL超純水溶解混勻。將溶解的樣品（40 μL）與SDS-PAGE樣品緩沖液（10 μL）混合，沸水浴10 min后，12 000 r/min離心5 min。

配制8%、10%、12%、13%、15%的分離膠及5%的濃縮膠，每孔上樣10 μL。采用恒流電泳，當溴酚藍染料前沿遷移至凝膠底部約0.5 cm時，停止電泳，凝膠染色后脫色至無背景色、顯現(xiàn)清晰的條帶。采用Alphalmager 2200系統(tǒng)掃描凝膠，凝膠蛋白條帶相對分子質量和相對含量的信息利用Gel-PRO ANALYZER軟件進行凝膠定量分析，P＜0.05，差異顯著。采用GraphPad Prism 8.0軟件進行電泳圖譜差異性分析。所有的樣品均重復實驗3次。蛋白條帶的相對分子質量和相對含量用表示。

1.3.3 2-DE

1.3.3.1 第一向等電點聚焦

采用預制IPG干膠條（pH 3～10 NL，13 cm），蛋白上樣量為60 μg。將蛋白樣品與水化液相互混勻，加入IPG水化盤，將IPG膠條完全放入樣品溶液后，20 ℃左右過夜水化（至少20 h）后進行等電聚焦電泳，設置膠條等電點聚焦（IPGphor）儀器的運行依據(jù)。等電點聚焦參數(shù)見表1。

表1 等電聚焦電泳參數(shù)Table 1 Operating parameters of isoelectric focusing electrophoresis

1.3.3.2 第二向SDS-PAGE分析

等電點聚焦結束后，將膠條分別放在10 mL的平衡液I（含100 mg DTT）和10 mL的平衡液II中（含250 mg碘乙酰胺）分別平衡15 min。平衡結束后，用電極緩沖液潤洗1～2 s，進行SDS-PAGE。當溴酚藍遷移至膠底部0.5 cm處停止電泳，然后進行凝膠染色，每個蛋白樣品至少重復3次，用Image MasterTM2D Platinum進行2-DE圖譜的分析。

1.3.4 LC-MS/MS測定

樣品處理：取凍干后100 μg的MFGMP的樣品加入到30.93 μL尿素（8 mol/L含0.1% SDS）、41 μL超純水（含0.1% SDS）、9 μL三乙基碳酸氫銨（500 mmol/L）中，還原后加入胰酶，37 ℃振蕩酶切過夜。樣品分級：用強陽離子交換色譜進行樣品分級（A液：5 mmol/L KH2PO4pH 2.55、20%乙腈、H3PO4，B液：5 mmol/L KH2PO4pH 2.75、20%乙腈、600 mmol/L KCl、H3PO4），樣品用A液稀釋5 倍，調pH值到2.5，離心取后上清上樣，洗脫。收集上樣流出液進行質譜檢測。質譜條件：液相梯度洗脫（A液：99.9%水、0.1%甲酸，B液：99.9%乙腈、0.1%甲酸）。檢測質譜全掃描范圍m/z350～1 800。全掃描中選擇離子強度TOP20的母離子進行二級質譜鑒定。母離子使用HCD方法碎裂后進行二級質譜序列測定。

2 結果與分析

2.1 雙峰駝乳MFGMP提取方法的選擇

選取2種方法提取雙峰駝乳中MFGMP，結果如圖1所示，2種方法（泳道1、2、3和泳道6、7、8、9）所提取的MFGMP在SDS-PAGE圖譜中的蛋白條帶分布有所差異。提取MFGMP方法中PBS的作用是清洗殘留在MFGM上的酪蛋白膠束，泳道5為PBS清洗后離心得到的沉淀，它在電泳圖譜中的高豐度蛋白條帶集中在30～35 kDa之間，這與酪蛋白的分子質量吻合，因此可進一步判斷PBS清洗后的沉淀主要為酪蛋白。方法1所分離的雙峰駝乳MFGMP與PBS清洗后沉淀中的高豐度酪蛋白，說明在提取過程中PBS后未將MFGM上吸附的酪蛋白清洗干凈。泳道6～9為優(yōu)化后的方法2所分離的雙峰駝乳MFGMP電泳圖，幾乎沒有酪蛋白及其他雜蛋白影響。值得注意的是，方法2所分離的雙峰駝乳MFGMP的電泳圖與文獻報道的綿羊MFGMP的SDS-PAGE圖譜的蛋白條帶分布大致相同，雖然部分蛋白組分還是有所差異，這可能是由于乳的來源不同造成的。由SDS-PAGE結果除了可以看出不同方法在提取雙峰駝乳MFGMP的差異，還可以得出在提取過程中用超純水洗后離心沉淀與過夜結晶溶解脂肪后離心沉淀的蛋白質條帶分布基本相同，推斷方法2用超純水清洗過程中不僅可以排除雜蛋白的干擾外，而且不至于損失過多MFGMP，得到的MFGMP純度較高，因此后續(xù)的實驗中都采用方法2提取雙峰駝乳的MFGMP。

圖1 不同提取方法雙峰駝乳MFGMP的SDS-PAGE圖譜Fig. 1 SDS-PAGE profile of MFGMP from bactrian camel milk extracted by different extraction methods

2.2 雙峰駝乳和牛乳中MFGMP的SDS-PAGE差異

同一批次提取的牛乳及雙峰駝乳MFGMP的SDSPAGE差異見圖2，同一批次提取的雙峰駝乳MFGMP（泳道2、3、4）中高豐度蛋白質電泳圖譜表現(xiàn)為一致性，蛋白條帶分布基本相同；而不同批次提取的雙峰駝乳MFGMP（泳道5、6與2、3、4）中高豐度蛋白的圖譜較為一致，但是部分低豐度的蛋白存在差異，這可能與提取MFGMP的乳脂肪原料、乳脂肪球過夜結晶后的均質化和溶解脂肪的溫度、時間有關。結果表明：牛乳和雙峰駝乳MFGMP的電泳圖譜具有一定的差異，在60～70 kDa分子質量范圍，牛乳與雙峰駝乳MFGMP的高豐度蛋白（依據(jù)分子質量推測為嗜乳脂蛋白（butyrophilin，BTN）分子質量有明顯區(qū)別。與雙峰駝乳相比，牛乳MFGMP中200 kDa以上和40 kDa以下的蛋白條含量較低或缺失，30 kDa左右（推測為GTP-結合蛋白）蛋白條帶幾乎不存在。本實驗中雙峰駝乳、牛乳MFGMP與文獻中的牛乳、山羊乳MFGMP中的高豐度蛋白條帶分布基本一致[13,16]，MFGMP中的高豐度蛋白分別為黏液素1（mucins 1，MUC1）、黃嘌呤氧化還原酶/脫氫酶（xanthine oxidoreductase，XO/XDH）、黏液素15（mucins 15，PAS III）、CD36（或PAS IV）、BTN、乳凝集素（乳脂肪球-EGF因子8（milk fat globule-EGF factor VIII，MFG-E8）或PAS6/7）、GTP結合蛋白（GTP-binding protein）及脂肪酸結合蛋白（fatty acidbinding protein，F(xiàn)ABP）等。乳的來源不同，蛋白質的分子質量略有不同，因此來源于駝乳、牛乳、山羊乳的MFGMP中蛋白質的分子質量都略有差異。

圖2 牛乳和雙峰駝乳中MFGMP的SDS-PAGE圖譜Fig. 2 SDS-PAGE profile of MFGMP from bovine milk and bactrian camel milk

選取用不同濃度的分離膠分離提取的牛乳和雙峰駝乳MFGMP，并利用Gel-PRO ANALYZER軟件同時分析不同濃度分離膠的電泳圖譜，計算各蛋白質組分的相對含量，并通過蛋白標準分子質量Marker的遷移率確定蛋白條帶的相對分子質量，結果見圖3和表2。根據(jù)文獻中報道的MFGMP相關信息推測MFGMP組分F1為MUC1，F(xiàn)3為XO/XDH，F(xiàn)5為PAS III，F(xiàn)6/F7為CD36，F(xiàn)9為BTN，F(xiàn)11/F12為乳凝集素（MFG-E8或PAS6/7），F(xiàn)14為GTP-binding protein，F(xiàn)19為FABP。

圖3 牛乳和雙峰駝乳中MFGMP的不同濃度分離膠的SDS-PAGEFig. 3 SDS-PAGE profile of different concentrations of MFGMP isolates from bovine and Bactrian camel milk

表2 雙峰駝乳和牛乳中MFGMP的組分信息Table 2 Information on the components of MFGMP in bovine milk and bactrian camel milk

2.3 雙峰駝乳和牛乳中MFGMP的2-DE圖譜差異

相同條件下，利用2-DE技術對從牛乳和雙峰駝乳中提取的MFGMP進行分離分析，為提高實驗的準確性和可靠性，本研究對每個樣品至少重復3次。牛乳MFGMP中可檢測蛋白質斑點數(shù)為1 304、1 235、1 358，雙峰駝乳MFGMP中可檢測蛋白質斑點數(shù)分別為925、870、1 003（表3），表明所得2-DE圖譜具有較好的重復性，可以滿足分離分析的要求。由于MFGMP分別來自于駝、牛兩個不同的物種，MFGMP組分相對分子質量和等電點差異較大，所以無法匹配共同斑點而進行蛋白質組學差異性分析。如圖4所示，雙峰駝乳和牛乳的MFGMP的2-DE圖譜中存在3個相似的蛋白斑點區(qū)域（如圖4A和圖4D中紅色標記區(qū)域），同時，雙峰駝乳和牛乳的MFGMP的2-DE圖譜中存在兩個顯著差異的蛋白斑點區(qū)域（如圖4A和圖4D中藍色標記區(qū)域）。參照文獻中牛乳MFGMP[18]和綿羊乳MFGMP[19]的2-DE圖譜，根據(jù)文獻中所報道的蛋白斑點信息，推測圖與4A、D中紅色標記區(qū)域中相同的蛋白斑點，從低等電點到高等電點分別是BTN、MFG-E8、脂肪分化相關蛋白（ADRP或PLIN2）。

圖4 牛乳和雙峰駝乳中MFGMP的2-DE凝膠圖譜Fig. 4 2-DE gel profiles of MFGMP from bovine milk and bactrian camel milk

表3 牛乳和雙峰駝乳MFGMP的2-DE凝膠斑點數(shù)Table 3 Number of 2-DE spots for MFGMP from bovine milk and bactrian camel milk

2.4 雙峰駝乳MFGMP的質譜鑒定

為了進一步確認雙峰駝乳的MFGMP具體蛋白組分，從NCBI下載蛋白質組數(shù)據(jù)庫用于質譜數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)庫為txid419612-Camelus-ferus-refseq-23637s.fast，23637entries，用Proteome Discoverer軟件進行搜庫分析。與數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，二級質譜成功鑒定出雙峰駝乳的MFGMP中有2 086個蛋白組分；其中120個蛋白組分得分大于100；有14個蛋白組分相對豐度大于1%（表4），其中有4個為酪蛋白組分，可能是在MFGMP分離過程中酪蛋白未清洗完全。質譜結果表明，雙峰駝乳中高豐度MFGMP組分依次為：BTN、XO/XDH、乳凝集素（MFG-E8或PAS6/7）、脂肪分化相關蛋白（ADRP或PLIN2）等。

表4 雙峰駝乳MFGMP的二級質譜鑒定結果（部分高豐度蛋白）Table 4 Secondary mass spectrometric identification of some highabundance MFGMP from bactrian camel milk

2.5 雙峰駝乳MFGMP的GO注釋和KEGG通路代謝路徑分析

為進一步了解雙峰駝乳的MFGMP的功能，將MFGMP用DAVID在線分析進行蛋白質的GO注釋和KEGG代謝路徑分析。如圖5A～C所示，分別對其生物學過程、細胞成分以及分子功能進行分析和歸類。雙峰駝乳的MFGMP的主要參與很多生物途徑，其中有16.59%的蛋白參與翻譯和翻譯的起始，10.25%蛋白參與氧化還原過程，8.3%的蛋白參與細胞內蛋白質轉運，7.81%蛋白參與蛋白質折疊，其余的蛋白參與了細胞間黏附、ER相關的泛素依賴性蛋白質分解代謝過程、蛋白質轉運、基因表達的負調控、ER到高爾基體囊泡介導的轉運、細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、蛋白質加工響應線粒體去極化的線粒體自噬等。雙峰駝乳的MFGMP，13.36%為膜、11.54%為胞質溶膠、9.54%為線粒體、6.11%為內質網膜以及細胞內核糖核蛋白復合物、蛋白酶體輔助復合物、高爾基體；雙峰駝乳的MFGMP的分子功能主要是結合活性和分子催化，其中結合活性包括poly(A) RNA結合、mRNA結合、翻譯起始因子活性、蛋白質結合、鈣離子結合、糖蛋白結合、受體結合、肝素結合、泛素蛋白連接酶結合等多個分子功能。

采用DAVID分析對雙峰駝乳的MFGMP進行KEGG代謝路徑分析，結果有399種蛋白有代謝路徑信息，共有37個代謝路徑，其中前20個代謝路徑見圖5D，分別核糖體、蛋白體、內質網中的蛋白質加工、內吞作用氧化磷酸化、脂肪酸代謝、非酒精性脂肪肝、軍團病、不飽和脂肪酸的生物合成、抗生素的生物合成、PPAR信號傳導途徑、碳代謝等代謝途徑。

圖5 駝乳MFGMP的GO注釋和KEGG代謝路徑分析圖Fig. 5 GO annotation and KEGG metabolic pathway analysis of MFGMP from bactrian camel milk

3 討 論

本研究以牛乳和雙峰駝乳為原料經優(yōu)化提取方法后，利用SDS-PAGE和2-DE技術對雙峰駝乳與牛乳中MFGMP進行分離分析。研究結果表明，雙峰駝乳、牛乳中的MFGMP中BTN的相對含量最高，分別為（22.55±1.52）%、（24.05±1.94）%，其次是XO/XDH，分別為（15.12±0.71）%、（18.54±1.36）%，這與Ye Aiqian等[20]報道的牛乳MFGMP中含量最高的為BTN，其次為XO的結果一致，但是相對含量有所差異，可能是乳的來源不同造成。牛乳MFGMP中乳凝集素（MFG-E8或PAS6/7）糖基化程度不同使它們的分子質量不同，乳凝集素是繼BTN之后最豐富的MFGM糖蛋白，分子質量范圍為43～59 kDa[21]。山羊乳在50～55 kDa范圍表現(xiàn)為2個蛋白條帶，占MFGMP的7.9%，變異系數(shù)低[14]。本實驗結果顯示，雙峰駝乳、牛乳MFGMP中F11/F12兩個蛋白組分與乳凝集素相對分子質量一致，分別為47.51±0.24/43.76±0.27，48.31±0.15/43.88±0.73，乳凝集素在雙峰駝乳、牛乳MFGMP中相對含量僅次于XO/XDH，分別為11%、17%左右。當乳冷卻和攪動時，MUC1容易從脂肪球上脫落到脫脂乳中。本研究所分離的雙峰駝乳MFGMP樣品在大于200 kDa范圍存在2個蛋白條帶，可以說明MUC1在雙峰駝乳中表現(xiàn)為多態(tài)性，這與文獻報道的MUC1在山羊乳中表現(xiàn)出蛋白多態(tài)性的結果一致[22-24]。

研究報道，牛乳中CD36在MFGMP中占5%，分子質量在75～88 kDa[21]。Zamora等[14]的研究表明，山羊乳MFGMP中CD36的分子質量約為83 kDa。在本實驗中雙峰駝乳和牛乳MFGMP中都存在88、75 kDa左右的蛋白條帶，推測這2個蛋白條帶可能為CD36，相對含量也為5%左右，與文獻報道結果一致。PAS III是一種糖蛋白特征很弱的MUC15，它在SDS-PAGE凝膠上呈現(xiàn)出相對分子質量為95～100 kDa的彌漫擴散條帶，這種蛋白條帶的多分散特點可能是由于大量的可變數(shù)值的碳水化合物引起的。本實驗的凝膠電泳圖譜分析結果顯示雙峰駝乳（100.22±0.45）和牛乳（102.51±1.47）MFGMP中均存在與PAS III相對分子質量相應的蛋白條帶，相對含量分別為（2.43±0.30）%、（2.51±0.28）%。Sun Ye等[13]發(fā)現(xiàn)在20～44 kDa范圍至少有10～12個條帶，17～18 kDa范圍內有許多彌漫的蛋白條帶，其中有些蛋白條帶被鑒定為GTP-結合蛋白。雙峰駝乳MFGMP在20～44 kDa范圍內存在一系列彌漫的蛋白條帶，可確認為GTP-結合蛋白，但是牛乳MFGMP在這個分子質量范圍內蛋白組分缺失。FABP是一個分子質量為14 kDa的多肽，在牛乳MFGMP中占2%～3%，在山羊乳中占總MFGMP的3.7%。本研究中雙峰駝乳、牛乳的MFGMP中分別存在13.96±0.02、13.65±0.42的蛋白條帶，根據(jù)相對分子質量推測該條帶FABP。

蘆晶等[25]使用過濾器輔助樣品前處理法測定在牛乳MFGMP檢測共出169種蛋白質。楊梅等[12]將牛乳MFGMP酶解后，用電噴霧離子源質譜最終鑒定出488種蛋白質且大多數(shù)的蛋白為糖基化蛋白。景萌娜等[15]運用納升高效液相色譜與靜電場軌道阱組合式高分辨質譜技術在牛乳的MFGMP鑒定出具有可靠定量信息的蛋白質有593種。本實驗中質譜成功鑒定出雙峰駝乳的MFGMP中有2 086個蛋白組分，雙峰駝乳中高豐度MFGMP組分依次為BTN、XO/XDH、乳凝集素（MFG-E8或PAS6/7）、脂肪分化相關蛋白（ADRP或PLIN2）等。與Sabha等[10]和Han Bin等[26]在單峰駝駝乳和雙峰駝乳中鑒定MFGM蛋白主要為脂肪酸合成酶、XO/XDH、BTN、乳凝集素（MFG-E8或PAS6/7）和脂肪分化相關蛋白（ADPH）結果一致。Li Weixuan等[17]和Cebo等[27]利用質譜的方法鑒定出馬乳和驢乳中主要MFGMP為XO/XDH、BTN，乳凝集素（MFG-E8或PAS6/7）和脂肪分化相關蛋白（ADPH）。此外，利用David生物信息學資源將雙峰駝乳的MFGMP進行GO注釋和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要是細胞膜、線粒體、內質網膜等組分，參與的生物途徑有翻譯和翻譯的起始、氧化還原過程、細胞內蛋白質轉運、蛋白質折疊、細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)等，具有結合活性和分子催化等分子功能。

研究表明MFGMP與多發(fā)性硬化癥、自閉癥、冠心病等疾病之間具有相關性[28]。近幾年駝乳中蛋白以及MFGMP因其特殊的營養(yǎng)價值和功能特性越來越受到食品行業(yè)廣泛的關注[29-30]。MFGMP是由種類繁多的功能性蛋白質所組成，很多蛋白質能夠在極微量的條件下起到至關重要的生理作用[31]。MFGMP在組成及功能上的研究，能夠促進深入地了解乳蛋白，并為以乳為原料的產品添加功能性蛋白提供參考。因此，對雙峰駝乳MFGMP在蛋白質組成及功能上以及與牛乳MFGMP對比尋找差異蛋白進行深入研究，不但能夠增加雙峰駝乳的利用率及利用價值，還能夠為以雙峰駝乳為原料的產品添加功能性蛋白提供理論依據(jù)。本實驗的樣本量小，尚需加大樣本量和樣品量，建立簡單有效的區(qū)分雙峰駝乳與其他來源乳（牛乳等）中蛋白質的方法，為乳制品的鑒別和質量監(jiān)控提供理論依據(jù)。